Summary
Bröstmjölk överför humant immunbristvirus (HIV), men endast ~ 15% av spädbarn ammade av HIV-infekterade mödrar blir smittade. Ammade spädbarn mata in ~ 105− 108 moderns leukocyter dagligen, även om dessa celler är understuderade. Här beskriver vi isoleringen av bröstmjölk leukocyter och en analys av deras fagocytos kapacitet.
Abstract
Även i avsaknad av antiretrovirala läkemedel, endast ~ 15% av spädbarn ammade av HIV-infekterade mödrar blir smittade, vilket tyder på en stark skyddande effekt av bröstmjölk (BM). Om inte tillgång till rent vatten och lämplig modersmjölksersättning är tillförlitlig, WHO rekommenderar inte upphörande av amning för HIV-infekterade mödrar. Många faktorer som sannolikt arbetar parallellt för att minska BM överföring. Ammade spädbarn mata in ~ 105− 108 moderns leukocyter dagligen, men vad som fortfarande är till stor del oklart är bidraget från dessa celler till de antivirala kvaliteter av BM. för närvarande syftade vi till att isolera celler från Human BM för att mäta antikroppsberoende cellulära fagocytos (ADCP), en av de mest väsentliga och genomträngande medfödda immunsvar, av BM fagocyter mot HIV-mål. Cellerna isolerades från 5 humana BM-prover som erhållits i olika stadier av amning. Isolering utfördes via mild centrifugering följt av noggrann borttagning av mjölkfett och upprepad tvättning av cellpelleten. Fluorescerande pärlor belagda med HIV-kuvert (ENV) epitop användes som mål för analys av ADCP. Celler färgas med CD45 yta markör för att identifiera leukocyter. Det konstaterades att ADCP-aktiviteten var signifikant över kontroll experiment och reproducerbart mätbar med hjälp av en HIV-specifik antikropp 830A.
Introduction
Human bröstmjölk (BM) består av moderns celler som är > 90% livskraftiga1. Cell sammansättningen påverkas starkt av skede av amning, hälsostatus av mor och spädbarn, och individuell variation, som fortfarande är dåligt förstådd1,2,3,4. Med tanke på att BM innehåller ~ 103− 105 leukocyter/ml, det kan uppskattas att ammade spädbarn mata in ~ 105− 108 maternella leukocyter dagligen5. Olika in vivo studier har visat att moderns leukocyter ger kritisk immunitet mot barnet och är funktionella långt bortom dessa platser för initial förtäring5,6,7,8 ,9,10,11. Alla materneligt framställda celler som intas av spädbarnet har potential att utföra immunförsvaret vid sidan av eller kompensera för spädbarnets egna leukocyter12.
Överföring från mor till barn (MTCT) av humant immunbristvirus (HIV) är fortfarande en kris i resursbegränsade länder. Som diarré och luftvägssjukdomar är ansvariga för betydande dödlighet bland spädbarn i resurs-begränsade länder, och dessa sjukdomar reduceras avsevärt genom exklusiv amning, fördelarna för hiv-infekterade mödrar av amning vida uppväger riskerna13,14,15. Om inte tillgång till rent vatten och lämplig modersmjölksersättning är tillförlitlig, WHO rekommenderar inte upphörande av amning för HIV-infekterade mödrar16. Ungefärligt 100 000 MTCTs via BM uppstår årligen; ändå, bara ~ 15% av spädbarn ammade av deras hiv-infekterade mödrar blir smittade, vilket tyder på en stark skyddande effekt av BM17,18,19,20,21. Många faktorer fungerar sannolikt parallellt för att förhindra överföring. Viktigt, HIV-specifika antikroppar (ABS) i BM har korrelerats med minskad MTCT och/eller reducerad spädbarnsdöd från hiv-infektion22,23. Det som fortfarande till stor del är oklart är bidraget från den cellulära fraktionen av BM till dess antivirala egenskaper.
Många ABS underlätta en mängd anti-virala aktiviteter medieras av den "konstanta" regionen av immunglobulin molekylen, den kristalliserbara fragment (FC), via interaktion med FC-receptorer (FcRs) finns på nästan alla medfödda immunceller, praktiskt taget alla som finns i human BM24. Antikroppsberoende cellulära fagocytos (ADCP) har visats som nödvändigt för clearance av virusinfektioner och har varit understuderat vid förebyggande av MTCT av hiv25,26,27, 28 , 29. med tanke på bristen på kunskap om det potentiella bidraget av ADCP verksamhet av BM fagocyter till förebyggande av MTCT av hiv, syftade vi till att utveckla en rigorös metod för att isolera celler från Human BM för att genomföra en studie av ADCP medierad av celler från BM som erhållits i olika stadier av amning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varje deltagare i denna studie rekryterades och intervjuades i enlighet med den etiska och institutionella Review Board (IRB) godkännande med vägledning och bemyndigande av Mount Sinai program för skydd av försökspersoner (PPHS) med hjälp av en IRB-godkänd protokoll för erhållande av bröst mjölks prov.
