Summary
Her præsenterer vi en enkel og effektiv metode til at isolere levende meiotiske og post-meiotiske kimceller fra voksne muse testes. Ved hjælp af en lav-cytotoksicitet, violet-ophidset DNA bindende farvestof og fluorescens-aktiveret celle sortering, kan man isolere højt beriget spermatogene cellepopulationer for mange downstream applikationer.
Abstract
Isolering af meiotiske spermatocytter er afgørende for at undersøge molekylære mekanismer, der ligger til grund for meiose og spermatogenese. Selv om der er etableret celle isolation protokoller ved hjælp af Hoechst 33342 farvning i kombination med fluorescens-aktiveret celle sortering, det kræver celle sorteringer udstyret med en ultraviolet laser. Her beskriver vi en celle isolation protokol ved hjælp af DyeCycle Violet (DCV) pletten, en lav cytotoksicitet DNA bindende farvestof strukturelt ligner Hoechst 33342. DCV kan være begejstret for både ultraviolette og violette lasere, hvilket forbedrer fleksibiliteten i udstyr valg, herunder en celle sorterer ikke er udstyret med en ultraviolet laser. Ved hjælp af denne protokol, kan man isolere tre levende celler subpopulationer i meiotiske prophase jeg, herunder leptotene / zygotene, pachytene, og diplotene spermatocytter, samt post-meiotiske runde spermatider. Vi beskriver også en protokol til fremstilling af encellet suspension fra museekrilerne. Samlet set kræver proceduren en kort tid at gennemføre (4-5 timer afhængigt af antallet af nødvendige celler), hvilket letter mange downstream-applikationer.
Introduction
Spermatogenese er en kompleksproces,hvor en lille population af spermatogoniale stamceller opretholde kontinuerlig produktion af et stort antal sædceller i hele voksenlivet1,2. Under spermatogenese, dynamisk kromatin remodeling finder sted, når spermatogene celler gennemgå meiose til at producere haploid spermatids3,4,5. Isolering af meiotiske spermatocytter er afgørende for molekylær undersøgelse, og der er etableret flere forskellige tilgange til isolering af meiotiske spermatocytter, herunder sedimentationsbaseret adskillelse6,7 og fluorescensaktiv sortering (FACS)8,9,10,11,12,13 , 14,15,16,17. Disse metoder har dog tekniske begrænsninger. Mens sedimentering-baseret adskillelse giver et stort antal celler5,6,7, det er arbejdskrævende. Den etablerede FACS-baserede metode bruger Hoechst 33342 (Ho342) til at adskille meiotiske spermatocytter baseret på DNA-indhold og lysspydende egenskaber og kræver FACS cellesorterer udstyret med en ultraviolet (UV) laser8,9,10,11. Alternative FACS-baserede metoder kræver transgene muselinjer, der udtrykker lysstofproteiner, synkronisering af spermatogenese12eller cellefiksering og antistofmærkning, der ikke er kompatibel med isolering af levende celler13. Mens der er en anden alternativ metode ved hjælp af en celle-permeable DNA bindende farvestof, DyeCycle Grøn plet14,15,16,17, denne metode anbefales til isolering af spermatogene celler fra unge testikler. Derfor er der et kritisk behov for at udvikle en enkel og robust isolationsmetode for levende meiotiske spermatocytter, der kan anvendes på enhver musestamme i alle aldre, og som kan udføres ved hjælp af enhver FACS cellesortering.
