Summary
חלב אם מעביר וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), אם כי רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי אמהות מזוהמת HIV להידבק. תינוקות החושן לבלוע ~ 105על 10שמונה לוקיציטים אימהי מדי יום, למרות תאים אלה אינם לומדים. כאן אנו מתארים את הבידוד של חלב לוקיולוציטים וניתוח של קיבולת phagocytic שלהם.
Abstract
גם בהעדר תרופות אנטי-ויראליות, רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי אמהות שנדבקו ב-HIV להידבק, מציע השפעה הגנה חזקה של חלב (BM). אלא אם כן הגישה למים נקיים ונוסחת התינוק המתאימה אמינה, האדם אינו ממליץ על הפסקת ההנקה לאמהות הנגועות באיידס. גורמים רבים נוטים לעבוד במקביל כדי להפחית את השידור BM. תינוקות החושן לבלוע ~ 105על 108 שמונה לוקיציטים היומיום, למרות מה שנשאר ברור במידה רבה הוא התרומה של תאים אלה לאיכויות האנטי ויראליות של BM. כעת כיוונו לבודד תאים מתוך מוניטור האדם כדי למדוד נוגדן תלוי phagocyציטוזה הסלולר (ADCP), אחד התגובות החיוניות ביותר ומחוצה המערכת החיסונית, על ידי BM phagocytes נגד מטרות HIV. תאים היו מבודדים 5 האדם דגימות BM התקבל בשלבים שונים של ההנקה. בידוד נעשה באמצעות צנטריפוגה עדין ואחריו הסרה זהירה של שומן חלב ושטיפת חוזר של הגלולה התא. חרוזים פלורסנט מצופה מעטפת HIV (Env) אפירופה שימשו כמטרות ניתוח של ADCP. תאים היו מוכתמים עם סמן פני השטח CD45 כדי לזהות את הלוקוציטים. נמצא כי הפעילות ADCP היה משמעותי מעל ניסויים בקרה ומדידה הנידובית באמצעות נוגדן ספציפי HIV 830A.
Introduction
חלב האדם (BM) מורכב של תאים אמהי כי הם > 90% קיימא1. הרכב התא מושפע באופן חזק על ידי שלב של הנקה, מעמד הבריאות של האם והתינוק, וריאציה אינדיבידואלית, אשר נשאר מובן בצורה גרועה1,2,3,4. בהינתן כי מוניטור מכיל ~ 103על 105 לוקיציטים/mL, זה יכול להיות מוערך כי תינוקות החזה לבלוע ~ 105על 10שמונה לוקיולוציטים היומי5. שונים במחקרים vivo הוכיחו כי לוקיציטים אימהי לספק חסינות קריטית לתינוק והם פונקציונליים היטב מעבר לאתרים אלה של בליעה ראשונית5,6,7,8 ,9,10,11. כל התאים הmaternally שבלע התינוק יש את הפוטנציאל לבצע פונקציות החיסון לצד או לפצות על לוקיציטים של התינוק12.
העברת אמא אל הילד (MTCT) של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נשאר משבר במדינות מוגבלות משאבים. כdiarrheal ומחלות הנשימה אחראים לשיעורי התמותה הניכרים בקרב תינוקות במדינות מוגבלות משאבים, ומחלות אלה מופחתות באופן משמעותי על ידי הנקה בלעדית, את היתרונות לאמהות הנגועות באיידס של הנקה הרבה עולה על הסיכונים13,14,15. אלא אם כן הגישה למים נקיים ונוסחת התינוק המתאימה היא אמינה, האדם אינו ממליץ על הפסקת ההנקה לאמהות הנגועות באיידס16. כ 100,000 בקירוב באמצעות BM מתרחשים מדי שנה; עם זאת, רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי האמהות שלהם הנגועים באיידס להידבק, מציע אפקט הגנה חזקה של BM17,18,19,20,21. גורמים רבים נוטים לעבוד במשולב כדי למנוע שידור. חשוב מכך, נוגדנים ספציפיים ל-HIV (Abs) ב-BM יש קורלציה עם mtct מופחת ו/או מופחת תינוק מוות מזיהום HIV22,23. מה שנשאר בלתי ברור הוא התרומה של החלק הסלולרי של BM לאיכויות האנטי ויראליות שלה.