1. mål mikrosfär förberedelse
- Välj ett relevant målantigen.
Anmärkning: i detta exempel användes rekombinant protein V1V2-2F5K, som var utformat för att efterlikna trimeric Apex av Native HIV-kuvert30. - Utför biotinylering med hjälp av ett kommersiellt Kit (tabell över material) enligt tillverkarens protokoll.
- Beräkna mmol av biotin reagens för att lägga till reaktionen för en 5-faldig molar överskott med hjälp av formeln: mmol biotin = ml protein x (mg protein/ml protein) x (mmol biotin/mg protein) x (5 mmol biotin/mmol protein)30,31. Beräkna sedan μL av biotin-reagens för att addera med hjälp av formeln: μL biotin = mmol biotin x (1 000 000 μL/L) x (L/10 mmol).
- Temperera biotin till rumstemperatur innan öppningen. Lös upp protein i 0,5 − 2,0 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) enligt den beräkning som gjorts ovan.
- Bered en 10 mM lösning av biotin-reagens i dimetylsulfoxid (DMSO) och Tillsätt lämplig volym 10 mM biotin-reagens till proteinlösningen och inkubera reaktionen på is i 2 timmar eller vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Ta bort överskott av biotin med proteinkoncentratorer (polyetersulfon [PES] membran, 3 kDa molekylvikt cut-off [MWCO], 0,5 mL; Tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.
- Deponera provet i den övre kammaren av spin kolumn och tillsätt PBS upp till 400 μL. locket och sätt sedan in denna provkammare i ett samlingsrör. Centrifugera vid 12 000 x g vid rumstemperatur i 30 min.
- Kassera flödet och tillsätt PBS till 400 μL. Upprepa centrifugering. Kassera flödet och tillsätt PBS till 100 μL. Mät protein koncentrationen med en spektrofotometer.
Anmärkning: protein kan aliciteras och frysas vid-80 ° c tills det används.
2. antikroppsberoende cellulära fagocytos (ADCP) assay plattan beredning
- Konjugerat biotinylerat protein till 1 μm mikrosfärer ("pärlor"; Tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.
- Per platta av konjugerade pärlor, inkubera 6 μg protein med 12 μl Lager pärlor i 200 μl av 0,1% bovint serum albumin (BSA)-PBS vid rumstemperatur under 1 h, vortexa försiktigt var 20 min.
- Centrifugera vid 13 000 x g i 5 min. Kassera supernatanten, skaka försiktigt och Omsuspendera i 1200 μL av 0,1% BSA-PBS. Upprepa spinn och tvätta steg 2x. Omsuspenderas i 1200 μL av 0,1% BSA-PBS.
- Aliquot 10 μL pärllösning per brunn i en rund botten 96-bra plåt. Bered utspädningar av antikroppar eller Immunsera av intresse i 12 μL av 2% HSA HBSS, vanligtvis från 50 μg/mL antikropp eller en 1/100 serumutspädning.
Anmärkning: i exempeldata användes monoklonal antikropp (mAb) 830A. - Tillsätt 10 μL titrerad antikropp/serum till Pärlplattan och inkubera i 2 timmar vid 37 ° c. Tillsätt 200 μL av 2% HSA HBSS till varje brunn och centrifugera plattan på 2 000 x g i 10 min.
- Ta försiktigt bort supernatanten genom en snabb översvarvning och dekantering av vätska från plattan brunnar i en diskbänk för att undvika att störa den osynliga pärla pellets.
3. bröstmjölk cell isolering
- Få human bröstmjölk från friska ammande kvinnor, uttryckt med hjälp av dubbla elektroniska eller manuella pumpar. Isolera celler inom ~ 4 h uttryck, hålla mjölk i rumstemperatur.
- Med 50 mL rör, Centrifugera 50 mL mjölk vid 800 x g för 15 min. Häll försiktigt av skumma mjölk och fett samtidigt som cellen pelleten ostörd. Torka av insidan av röret med en luddfri torka för att ta bort allt fett från röret väggen.
- Tillsätt 10 ml 2% humanserum äggvita i Hank ' s balanserade saltlösning (2% HSA Hbss [utan ca2 + eller mg+]). Omsuspendera pelleten genom skonsam pipettering för att undvika cell aktivering och apoptos. Överför till en 15 mL tub och centrifugera vid 450 x g i 10 min.