Her beskriver vi sådan en længe søgt celle isolation protokol ved hjælp af DyeCycle Violet (DCV) pletten. DCV er en lav cytotoksicitet, celle-gennemtrængelig DNA bindende farvestof strukturelt ligner Ho342, men med en excitation spektrum flyttet mod det violette område18. Desuden har DCV et bredere emissionsspektrum i forhold til DCG. Således kan det være ophidset af både UV og violet lasere, som forbedrer fleksibiliteten af udstyr, så brugen af en FACS celle sorterer ikke er udstyret med en UV-laser. DCV-protokollen præsenteret her bruger to-dimensionel adskillelse med DCV blå og DCV rød, efterligne fordelen ved Ho342-protokollen. Med denne fordel giver vores DCV-protokol os mulighed for at isolere højt berigede kimceller fra de voksne testikler. Vi leverer en detaljeret gating protokol til at isolere levende spermatogene celler fra voksne mus testikler af en mus (fra to testikler). Vi beskriver også en effektiv og hurtig protokol til at forberede encellet suspension fra museealtikere, der kan bruges til denne celleisolering. Proceduren kræver en kort tid at fuldføre (forberedelse af encelle suspension - 1 time, farvning af farvestoffer - 30 min, og celle sortering - 2-3 timer: i alt - 4-5 timer afhængigt af antallet af nødvendige celler; Figur 1). Efter celleisolering kan en lang række downstream-applikationer, herunder RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq og cellekultur, afsluttes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne fra Udvalget for Institutionel Dyrepleje og -Anvendelse (protokol nr. IACUC2018-0040) på Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Opsætning af udstyr og reagens til fremstilling af testikelcelleaffjedring
- Hver enzymbestand klargøres i 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) og opbevares ved -20 °C. (Tabel1).
BEMÆRK: Forbered når som helst før eksperimentet. - En dag før forsøget: Coatopsamlingsrør (1,5 ml rør) med føtal kvægserum (FBS) ved 4 °C natten over.
- På eksperimentets dag: Indstil vandbadet til 37 °C.
- Forvarm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ved 37 °C og klargør 2 ml 1x dissociationsbuffer for hver prøve lige før brug (tabel 1) i 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Der fremstilles 2 ml dissociationsbuffer til to testikler. For dissociationsbufferopskriften henvises til tabel 1.
2. Dissektion af dyr og fremstilling af testikelcellesuspension
- Ofre en 8 uger gammel mandlig mus ved at forlade i et kuldioxidkammer i mindst 10 min.
- Fjern både testiklerne og placer den på en 60 mm petriskål indeholdende 2 ml iskoldt fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Fjern tunica albuginea fra testiklerne. Lidt sprede seminiferous tubuli ved forsigtigt at adskille med snævler.
- De halvniferøse tubuli overføres til en 100 mm petriskål med en ny dråbe iskold PBS, og seminiferøse tubuli udredes forsigtigt med faketter. Gentag denne vask 3 gange for at fjerne interstitielle celler så meget som muligt.
- Inkuber untangled seminiferous tubuli i et 15 ml rør indeholdende 2 ml dissociation buffer ved 37 °C i 20 min.
- Rør forsigtigt tubuline 20 gange med en 1000 μL mikropipette.
- Inkuber i 6 min. Gentag blid pipettering 20 gange.
- Inkuber i 3 min. Gentag blid pipettering 10 gange, indtil der ikke er synlige stykker tilbage.
- Der tilsættes 10 ml FACS-buffer til suspensionen. Centrifuge ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
- Gentag trin 2,9 to gange for at fjerne spermatozoer og så meget snavs som muligt.
3. Cellefarvning
- Opspørg cellepellet med 3 ml FACS-buffer (tabel 1), og cellesuspensionen filtreres gennem en 70 μm nyloncellestien i et 50 ml rør.
BEMÆRK: Det forventede celleudbytte er ca. 100 millioner celler pr. to testikler (fra en 8 uger gammel B6-mus af vildtypen). - Tæl cellenummeret og opdel 10% af cellerne i et nyt rør som den uhæmmede negative kontrol og lad på is.
- Der tilsættes 6 μL DCV-plet (den oprindelige koncentration er 5 mM) til den resterende cellesuspension og blandes godt. Den endelige koncentration er 10 μM, og kapaciteten er ca. 100 millioner celler.