Abs רבים להקל על מגוון של פעילויות אנטי ויראליות בתיווך על ידי האזור ' קבוע ' של מולקולה האימונוגלובולין, הקטע crystallizable (Fc), באמצעות אינטראקציה עם קולטני Fc (FcRs) נמצא על כמעט כל התאים החיסוניים מולדים, כמעט כל אשר נמצאים האדם BM24. נוגדן תלויי תאי הסלולר (adcp) כבר הוכח כנדרש עבור הסיווג של זיהומים ויראלי כבר למדו במקרה של מניעת mtct של HIV25,26,27, מיכל בן 28 , 29. בהינתן דלות של הידע על התרומה הפוטנציאלית של פעילות adcp על ידי BM phagocytes למניעת mtct של HIV, אנחנו כיוונו לפתח שיטה קפדנית לבודד תאים מתוך מוניטור אנושי על מנת לבצע מחקר של adcp מתווכת על ידי תאים מ BM התקבל בשלבים שונים של הנקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל משתתף במחקר זה גויס והתראיין בהסכמה עם לוחות הביקורת האתית והמוסדית (IRB) עם ההדרכה והאישור של התוכנית של הר סיני להגנה על נושאים אנושיים (PPHS) באמצעות IRB מאושר פרוטוקול לקבלת דגימות חלב השד.
1. הכנה למיקרוספירה
- בחר אנטיגן יעד רלבנטי.
הערה: בדוגמה זו, נעשה שימוש בחלבון רקומביננטי V1V2-2F5K, שנועד לחקות את ה-פיסגה הtrimeric של מעטפת האיידס הטבעית30. - ביצוע ביוקטילציה באמצעות ערכה מסחרית (טבלת חומרים) לפי פרוטוקול היצרן.
- לחשב ממול מגיב ביוטין כדי להוסיף את התגובה עבור עודף מטוחנת 5 קיפול באמצעות הנוסחה: ממול ביוטין = mL חלבון x (mg חלבון/mL חלבון) x (ממול ביוטין/mg חלבון) x (5 ממול ביוטין/ממול חלבון)30,31. לאחר מכן לחשב μl של מגיב ביוטין להוסיף באמצעות הנוסחה: μl ביוטין = m מול ביוטין x (1,000,000 μl/l) x (L/10 mmol).
- . לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה התמוססות חלבון ב-0.5 ל-2.0 מ ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) לפי החישוב שנעשה לעיל.
- הכינו פתרון 10 מ"מ של ביוטין מגיב ב dimethylsulfoxide (dmso) ולהוסיף את הנפח המתאים של 10 מ"מ ביוטין מגיב לפתרון חלבון, ו דגירה התגובה על הקרח עבור 2 h או בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
- הסר עודף ביוטין באמצעות חלבון ריכוז (polyethersulfone [PES] ממברנות, 3 kda משקל מולקולרי לגזור [mwco], 0.5 mL; רשימת חומרים) לפי הוראות היצרן.
- ההפקדה מדגם לתוך התא העליון של הטור ספין ולהוסיף PBS עד 400 μL. Cap, ואז להכניס את החדר הזה לדוגמה לתוך צינור אוסף. צנטריפוגה ב 12,000 x g בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
- התעלם מזרימה והוסף את ה-PBS ל-400 μL. Repeat צנטריפוגה. התעלם מזרימה והוסף PBS ל 100 μL. מדידת ריכוז חלבון על ידי ספקטרוסקופיה.
הערה: ניתן לצוטט בחלבון ולקפוא ב-80 ° c עד לשימוש.
2. נוגדן תלויי הסלולר Phagocyציטוזה (Adcp) שיטת הכנת הצלחת
- חלבון biotinylated ממשלים ל 1 יקרומטר מיקרוספירות (' חרוזים '; רשימת חומרים) לפי הוראות היצרן.
- לכל לוחית של חרוזים מצובית, מודטה 6 μg של חלבון עם 12 μL של חרוזי מניות ב 200 μL של 0.1% בסרום שור (BSA)-PBS בטמפרטורת החדר עבור 1 h, vortexing בעדינות כל 20 דקות.
- צנטריפוגה ב 13,000 x g עבור 5 דקות. להיפטר supernatant, מערבולת בעדינות להשהות מחדש ב 1200 μl של 0.1% BSA-PBS. חזור על הספין ושטוף את שלב 2x. השהה מחדש ב-1200 μL של 0.1% BSA-PBS.
- Aliquot 10 μL של פתרון חרוז לכל גם בתחתית עגולה 96-צלחת הבאר. הכנת דילול של נוגדן או החיסונית סרה של עניין 12 μL של 2% HSA HBSS, בדרך כלל מתחיל ב 50 μg/mL של נוגדן או לדילול סרום 1/100.
הערה: בנתונים לדוגמה, השתמשו בנוגדן חד-שבטיים (mAb) 830A - הוסף 10 μl של נוגדן טיטרציה/סרה לצלחת חרוז ו דגירה עבור 2 h ב 37 ° c. הוסף 200 μL של 2% HSA HBSS לכל צלחת צנטריפוגה בתוך 2,000 x g עבור 10 דקות.
- בזהירות להסיר supernatant על ידי פנייה מהירה והיין של נוזל מהבארות הצלחת לתוך כיור כדי למנוע מטריד את הגלולה חרוז בלתי נראה.
3. תא חלב שדיים בידוד
- השג חלב האדם מנשים מניקות בריאים, ביטוי באמצעות משאבות אלקטרוניות כפולות או ידניות. לבודד תאים בתוך ~ 4 h של הביטוי, שמירה על חלב בטמפרטורת החדר.
- שימוש 50 mL צינורות, צנטריפוגה 50 מ ל חלב ב 800 x g עבור 15 דקות. בזהירות לשפוך את חלב רזה ושומן תוך השארת את הגלולה התא ללא הפרעה. לנגב את החלק הפנימי של הצינור עם מגבון נטול מוך כדי להסיר את כל השומן מהקיר הצינור.
- הוסף 10 מ ל 2% הנסיוב האנושי החלבון בפתרון מלח מאוזן של האנק (2% HSA HBSS [ללא Ca2 + או Mg+]). השהה מחדש את הגלולה על ידי ליטוף עדין כדי למנוע הפעלת התא אפופטוזיס. העברה ל 15 מ ל שפופרת ו צנטריפוגה ב 450 x g עבור 10 דקות.
- יוצקים את הסופרנטאנט וחזור על שלב 1.3. לאחר מכן, השהה מחדש בעדינות את התאים ב-1-2 מ ל של 2% HSA HBSS בהתאם למספר התאים הצפוי, וספור תאים על-ידי הומוקיטומטר או מונה תאים אוטומטי, וציין גם את הכדאיות של התא.
4. שיטת adcp
הערה: השיטות המתוארות כאן מותאמים מאקרמן ואח '.32.
- להוסיף 50,000 מבודדים טריים התאים BM לצלחת כל ADCP שיטת היטב ב 200 μL של 2% HSA-HBSS. דגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
- לניסויים בקרה, התאים טרום הדגירה ב 37 ° c עם 10 μg/ml אקטין מעכב (ציטוצ'סין-D), 50 μg/ml בחסימת סוכן (fcblock), או שילוב של שניהם לפני התוספת שלהם לצלחות.
- לוחית צנטריפוגה ב 930 x g עבור 10 דקות. הוסף 200 μl של 2% HSA HBSS וחזור על צנטריפוגה. הסר בזהירות את הסופרנטנט כמו בשלב 2.7 וחזור על השטיפה.
- הסר בזהירות את התאים של סופרנטנט ואת הכתמים על הכדאיות באמצעות 0.5 μg/mL (ריכוז סופי) לתקן את הכדאיות כתמים 450 לכל טוב ב 50 μL של 2% HSA HBSS. מודטה 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לוחית צנטריפוגה ב 930 x g עבור 10 דקות ולהסיר supernatant כמו בשלב 2.7. להוסיף 200 μL של 2% HSA HBSS ולוחית הצנטריפוגה שוב ואחריו על ידי הסרת supernatant כמו בשלב 2.7.
- לאחר כתמי הכדאיות, תאים כתם עבור סמנים לוקיתים של עניין, מינימלית כולל כתם ספציפי CD45 כגון PE-עכבר אנטי אדם CD45 (שיבוט HI30) בריכוז אופטימיזציה (1 μg/μL ב 50 μL של 1% BSA HBSS בנתונים לדוגמה).
הערה: ניתן לכלול סמני עניין ספציפיים לשושלת היוחסין. - מודטה 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לוחית צנטריפוגה ב 930 x g עבור 10 דקות ולהסיר supernatant כמו בשלב 2.7. הוסף 200 μL של 1% BSA HBSS וחזור על צנטריפוגה. . הסר את הסופרנטאנט תקן תאים ב 200 μL של 0.5% פורמלדהיד בחושך בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות או לילה ב 4 ° c. להכניס למקרר בחשיכה עד לניתוח.
5. ניתוח על ידי הציטוצימטריה לזרימה
- ביצוע העברה ראשונית כדי למנוע doublets בעלילה ופסולת קדמיים (FSC) לעומת משטח פיזור (מתחת לקרקע) (חומר קטן יותר מ-FSC = 5000) (ראה איור 1). להשתמש בכתם לעומת הכדאיות (V450 במקרה זה) מזימה לחסל תאים מתים (אלה החיוביים עבור כתמי הכדאיות).
- השתמש בעלילה CD45 לעומת מחלקת הקרקע כדי להבדיל בין המחלקות הגדולות לוקיציט (גרנולוציטים, מונוציטים, לימפוציטים) כפי שמתואר בהרחבה33,34.
הערה: סיווג זה מרמז רק על סמנים ספציפיים לשושלת היוחסין כדי לאשר את סוג התא. - עבור כל התאים CD45 +, או עבור כל מערכת משנה של עניין של ריבית, למדוד פעילות ADCP על ידי מסמן על התאים החיוביים חרוז בהיסטוגרמה של fluorescein isothiocyanate (FITC) הערוץ, שבו חרוזי פלורסנט מזוהים.
הערה: בארות הבקרה השליליות שבהן לא נוספו חרוזים יציינו היכן התאים החיוביים לחרוז בולטים בהיסטוגרמה ולכן היכן למקם את סמן הסיכום. - לחשב את התוצאות ADCP כמו (עוצמה פלואורסצנטית החציוני [MFI] התאים חרוז-חיובי) x (% של סך CD45 + תאים באוכלוסיה החיובית). השתמש בתוכנה גרפית כדי להתוות ציונים בכל ריכוז Ab/סרום ולבצע ניתוח אזור-מתחת לעיקול (אוק).
הערה: ADCP נחשב חיובי אם ה-אוק גדול מ-3x סטיית התקן של ה-ADCP ניקוד של שליטה שלילית לא ספציפית mAb (במקרה זה, 3865).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן לשמור על חלב בטמפרטורת החדר או קריר יותר (אם כי לא קפוא); עם זאת, בהתחשב בכך שבחנו בכדאיות מופחתת כאשר החלב נשמר קר מאוד (הנתונים לא מוצגים), וכי זה פשוט לאסוף, לאחסן בקצרה, ותחבורה בטמפרטורות הסביבה, מומלץ כי דגימות לא מקורר כדי להקטין את שינויים מדגם לדוגמה. בחלב שהושג 7-183 ימים post-לידתי, ריכוז התא נקבע על ידי מונה תא אוטומטי נע בין 16083-222857 תאים/mL. איור 1 ממחיש את אסטרטגיית האיסוף המבטלת doublets, פסולת ותאים מתים. . הכדאיות הייתה ~ 90 ל-99% כ-1.6-12.3% מהתאים החיים הכולל היו CD45+ לוקיולוציטים (שולחן 1). רוב מונוציטים לכאורה נראה להיות precursors/בוגרים תאים כפי שתוארו בעבר, מבוסס על היחידהל34CD45 מרמז לעומת היחידה למתקדמים. מונוציטים לכאורה הוגדרו כמובינוני נמוך ביניים/cd45נמוך, למרות מעטים הציגו את הרמות הגבוהות יותר CD45 מכתים בנפרד מאוכלוסיית לימפוציטים לכאורה (מרכז היותרנמוך/cd45נמוכה) יותר בדרך כלל מקושר עם דם מונוציטים (איור 1), בדומה למחקרים קודמים33,34. הגרנולוציטים לכאורה הוגדרוכ/כפישהאס. פי. או...33,34 (שולחן 1). שים לב שסיווג זה מרמז רק על כך שסמנים ספציפיים לשושלת היוחסין יהיו נחוצים כדי לאשר את סוג התא.
הפעילות ADCP של התאים המבודדים מבודדת הטרי נמדד באמצעות HIV ספציפי האדם mAb 830A, אשר ספציפית עבור האזור V2 של מעטפת HIV ונקשר האנטיגן V1V2-2F5K נבדק כאן. הפעילות ADCP נמדדה לדוגמה כאן באמצעות חלב שהושג בחודש 1 post-לידתי (איור 2א). נתונים לדוגמה מראים את ה-FITC הצפויה (חרוז +) היסטורג לראות בעת בCD45+ תאים (נתונים שנוצרו באמצעות 1 Μg/ML mab מוצג). הסמנים השחורים מציינים את האוכלוסיות המשמשות לחישוב תוצאות ADCP. במדגם 830A (הפאנל הראשון של איור 2א), אחוזים של CD45+ תאים וקרינה ממוצע של אוכלוסייה זו מוצגים, אשר השתמשו כדי לחשב את הציון adcp באמצעות המשוואה בשלב 3.4. תאים טרום מודבטים עם אקטין מעכבי ציטוקלסין-D (ציטוד) ו/או fcr-חסימת Abs (fcblock) לפני הדגירה שלהם עם Ab-מאוגד/אנטיגן בשילוב חרוזים הציגו adcp ברמה של הפקד mab 3865 או מתחת, המציין adcp היה fcr ו actin תלוי (איור 2). הציון ADCP נקבע עבור סך CD45+ תאים היה ~ 25 לערך 35-מקפלים מעל רמות הרקע המוגדרים באמצעות שליטה שלילית anti-אנתרקס mab 3865. כל תת-קבוצה מרכזית נותחה גם היא בנפרד. הגרנולוציטים לכאורה הציגו פעילות ADCP ~ 12 למעלה 29-לקפל גבוה יותר מאשר הרקע. ADCP מונוציט לכאורה היה ~ 2 לפני 3 קיפול על הרקע (איור 2). לימפוציטים לכאורה כצפוי לא הוצגה כל פעילות ADCP מדידה (פחות מ 3x סטיית התקן של הציון ADCP של הערך השלילי לא ספציפית mAb 3865; נתונים לא מוצגים).
איור 1: הזרימה הדגימה cy, לנסות נתונים של תאים מבודדים מחלב השד. תאים עובדו והוכתם כפי שמתואר בפרוטוקול. (A) תאים בודדים היו מגודרת כדי לחסל doublets ב Fsc-H VS. Fsc-A העלילה כפי שמוצג, גם להוציא את הפסולת הקטנה < 5000 ב Fsc-a. (ב) אוכלוסייה זו שימש לשער על תאים חיים (אשר לא להכתים עם צבע הכדאיות) ב-V450 (הכדאיות כתם) העלילה. (ג) תאים חיים אלה שימשו בחלקה fsc vs. הבנק הקיסרי. התנוחה הצפויה של אי-לוקיציטים, כנראה להיות בעיקר תאים אפיתל החלב, הוא מודגש ("E"). (ד) אותו מגרש fsc vs. בהאס. אס מוצג רק עם CD45+ תאים. ערכות המשנה הגדולות לאוקוציטים ציינו רק זהויות מבוססות על הפרמטרים הקבועים והצפויים של האס. פי. M = מונוציטים; L = לימפוציטים). (ה) תאים בר קיימא שימשו עבור מחלקה של מחלקת המידע לעומת CD45 עם קבוצות המשנה הגדולות לוקיציט שצוין. החזרה ממזימה זו הניבה את הנתונים המוצגים בלוח ד. שים לב לכך שסיווג זה מרמז רק על כך שהסמנים הספציפיים לשושלת היוחסין נחוצים כדי לאשר את סוג התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נתוני ADCP לדוגמה באמצעות תאים מבודדים מחלב השד. שיטת ADCP המבוצעת מבוססת על השיטת העיבוד של אקרמן ואח '30. המנה בוצעה כמתואר בפרוטוקול שלעיל. (A) לדוגמה fitc היסטורג ב 1 μg/ML mab, עם סמנים המציינים את האוכלוסיות חרוז/fitc + השתמשו כדי לקבוע את הציון adcp. ציונים חושבו כ (MFI of חרוז-חיובי תאים) x (% של סך CD45+ תאים ב-חרוז/fitc + האוכלוסייה חיובי). הפאנל הראשון באמצעות mAb 830A לבד גם מציין את האחוז של סך CD45+ תאים ואת הערך עוצמת הזריחה ממוצע המשמש לחישוב ציון adcp בדוגמה זו. (ב) הציונים adcp על כל הדילול mab מאספי שימשו כדי לחשב שטח-תחת-עיקול (אוק) ערכים בתוכנה גרפית. עבור ניסויים שליטה, אקטין מעכבי ציטוקאלסין-D (ציטוד), fcr חסימת הסוכן (fcblock), או שילוב של שניהם מראש משני מודבטים עם תאים לפני התוספת שלהם למערכות החיסון (ראה אגדות). שים לב שסיווג תא זה מרמז רק על כך שיש צורך בסמנים ספציפיים ליוחסין כדי לאשר את סוג התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| דוגמה | תאים/mL | % CD45+ | גרנולוציטים | ונוציטים |
| 1 | 222,857 | 12.3 ± 1.9 | 13.6 ± 3.8 | 65.9 ± 5.6 |
| 2 | 27,361 | 1.6 ± 0.01 | 25.2 ± 4.0 | 9.1 ± 5.6 |
| 3 | 161,486 | 3.6 ± 1.1 | 47.8 ± 6.8 | 24.3 ± 4.3 |
| 4 | 16,083 | 2.7 ± 0.1 | 17.9 ± 3.5 | 34.4 ± 1.0 |
| מיכל 5 | 25,155 | 4.0 ± 0.7 | 29.7 ± 2.6 | 20.5 ± 1.4 |
| * של CD45+ תאים | ||||
טבלה 1: דוגמאות של ספירת תאים ומאפיינים טיפוסיים של חלב השד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
את הטכניקה מבוססי הזרימה cy, למדידת פעילות ADCP שתוארה לעיל תוארה לראשונה ב 201130 , מאז הוכח חזק מצוטט ביותר מ 80 לימודים. הפרוטוקול המתואר כאן מתאים את הטכניקה לשימוש עם תאי BM ראשיים בפעם הראשונה. המחקרים הקודמים של Fc-בתיווך פונקציונליות על ידי התאים BM היו מוגבלים במידה רבה למדידה של התפרצויות חמצוני או היסטולוגיה מבוססי phagocyציטוזה באמצעות תאים מבודדים הקולורום (0-4 ימים לאחר הלידה). כמעט אף מחקרים לא בחנו תאים ב-BM האנושי עבר את השלב הקולורום. מחקרים באמצעות תאים colostral הסיקו בדרך כלל כי גרנולוציטים בקולוסטרום הם פחות פעילים מאשר אלה מבודדים מדם, התנהגות כמו "האקסותאריך תא" כי עבר לתוך extravascular space35, למרות מחקרים סותרים יש דיווחו על היכולות הדומות של phagocytic ו בקטריריטיות36.
במשך עשרות שנים, המיקרוסקופיה המסורתית השתמשה כדי לזהות את הלוקוציטים של BM, וסוג זה של זיהוי חזותי עשוי להוביל לכשלי תא1. מספר מחקרים השוו מעבר לחודש הראשון של ההנקה, ורובם התמקדו בקולוסטרום. השימוש cy, לנסות לזהות תאים סביר לזהות במדויק תאים, אם כי רק מספר קטן של מחקרים BM נעשו באמצעות שיטה זו, לעתים קרובות עם מספר קטן מאוד לדוגמה. מחקרים נוכחיים הראו כי התוכן הלוקוציט של BM בכל שלבי ההנקה משתנה באופן נרחב, החל מ-~ 104עד 7 x 105 לוקיציטים/ml בקולוסטרום מוקדם, הפחתת עד 103עד 5 x 104 לוקיציטים/ml בחלב בוגר, למרות שכל המחקרים מאשרים כי הריכוז והקומפוזיציה של התא מושפעים בחוזקה על ידי שלב ההנקה1,2,3,4,5. כמו מעברי חלב לקומפוזיציה הבוגרת שלה, ריכוז נויטרופילים נראה להגדיל, למרות מחקרים כאלה לא האריכו בדרך כלל מעבר לחודש הראשון לאחר הלימודים34.
הפרוטוקול תיאר בזאת באמצעות חרוזי פלורסנט כמו היעד phagocytic, למרות שסביר להניח שניתן להחיל על המחקר BM adcp של מגוון של מטרות רלוונטיות יותר ביולוגית כגון מתחמי החיסונית ותאים נגועים, מופעלות על ידי שונים Ab isotypes ו חלקות. תא גדול הצביעת הפאנל יכול להיות מועסק כדי להבדיל עוד יותר את הלוקוציטים. מחקרים גדולים יהיה חיוני לפתח הבנה מקיפה של ADCP על ידי אלה תאים ראשוניים רלוונטיים. פרוטוקול זה מאפשר הקמת ADCP על ידי מוניטור לוקיציטים כמנגנון פוטנציאלי להפחתת MTCT של HIV, כמו גם פתוגנים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לד ר סוזאן זוללה-פזנר במחלקה לרפואה ומחלקת מיקרוביולוגיה בבית הספר לרפואה ע שלמה בהר סיני לסקירה כתבי יד. NIH/ניקולה סיפק מימון לפרויקט זה תחת המענק מספר R21 HD095772-01A1. בנוסף, היתה למשרד המחלקה לרפואה מחלקת מחלות זיהומיות, בית הספר לרפואה ע ר Icahn בהר סיני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10 mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