- Häll av supernatanten och upprepa steg 1,3. Sedan, försiktigt Omsuspendera celler i 1 − 2 mL 2% HSA HBSS beroende på förväntat cell nummer, och räkna celler av en hemocytometern eller en automatiserad cell räknare, notera också cellernas lönsamhet.
4. ADCP-analys
Anmärkning: metoder som beskrivs här är anpassade från Ackerman et al.32.
- Tillsätt 50 000 nyisolerade BM-celler till varje ADCP-analysplatta väl i 200 μL på 2% HSA-HBSS. Inkubera i 2 timmar vid 37 ° c.
- För kontroll experiment, pre-Inkubera celler vid 37 ° c med 10 μg/ml aktin-hämmare (cytochalasin-D), 50 μg/ml FCR blockerande medel (fcblock), eller en kombination av båda före deras tillägg till plattorna.
- Centrifugera plattan vid 930 x g i 10 min. Tillsätt 200 μl 2% HSA Hbss och upprepa centrifugering. Ta försiktigt bort supernatanten som i steg 2,7 och upprepa tvätt.
- Ta försiktigt bort supernatanten och fläcken celler för livskraft med 0,5 μg/mL (slutlig koncentration) fixerbar genomförbarhet fläcken 450 per brunn i 50 μL av 2% HSA HBSS. Inkubera 20 min vid rumstemperatur i mörker. Centrifugera plattan på 930 x g i 10 min och ta bort supernatanten som i steg 2,7. Tillsätt 200 μL av 2% HSA HBSS och centrifugera plattan igen följt av avlägsnande av supernatanten som i steg 2,7.
- Efter genomförbarhet färgning, fläckar celler för leukocyt markörer av intresse, minimalt inklusive en CD45-specifik fläck såsom PE-mus anti-human CD45 (klon HI30) vid en optimerad koncentration (1 μg/μL i 50 μL av 1% BSA HBSS i exempeldata).
Observera: alla härstamning-specifika markörer av intresse kan inkluderas. - Inkubera 20 min vid rumstemperatur i mörker. Centrifugera plattan på 930 x g i 10 min och ta bort supernatanten som i steg 2,7. Tillsätt 200 μL 1% BSA-HBSS och upprepad centrifugering. Ta bort supernatanten. Fixera celler i 200 μL av 0,5% formaldehyd i mörker vid rumstemperatur i 30 min eller över natten vid 4 ° c. Kylskåp i mörkret tills analysen.
5. analys av flödescytometri
- Utför första gating för att eliminera dubbletter på en Forward scatter (FSC) kontra sida scatter (SSC) tomt och skräp (material mindre än FSC = 5000) (se figur 1). Använd en SSC kontra lönsamhet fläck (V450 i detta fall) tomt för att eliminera döda celler (de som är positiva för bärkraft fläck).
- Använd en SSC vs. CD45 Plot att differentiera de stora leukocytklasserna (granulocyter, monocyter, lymfocyter) som beskrivs utförligt33,34.
ANMÄRKNINGAR: denna klassificering är bara suggestiva och härstamnings specifika markörer behövs för att bekräfta celltypen. - För alla CD45 + celler, eller för varje leukocyt delmängd av intresse, mäta ADCP aktivitet genom gating med en markör på pärlpositiva celler i ett histogram av fluorescein isotiocyanate (FITC) kanal, där fluorescerande pärlor upptäcks.
Anmärkning: de negativa kontrollbrunnar där pärlor inte lagts till kommer att indikera var de pärla-positiva cellerna är uppenbara i histogrammet och därför var att placera gating markören. - Beräkna ADCP-Poäng som (median fluorescensintensitet [MFI] för pärlpositiva celler) x (% av de totala CD45 +-cellerna i den positiva populationen). Använd grafikprogramvara för att rita noter vid varje AB/serumkoncentration och för att utföra en area-under-The-Curve (AUC) analys.