- Inkuberes ved 37 °C i 30 minutter i mørke. Ryst forsigtigt cellesuspensionen hver 10.
- Efter inkubation uden vasketrin tilsættes 5 μL DNase I (beholdningskoncentrationen er 10 mg/ml) direkte til cellesuspensionen, og cellerne filtreres i et 5 ml FACS-rør gennem 35 μm nylonnetdækslet. Hold prøverne på is, indtil de sorteres.
4. Flow cytometri og eksperimentelle porte
- Forbered FACS celle sorterer. Sørg for, at FACS cellesortering er udstyret med excitation optik: Violet (405-nm) laser; Detektion optik: filter kombination af 450/50 bandpass [samme filter sæt 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for DCV-blå detektion] og 665/30 bandpass [samme filter sæt Allophycocyanin (APC) for DCV-rød detektion]. Her bruger vi Sony SH800S celle sorterer som et eksempel.
- Opret et nyt eksperiment, og konfigurer følgende arbejdsplots, der viser parametre, der skal optimeres: Klik på "Ny tæthed" på menulinjen "Regnearksværktøjer" for at oprette et fremadrettet scatter - område (FSC-A) vs. back scatter - område (BSC-A) tæthedsplot på en lineær skala. Klik på "Nyt histogram" for at oprette et DCV-blåt histogramplot på logaritmisk skala.
- Vortex den uindgrote negative kontrol (fra trin 3.2) og indlæs prøven.
- Klik på "Start" og "Optag" for at begynde at behandle den ikke-indgroede prøve. Mens prøven kører, skal du klikke på "Indstillinger for detektor og tærskel" for at optimere FSC- og BSC-spændingerne ved at justere både pmt-spændingerne (photomultiplier tube) op eller ned for at placere de uopgroede celler på skalaen på FSC/BSC-plottet.
- Juster PMT-spændingen op og ned på "FL1: DAPI", mens prøven kører for at finde placeringen af den DCV-negative population i det første årti af det DCV-blå histogramlogaritmiske plot (figur 2A). Når PMT-spændingsjusteringen er fuldført, skal du klikke på "Stop" for at losse den uopnåede prøve.
- Prøven (fra trin 3.5) vortex vortex og indbelast prøven.
- Klik på "Næste tube" for at oprette et nyt regneark til den DCV-farvede prøve. og klik på "Start" og "Optag" for at erhverve den DCV-farvede prøve, ≥ 1 x 106 hændelser. Tilføj følgende arbejdsområder: Klik på "Ny tæthed" på menulinjen "Regnearksværktøjer" for at oprette et FSC-H -område (højde) vs. FSC-W (bredde) tæthedsplot på en lineær skala. Klik på" New Density" for at oprette et DCV-blåt vs. DCV-rød tæthedsplot på en lineær skala. Når du har ≥ 1 x 106 hændelser, skal du klikke på "Stop "og fjerne prøven.
- På FSC-A vs. BSC-A-tæthedsplottet skal du klikke på "Polygon" på menulinjen "Plot Tools" for at tegne en stor port "Celler" for at medtage de fleste celler og udelukke små snavs (Figur 2B). Anvend porten "Cells" på FSC-H vs. FSC-W tæthed plot. Klik på "Rektangel" for at tegne en "Single Cells" port for at udelade ikke-enkelte celler (Figur 2C).
- Anvendporten " Single Cells " på DCV-blue vs. DCV-rød tæthedsplot, og juster skalaen for at registrere en udvidet profil som vist i figur 2D. Klik på "Polygon" på menulinjen "Plot Tools" for at tegne en "DCV" port for at udelade de uhæmmede celler og sidepopulationen (Figur 2D).
- Anvend "DCV" porten på DCV-blå histogramplot på en lineær skala. De tre store toppe refererer til forskelligt DNA-indhold: 1C, 2C og 4C (Figur 2E).
