miRNA therapeutics ont un potentiel important dans la régulation de la progression du cancer. Démontré ici sont des approches analytiques utilisées pour l’identification de l’activité d’un traitement de miRNA combinatoire pour stopper le cycle cellulaire et l’angiogénèse.
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Article de méthode
Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse
Dans cet article
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Résumé
Résumé
Cancer du poumon (LC) est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde entier. Semblable à d’autres cellules cancéreuses, une caractéristique fondamentale des cellules LC est non réglementée de la prolifération et la division cellulaire. Inhibition de la prolifération en stoppant la progression du cycle cellulaire s’est avérée être une approche prometteuse pour le traitement du cancer, y compris les LC.
miRNA therapeutics ont émergé en tant que régulateurs des gènes post-transcriptionnels important et sont de plus en plus étudiées pour une utilisation dans le traitement du cancer. Dans des travaux récents, nous avons utilisé deux miARN, miR-143 et miR-506, pour réguler la progression du cycle cellulaire. Cellules A549 non-small cell lung cancer (NSCLC) ont été transfectées, modifications d’expression génique ont été analysées et activité apoptotique grâce au traitement a été finalement analysée. Diminution de l’expression des kinases cycline-dépendantes (CDKs) ont été détectés (CDK1, CDK4 et CDK6), et le cycle cellulaire s’arrêta aux transitions de phase G1/S et G2/M. Analyse de la voie a indiqué activité anti-angiogénique potentielle du traitement, qui dote l’approche de l’activité aux multiples facettes. Ici décrites sont les méthodes utilisées pour identifier l’activité miRNA concernant l’inhibition du cycle cellulaire, l’induction de l’apoptose et les effets du traitement sur les cellules endothéliales par l’inhibition de l’angiogenèse. Il est à espérer que les méthodes présentées ici soutiendra les recherches futures sur miRNA thérapeutique et l’activité correspondante et que les données représentatives guidera d’autres chercheurs au cours des analyses expérimentales.
Introduction
Le cycle cellulaire est une combinaison de plusieurs événements réglementaires qui autorise la duplication de l’ADN et cellules de prolifération à travers le processus mitotique1. Kinases cycline-dépendantes (CDKs) réglementent et promouvoir le cycle cellulaire2. Parmi eux, le CDK mitotique (CDK1) et interphase cdk2 (CDK2, CDK4 et CDK6) ont un rôle essentiel dans le cycle cellulaire progression3. Protéine du rétinoblastome (Rb) est phosphorylé par la CDK4/CDK6 complexe pour permettre la progression de cycle cellulaire4et CDK1 activation est essentielle pour la division cell....
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Protocole
1. transfection miR-143 et miR-506
Attention : Utilisez des gants en latex, lunettes de protection et un manteau de laboratoire tout en exécutant les expériences décrites. Au besoin, utiliser l’armoire de sécurité biologique avec le ventilateur d’armoire, sans bloquer les voies respiratoires ou de perturber le flux d’air laminaire. Toujours défini la vitre protectrice à la hauteur appropriée, telle que décrite par le fabricant.
- Cellules A549 NSCLC graines dans une assiette bien T25 cm2 flacon/6/96, en milieu DMEM/F12K additionné de 10 % SVF et 1 % la pénicilline-streptomycine (milieux de culture) dans une hotte de cultu....
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Résultats
Analyse de l’expression génique à l’aide de la RT-qPCR et gel d’électrophorèse
Analyse de l’expression différentielle des gènes à l’aide de la RT-qPCR a démontré une diminution significative des gènes ciblés CDK1, CDK4 et CDK6. CDK1 et CDK4/6 ont été montré pour être un instrument pour le G2/M et les transitions G1/S, respectivement. L’analyse effectuée a permis de comparaison directe entre miRs individuels et a.......
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Discussion
miARN peut fonctionner comme des thérapies ciblées pour le traitement du cancer, reconnaissant le dérèglement des niveaux d’expression dans malades vs les tissus normaux. Cette étude visait à déterminer les miARN qui potentiellement stopper la progression du cycle cellulaire au cours de plusieurs étapes. Il a été identifié que miR-143 et miR-506 de faire cesser le cycle cellulaire des cellules cancéreuses et les protocoles présentés visant à comprendre l’activité de ce traitement combinatoire miRNA.