Anmärkning: ADCP anses positivt om AUC är större än 3x standardavvikelsen för ADCP score AUC för en icke-specifik negativ kontroll mAb (i det här fallet, 3865).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mjölk kan förvaras i rumstemperatur eller svalare (men inte fryst); men med tanke på att vi har observerat minskad lönsamhet när mjölken har hållits mycket kall (data som inte visas), och att det är enklare att samla in, förvara kort och transportera i omgivningstemperaturer, rekommenderas att proverna inte kylas in för att minska prov-till-prov variation. I mjölk som erhålls 7 − 183 dagar efter partum varierade cellkoncentrationen, fastställd genom automatiserad cell räknare, från 16083 − 222857 celler/mL. Figur 1 illustrerar den gating strategi eliminera dubbletter, skräp, och döda celler. Lönsamheten var ~ 90 − 99%. Cirka 1,6 − 12,3% av de totala levande cellerna var CD45+ leukocyter (tabell 1). De flesta påstådda monocyter verkade vara prekursorer/omogna celler som tidigare beskrivits, baserat på den suggestiva SSC vs CD45 gating34. De påstådda monocyterna definierades som SSClåg-Intermediate/CD45låg, men få uppvisade högre CD45 färgning nivåer skiljer sig från den påstådda lymfocytpopulationen (SSClåg/CD45låg) mer typiskt i samband med blod monocyter (figur 1), liknande tidigare studier33,34. De påstådda granulocyterna definierades som SSChög/CD45intermediär33,34 (tabell 1). Observera att denna klassificering endast är suggestiv och att härstamnings specifika markörer behövs för att bekräfta celltypen.
ADCP-aktiviteten hos de nyligen isolerade BM-cellerna mättes med hjälp av den HIV-specifika humana mAb 830A, som är specifik för v2-regionen i HIV-kuvertet och binder till V1V2-2F5K-antigen som testats här. ADCP-aktiviteten mättes för exemplet här med hjälp av mjölk som erhållits vid 1 månad efter förlossningen (figur 2a). Exempeldata visar den förväntade FITC (pärla +) histogram ses när gating på CD45+ celler (data som genereras med 1 μg/ml MAB visas). De svarta markörerna indikerar de populationer som används för att beräkna ADCP-poäng. I provet 830A visas data (första panelen i figur 2a), procentandelen CD45+ celler och den genomsnittliga fluorescensen hos den populationen, som användes för att beräkna ADCP-poängen med hjälp av ekvationen i steg 3,4. Celler som förinkuberas med aktin-hämmare cytochalasin-D (cytod) och/eller FCR-blockerande ABS (fcblock) före deras inkubation med AB-bunden/antigen-kopplade pärlor uppvisade ADCP-aktivitet på kontrollnivå MAB 3865 eller lägre, vilket indikerar att ADCP var FCR och aktin-beroende (figur 2). Den ADCP Poäng bestäms för totalt CD45+ celler var ~ 25 − 35-faldig över bakgrundsnivåer definieras med hjälp av negativ kontroll anti-mjältbrand mab 3865. Varje större delmängd analyserades separat också. De påstådda granulocyterna uppvisade ADCP-aktivitet ~ 12 − 29-faldigt högre än bakgrunden. Den påstådda monocyten ADCP var ~ 2 − 3-faldig ovanför bakgrunden (figur 2). De påstådda lymfocyterna som förväntat uppvisade ingen mätbar ADCP-aktivitet (mindre än 3x standardavvikelse av ADCP-poängen AUC för den icke-specifika negativa kontrollen mAb 3865; data visas inte).
Figur 1: data för provflödescytometri av celler som isolerats från bröstmjölk. Celler bearbetades och färgas enligt beskrivningen i protokollet. (A) enstaka celler var gated på att eliminera dubbletter i en FSC-H vs FSC-en tomt som visas, också gating ut det lilla skräp < 5000 i FSC-A. (B) denna population användes för att grinden på levande celler (som inte fläcken med livskraft färg) i en SSC vs V450 (livskraftig fläck) tomt. (C) dessa levande celler användes i en FSC kontra SSC-komplott. Den förväntade positionen av icke-leukocyter, sannolikt huvudsakligen bröst epitelceller, är markerad ("E"). (D) samma FSC kontra SSC-Plot visas endast med CD45+ -celler. De stora leukocytsubseten noterade är endast påstådda identiteter baserade på väletablerade och förväntade SSC-parametrar (G = granulocyter; M = monocyter; L = lymfocyter). (E) livskraftiga celler användes för en SSC vs. CD45 Plot med de stora leukocytsubsets noterade. Back-gating från denna tomt gav data som visas i panel D. Observera att denna klassificering endast är suggestiv och att härstamnings specifika markörer behövs för att bekräfta celltypen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på ADCP-data med celler som isolerats från bröstmjölk. Den ADCP-analys som utförs baseras på analysen som anpassats från Ackerman et al.30. Analysen utfördes i enlighet med ovanstående protokoll. A) prov FITC-histogram på 1 μg/ml MAB, med markörer som indikerar den pärla/FITC +-population som används för att bestämma ADCP-poängen. Poängen beräknades som (MFI av pärla-positiva celler) x (% av den totala CD45+ celler i pärla/FITC + positiv population). Den första panelen som använder mAb 830A anger också procentandelen av de totala CD45+ -cellerna och medelvärdet för fluorescensintensiteten som används för att beräkna ADCP-poängen i det exemplet. (B) ADCP-Poäng vid varje MAB spädningsmedel användes för att beräkna area-under-KURVAN (AUC) värden i grafikprogram. För kontroll experiment, aktin hämmare cytochalasin-D (cytod), FCR blockerande medel (fcblock), eller en kombination av båda var förinkuberas med celler innan deras tillägg till immunkomplex (se legender). Observera att denna cell klassificering endast är suggestiv och att härstamnings specifika markörer behövs för att bekräfta celltypen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prov | Celler/mL | % CD45+ | Granulocyter | Monocyter |
| 1 | 222 857 | 12,3 ± 1,9 | 13,6 ± 3,8 | 65,9 ± 5,6 |
| 2 | 27 361 | 1,6 ± 0,01 | 25,2 ± 4,0 | 9,1 ± 5,6 |
| 3 | 161 486 | 3,6 ± 1,1 | 47,8 ± 6,8 | 24,3 ± 4,3 |
| 4 | 16 083 | 2,7 ± 0,1 | 17,9 ± 3,5 | 34,4 ± 1,0 |
| 5 | 25 155 | 4,0 ± 0,7 | 29,7 ± 2,6 | 20,5 ± 1,4 |
| * av CD45+ celler | ||||
Tabell 1: exempel på typiska antal bröstmjölk celler och egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flödescytometribaserad teknik för mätning av ADCP-aktivitet som beskrivs häri beskrevs först i 201130 och har sedan dess bevisats vara robust och citerad i mer än 80 studier. Det protokoll som beskrivs här anpassar denna teknik för användning med primära BM-celler för första gången. Tidigare studier av FC-medierad funktionalitet av BM-celler har i stort sett begränsats till mätning av oxidativa skurar eller histologisk-baserade fagocytos-analyser med celler isolerade från rå mjölk (0 − 4 dagar efter födseln). Praktiskt taget inga studier har undersökt celler i human BM förbi rå mjölks fasen. Studier med maternell cells har generellt dragit slutsatsen att granulocyter i rå mjölk är mindre aktiva än de som isolerats från blod, beter sig som en "exudat cell" som har flyttat in i extravaskulära rymden35, men motstridiga studier har rapporterad liknande fagocytos och bakteriedödande kapaciteter36.
I årtionden, traditionell mikroskopi användes för att identifiera BM leukocyter, och denna typ av visuell identifiering kan ha lett till cell felidentifiering1. Få studier har jämfört BM leukocyt sammansättning bortom den första månaden av amning, och de flesta har fokuserat på rå mjölk. Användningen av flödescytometri för att identifiera celler är sannolikt att exakt identifiera celler, men bara ett litet antal BM studier har gjorts med hjälp av denna metod, ofta med ett mycket litet provnummer. Aktuella studier har indikerat att leukocythalten i BM i alla stadier av amning varierar kraftigt, allt från ~ 104− 7 x 105 leukocyter/ml i tidig rå mjölk, vilket minskar till 103− 5 x 104 leukocyter/ml i mogen mjölk, även om alla studier bekräftar att cellkoncentrationen och sammansättningen påverkas starkt av stadiet av amning1,2,3,4,5. Som mjölk övergångar till sin mogna sammansättning, neutrofila koncentrationen verkar öka, även om sådana studier har normalt inte längre än den första månaden postpartum34.
Det protokoll som beskrivs häri använder fluorescerande pärlor som fagocytiska målet, även om det sannolikt kan tillämpas för att studera BM ADCP av en mängd mer biologiskt relevanta mål såsom immunkomplex och infekterade celler, utlöses av olika AB isotyper och Underklasser. En större cell färgning panel kan användas för att ytterligare differentiera leukocyter. Stora studier kommer att vara avgörande för att utveckla en omfattande förståelse av ADCP av dessa relevanta primära celler. Detta protokoll möjliggör inrättandet av ADCP av BM leukocyter som en potentiell mekanism för minskning av MTCT av HIV, samt andra patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Susan Zolla-Pazner vid Institutionen för medicin och Institutionen för mikrobiologi vid Icahn School of Medicine på Mount Sinai för manuskriptet granskning. NIH/NICHD tillhandahöll finansiering för detta projekt under bidrags nummer R21 HD095772-01A1. Dessutom stöddes R. Powell av medel från Institutionen för medicin, avdelningen för infektionssjukdomar, Icahn School of Medicine vid berget Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10 mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