- Klik på "New Density" for at oprette et DCV-blåt vs. DCV-rød tæthedsplot på en lineær skala og anvende "DCV" gate til at udføre tilbage gating fra figur 2E for at finde 1C og 4C populationer ( Figur2F). Klik på "Ellipse" for at tegne en port på 1C-populationen, som ligger inden for et kondenseret område (gate 1C). Klik på "Polygon" for at tegne en port på 4C-populationen, som er en kontinuerlig kurve (gate 4C).
- Klik på "New Density" for at oprette et DCV-blåt vs. DCV-rød tæthedsplot på en lineær skala og anvende "4C"-porten. justere skalaen for at zoome ind og klikke på "Polygon" for at tegne en "4C_1" port for mere præcis udvælgelse (Figur 2G).
- Klik på "Ny tæthed" for at oprette et nyt FSC-A vs. BSC-A-tæthedsplot på en lineær skala og anvende "4C_1" gate. Der vil være tre berigede populationer adskilt efter størrelse svarende til leptotene (L) /zygotene (Z), pachytene (P) og diplotene (D) spermatocytter. Klik på "Polygon" eller "Ellipse" for at tegne 3 porte: "L/Z", "P" og "D" baseret på den voksende størrelse (Figur 2H).
- Klik på "New Dot Plot" for at oprette en DCV-blå vs DCV-rød farve prik på en lineær skala til at anvende gate og sikre de tre populationer er i en kontinuerlig rækkefølge inden for "4C_1" gate (Figur 2I).
- På samme måde skal du for 1C-populationen klikke på "New Density" for at skabe et nyt FSC-A vs. BSC-A-tæthedsplot på en lineær skala og anvende "1C"-port, skal du vælge den samlede størrelse af celler som ren rund spermatidpopulation, og klik på "Ellipse" for at tegne en "RS" port (Figur 2J).
5. Sort mandlige kimcelle delpopulationer
- Der klargør 1,5 ml rør, der indeholder 500 μL 50% FBS til celleopsamling, og indlæs opsamlingsrøret i opsamleren, og klik på "Load Collection".
- Klik på "Next Tube", "Start", "Record" og "Sortér start". For at bruge et tovejssystem, der gør det muligt at sortere to populationer af interesse på samme tid i opsamlingsenheden, skal du følge parvise kombinationer: leptotene (L) /zygotene (Z) og pachytene (P) spermatocytter baseret på L/Z og P back-gates; Runde spermatider (RS) og diplotene (D) spermatocytter baseret på RS og D back-gates.
- Mens prøven kører, skal du justere strømningshastigheden til ~ 3000 hændelser/s for at få den mest effektive sortering.
6. Renhedsanalyse af sorterede celler
- Saml ≥ 10.000 celler/hver population. Udfør celle immunostaining for at bekræfte delpunktet.
- Centrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C kasseres og kassér forsigtigt supernatanten, hvor der opbevares ca. 110 μL væske i bunden af røret.
- Tag en 10 μL dråbe cellesuspension for at observere under mikroskop og evaluere oversigtscellens morfologi og tal.
- Påfør 100 μL cellesuspension på hver af prøvekammerdiasene (se Materialetabel),og kamrene påles på Cytospin.
- Drej prøverne ved 30 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Tegn en cirkel rundt om cellen med en hydrofob pen. Tør dias på laboratoriebænken i et par minutter ved stuetemperatur.
- Drop 50 μL PBS i cirklen af diaset og tryk af.
- Der tilsættes primær antistofopløsning (Fortynde primære antistoffer med 5% Donkey Serum i PBS med 0,02% Polysorbat 20) i cirklen af diaset og inkuberes ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: For at bedømme undertage af meiotiske spermatocytter, SYCP3 blev opdaget, som er en markør for meiotiske kromosom akser, og γH2AX, som er en markør for DNA-skader svar. (For antistof arbejdskoncentration henvises til materialetabel). - Tryk den primære antistofopløsning af diasene.
- Drop 50 μL PBS i cirklen af diaset og tryk af. Gentag én gang.
- Der tilsættes sekundær antistofopløsning (fortyndede sekundære antistoffer i PBS med 0,02% Polysorbat 20) i cirklen af diaset og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time i mørke.
- Drop 50 μL PBS i cirklen af diaset og tryk af. Gentag én gang.
- Tilsæt 50 μL DAPI (beholdningskoncentrationen er 0,1 μg/ml) plet i 5 min. og der skal trykkes af.
- Tilføj 1-2 dråber monteringsmedier på diasene. Dæk forsigtigt monteringsmediet med et dækglas, og tryk forsigtigt på dækslet for at fjerne ekstra monteringsmedier og luftboble. Diasene er klar til mikroskopievaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt resultat af denne sorteringsprotokol er vist i figur 3. Den samlede sorteringstid for to testikler (en mus) er normalt omkring 3 timer, hvilket afhænger af koncentrationen af cellesuspension og sorteringshastigheden. Efter sortering bekræftes renheden af spermatocytter ved immunstaining af SYCP3 og γH2AX (Figur 3A). Den repræsentative renhed af sorterede L/Z-fraktioner, P, D spermatocytfraktioner er på henholdsvis 80,4 %, 90,6 % og 87,6 % (figur 3C). Vi har fastlagt undertrinene ud fra de kriterier, vi offentliggjorde tidligere19. Kort, i leptoten og zygotene fase, synapsis mellem homologe kromosomer er ufuldstændig, hvilket er angivet ved tynde tråde af SYCP3 farvning. Brede γH2AX domæner er observeret i hele den nukleare kromatin på grund af programmeret DNA dobbelt-streng pauser. I pachytene fase, homologe kromosomer har fuldstændig synkroniseret, og γH2AX specifikt ophobes på køn kromosomer. I diplotene fase, homologe kromosomer gradvist gennemgå desynapsis. RS's renhed bekræftes ved kernefarvning med DCV (Figur 3B). RS kan præcist bedømmes med DNA-farvning: et unikt DAPI-intenst kroocenter omgivet af euchromatin; eller kombinere med specifikke markører, såsom Sp56, der er udtrykt i udviklingen af akrosomal granulat af spermatid og histone variant H1T, der er stærkt udtrykt i kernen efter midten af pachytene fase (Figur 3B).
RS renhed er omkring 90,1% efter sortering (Figur 3C). Stikprøvestørrelsen af renhedsanalysen er over 1.000 celler for hvert eksperiment. renheden af L/P- og D-populationer beregnes i gennemsnit ud fra 6 uafhængige forsøg renheden af P- og RS-populationer er i gennemsnit ud fra 3 uafhængige forsøg. Disse isolerede cellers levedygtighed er normalt over 95 % (figur S1). Det samlede udbytte af hver fraktion fra en enkelt voksen mus er estimeret og opført i fig. 3C, hvilket giver tilstrækkelige celler til forskellige downstream-analyser. For nylig har vi brugt denne protokol til at isolere wild-type pachytene spermatocytter til ChIP-seq analyse20,21.
| Reagens | Ingrediens | Koncentrationen af aktier | Volumen |
| (HBSS-base) | |||
| Dissociation Buffer | kr. | - | 2 ml |
| (DMEM-base) | Fbs | - | 40 μl |
| Hyaluronidase | 100 mg/ml | 30 μl | |
| DNase I | 10 mg/ml | 50 μl | |
| Kollagen type I | 100 mg/ml | 40 μl | |
| Rekombinant Kollagen | 14000 enhed/ml | 100 μl | |
| FACS-buffer | Pbs | - | 980 ml |
| (PBS-base) | Fbs | - | 20 ml |
Tabel 1: Reagensopskrift. Dissociationsbufferen skal forberedes lige før brug. Prewarm DMEM før du begynder dissektion. Enzymlagrene kan fremstilles når som helst før forsøget og opbevares ved -20 °C. FACS-bufferen skal vakuumfiltreret og opbevares ved 4 °C. forvarm til stuetemperatur før brug.