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Déclarations de divulgation
Les auteurs aimerait remercier John Caskey à Louisiana State University pour son aide sur l’analyse de la voie des données de séquençage de l’ARN et l’Université du Texas Southwestern Medical Center, McDermott prochaine génération séquençage central pour effectuer l’analyse de données et de séquençage des RNA. Cette recherche a été financée par le collège de pharmacie, Université de la Louisiane Monroe fonds de démarrage et les National Institutes of Health (NIH) par le biais de l’Institut National de générale Medical Science subventions 5 P20 GM103424-15, 3 GM103424 de P20-15 s 1.
Remerciements
Aucun conflit d’intérêts ne sont déclarés.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| -80 ° ; C Congélateur | VWR | VWR40086A | |
| 96 puits | plaque CELLTREAT Scientific ; | 50-607-511 | |
| Plaques à micropuits à 96 puits ; ; | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Cellules cancéreuses du poumon non à petites cellules | ATCC | ATCC ; CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Bioanalyseur Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2938c | |
| Silencieux Ambion Contrôle négatif n° 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Solution antibiotique-antimycosique (100x) | Gibco | 15240-062 ; ; | |
| Kit de dosage de réseau d’anticorps, 2 réactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Microscope à champ clair ; ; | Microscopique ; | IV-900 | |
| Microscope à champ clair ; ; | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 lames | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Étapes 5.14 ; 6.13 : Utilisé pour calculer la distribution de la population en fonction de la phase du cycle cellulaire et pour calculer la distribution de la population pour l’analyse de apoptose ; | |
| Système temps réel CFX96 | BioRad | CFX96 | |
| Système d’imagerie tactile Chemidoc Système d’imagerie | BioRad | Chemidoc | |
| Incubateur de CO2 | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Facteur de croissance réduit Matrice de membrane basale | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Appareil photo numérique | AmScope ; | FMA050 | |
| DMEM 4,5 g/L de glucose, sans pyruvate de sodium, avec L-glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Éthanol, absolu (200 proof), moléculaire Niveau de biologie, ; | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Bromure d’éthidium | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Mélange de nutriments (Kaighn’s Mod.) avec L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Sérum de veau fœtal - Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Sérum bovin (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes avec bouchons à pression standard | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II Water Jacket Incubateur CO2 Solution d’héparine | Thermo Scientific | ||
| (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Système d’électrophorèse horixontal | Benchtop système de laboratoire | BT102 | |
| has-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| has-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire recombinant humain (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 ; ; | |
| Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) | Donneurs individuels | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results : Used for bioinformatics Pathway | |
| Analysis Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free | Distilled Water Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 ; | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Teinture de chargement 10X | ward’s science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (avec Earle&prime ; sels de sodium, L-glutamine et bicarbonate de sodium) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Appareil photo numérique | AmScope ; | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Étape 5.15 : Logiciel alternatif pour l’analyse des distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Pénicilline-streptomycine 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Iodure de propidium | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Scanner de microréseaux | Perkin elmer | ASCNPHRG. Nous avons utilisé la longueur d’onde du laser d’excitation à 543 nm. | |
| q Couvercle adhésif optique PCR | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Kits d’ARN rapides | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A à partir de pancréas bovin | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Étape 7.33 : Logiciel | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Tubes à centrifuger 15ml | VWR | 470224-998 | |
| Tubes à centrifuger SpectraTube 50ml | VWR | 470225-004 | |
| Tampon TBS, 20x liquide | VWR | 10791-796 | |
| Centrifugeuse matchine à température contrôlée | Thermo Scientific | ST16R | |
| Micro-centrifugeuse à température contrôlée matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Flacons traités pour la culture cellulaire | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96 puits à jupe complète | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso kit de synthèse d’ADNc (100 passages) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Échelle à ADN ultra basse gamme | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR réfrigérateur de laboratoire à porte pleine standard | VWR |
Références
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M.
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis
