कोशिका चक्र और वाहिकजनन को विनियमित करने के लिए Combinatorial मिर्ना उपचार का विश्लेषण
Summary
मिरना चिकित्सा विज्ञान कैंसर प्रगति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण क्षमता है । यहां प्रदर्शित विश्लेषणात्मक सेल चक्र और angiogenesis रोकने में एक मिश्रित मिरना उपचार की गतिविधि की पहचान के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण हैं ।
Abstract
फेफड़ों का कैंसर (LC) दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौतों का प्रमुख कारण है । अन्य कैंसर कोशिकाओं के समान, नियंत्रण रेखा कोशिकाओं की एक बुनियादी विशेषता अनियमित प्रसार और कोशिका विभाजन है. सेल चक्र प्रगति रोक द्वारा प्रसार के निषेध को कैंसर के इलाज के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण, नियंत्रण रेखा सहित दिखाया गया है ।
miRNA चिकित्सा विज्ञान के रूप में महत्वपूर्ण पोस्ट-transअपंग जीन नियामकों उभरा है और तेजी से कैंसर के इलाज में उपयोग के लिए अध्ययन किया जा रहा है । हाल के काम में, हम दो मिरनास, मीर-१४३ और मीर-५०६ का उपयोग किया, सेल चक्र प्रगति को विनियमित करने के लिए । A549 गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (nsclc) कोशिकाओं transfected थे, जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का विश्लेषण किया गया, और अपोप्तोटिक उपचार के कारण गतिविधि अंत में विश्लेषण किया गया । (CDK1, CDK4 और CDK6), और जी1/एस और जी2/एम चरण संक्रमण पर सेल चक्र रोक दिया गया था, cyclin-आश्रित kinases (CDKs) के डाउनरेगुलेशन का पता लगाया गया था । मार्ग विश्लेषण में उपचार के संभावित antiangiogenic गतिविधि, जो बहुआयामी गतिविधि के साथ दृष्टिकोण endows संकेत दिया । यहां, वर्णित करने के लिए सेल चक्र निषेध के बारे में मिरना गतिविधि की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया तरीके हैं, apoptosis के प्रेरण, और एन्डोजेनेसिस की निषेध द्वारा endothelial कोशिकाओं पर उपचार के प्रभाव । यह आशा की जाती है कि यहां प्रस्तुत तरीकों miRNA चिकित्सा विज्ञान और इसी गतिविधि पर भविष्य के अनुसंधान का समर्थन करेंगे और कि प्रतिनिधि डेटा प्रयोगात्मक विश्लेषण के दौरान अंय शोधकर्ताओं का मार्गदर्शन करेंगे ।
Introduction
सेल चक्र कई नियामक घटनाओं का संयोजन है जो मिटिक प्रक्रिया1के माध्यम से डीएनए और कोशिका प्रसार के दोहराव की अनुमति देते हैं । Cyclin-निर्भर kinases (CDKs) को विनियमित और सेल चक्र को बढ़ावा देने के2। उनमें से एक है, मिटिक cdk (CDK1) और अंतरावस्था cdk (CDK2, CDK4, और CDK6) सेल चक्र प्रगति3में एक निर्णायक भूमिका है । रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (आरबी) CDK4/CDK6 परिसर द्वारा फॉस्फोरिलेटेड कोशिका चक्र प्रगति4की अनुमति है, और CDK1 सक्रियण सफल सेल प्रभाग5के लिए आवश्यक है । पिछले कुछ दशकों के दौरान नैदानिक परीक्षणों में अनेक CDK अवरोधकों का विकास और मूल्यांकन किया गया है, जो कैंसर के उपचार में Cdk को लक्षित करने की क्षमता दर्शाते हैं । वास्तव में, हाल ही में6,7,8,9,10स्तन कैंसर के उपचार के लिए तीन cdk अवरोधकों को अनुमोदित किया गया है । इस प्रकार, CDKs, और विशेष रूप से, CDK1 और CDK4/6, कैंसर सेल प्रगति को विनियमित करने में बहुत रुचि के हैं ।
मिरनास (Mirnas) छोटे हैं, गैर कोडिंग RNAs और पोस्ट-जीन अभिव्यक्ति के transअपंग नियामकों, सभी मानव जीन11के लगभग 30% को विनियमित । उनकी गतिविधि शोधों दमन या दूत rnas के क्षरण पर आधारित है (mrnas)12। उनके जैविक महत्व के तराने ५,००० से अधिक मिर्नाओं की पहचान की गई है और एक भी मिर्ना अणु कई जीन11,13को विनियमित कर सकता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि मिरना एक्सप्रेशन13कैंसर सहित विभिन्न रोगों और रोग स्थितियों से जुड़ा हुआ है । वास्तव में, मिरनास अर्बुदीय या ट्यूमर दमन के रूप में विशेषता है, या तो बढ़ावा देने या ट्यूमर के विकास और14प्रगति को दबाने में सक्षम किया जा रहा है,15। रोगग्रस्त ऊतकों में मिरनास की सापेक्ष अभिव्यक्ति रोग प्रगति को विनियमित कर सकते हैं; इस प्रकार, मिरनास के बहिर्जात प्रसव चिकित्सकीय क्षमता है ।
फेफड़ों के कैंसर कैंसर से संबंधित मौतों का प्रमुख कारण है और सभी फेफड़ों द्रोह के ६०% से अधिक है गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर16,17, एक 5 साल से कम 20%18की जीवित रहने की दर के साथ । मीर-143-3p और मीर-506-3p का उपयोग हाल ही में फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं11में सेल चक्र को लक्षित करने के लिए मूल्यांकन किया गया था । मीर-१४३ और मीर-५०६ का अनुक्रम है कि CDK1 और CDK4/CDK6 के पूरक हैं, और A549 कोशिकाओं पर इन दो miRs के प्रभाव का विश्लेषण किया गया । प्रयोगात्मक विवरण प्रस्तुत कर रहे है और इस पत्र में चर्चा की । जीन अभिव्यक्ति, कोशिका चक्र प्रगति, और apoptosis विभिंन प्रायोगिक डिजाइन और transfection निंनलिखित timepoints का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । हम विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए microarray विश्लेषण के साथ वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-qPCR) तरीकों का इस्तेमाल किया, और अगली पीढ़ी आरएनए अनुक्रमण वैश्विक जीन dysregulation11निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता था । उत्तरार्द्ध विधि उच्च संवेदनशीलता और reproducibility के साथ प्रत्येक जीन की प्रतिलिपि के सापेक्ष बहुतायत की पहचान है, जबकि जीन के हजारों एक प्रायोगिक विश्लेषण से विश्लेषण किया जा सकता है । साथ ही, मिरना उपचार के कारण अपोप्टोटिक विश्लेषण किया गया था और यहां वर्णित है । जैव सूचना विज्ञान ने मार्ग विश्लेषण को पूरक किया । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मिश्रित मीर-१४३ और मीर-५०६ की चिकित्सकीय क्षमता के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ।
इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य कोशिकाओं में मिर्नास के प्रभाव की पहचान करने के लिए, सेल चक्र पर ध्यान देने के साथ है । तकनीक की विविधता यहां प्रस्तुत जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण पूर्व अनुवाद (qPCR का उपयोग करके) प्रोटीन स्तर पर जीन विश्लेषण के लिए विस्तृत और उपंयास तकनीकों के लिए, जैसे microarray विश्लेषण के रूप में । यह आशा की जाती है कि यह रिपोर्ट मिरनास के साथ काम करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए मददगार है । इसके अतिरिक्त, कोशिका चक्र के प्रवाह cytometric विश्लेषण और कोशिकाओं के apoptosis के लिए पद्धति प्रस्तुत की है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs कैंसर के इलाज के लिए लक्षित चिकित्सा के रूप में काम कर सकते हैं, रोगग्रस्त बनाम सामांय ऊतकों में अभिव्यक्ति के स्तर के dysregulation पहचानने । इस अध्ययन के लिए miRNAs निर्धारित है कि संभावित कई चरणों के दौरान सेल …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हितों का टकराव नहीं घोषित किया जाए ।
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
References
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