Figur 1: Arbejdsgang af murine spermatogene celler isolering på DCV-baseret sortering. Dette billede illustrerer den generelle procedure, fra vævseksociering til FACS-sortering, til høst af isolerede spermatogene celler inden for en dag. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: FACS-analyse af voksne murine testikelceller baseret på DCV fluorescens og lysspisting. (A) Erhvervet uhæmmede celler i det første årti af en DCV-blå histogram plot (venstre side af den røde bjælke). b) c )Snavsog ikke-enecellede, der ikke er omfattet af lysspittering. d)Ikke-indgroet udelukkelse af celler og sidepopulationer på grund af DCV-fluorescens. e) bestemmelse af DNA-indhold baseret på DCV-blå fluorescens. Venstre top (grøn) og højre top (pink) svarer til 1C og 4C populationer. f) Gating på 1C og 4C testikelpopulationer baseret på DCV-blå/DCV-rød fluorescens. g) Præcis gating på testikelpopulationer på 4C. h)Baggæring af Gate 4C fra DCV-grunden på et FSC/BSC-område. Baseret på regioner med minimal overlapning på FSC/BSC-plottet oprettes L/Z-, P- og D-portene for at berige deres respektive spermatocytpopulationer. (I) Farve prik plot viser L / Z, P og D populationer er i kontinuerlig rækkefølge inden gate 4C. (J) Back-gating af Gate 1C fra DCV plot på en FSC / BSC plot. RS gate blev oprettet for at berige runde spermatid befolkning med ensartet størrelse, hvilket resulterer i større renhed af populationer under sortering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative resultatbilleder og statistik over sædatogene celler, der er fremkommet ved sortering. (A) Immunofluorescens karakterisering af sorterede spermatocytter. Øvre panel: DCV farvning viser kernen mønster af de levende spermatocytter lige efter sortering; L/Z (leptotene/zygotene), P (pachytene) og D (diplotene). Nederste panel: Bekræftelse af meiotiske delatrin for hver population ved immunstaining for SYCP3 (grøn) og γH2AX (rød). (B) Repræsentativt DCV-billede, der viser kernen mønster af RS. Skalastænger: 50 μm (øvre paneler) og 10 μm (nederste forstørrede paneler). Højre Paneler: Immunofluorescens bekræftelse af runde spermatider farves med Sp56 og H1T. (C) Renheden af L/Z, P og D blev bekræftet ved immunstaining, stikprøvestørrelsen var over 1 000 celler for hvert uafhængigt eksperiment i alt 6 uafhængige forsøg. RS renhed blev bekræftet ved kerne farvning med i alt 3 uafhængige eksperimenter. Det samlede cellenummer for testikelcellesuspensionen fra en 8 uger gammel WT B6-mus var omkring 100 millioner celler før sortering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: Levedygtigheden af isolerede pachyten spermatocytter. Et repræsentativt billede viser celle levedygtigheden af isolerede pachytene spermatocytter (Rød: PI; Blå: DCV). PI kunne ikke kombineres med DCV under sortering. Men under mikroskop, dcv-røde signal var ganske lav; Derfor blev PI-positive døde celler let skelnes fra andre levende celler. Rentabiliteten er normalt over 95%. Skalastænger: 10 μm. Klik her for at downloade dette tal.
Figur S2: Ufuldstændig dissociation eller snavs forstyrrer gating. A-populationen (rød cirkel) indeholder snavs og polymer af spermatider (angivet med pil). Jo større A befolkning vil krydse med B-population (gul cirkel) og i sidste ende forurene 4C befolkning. Skalastænger: 200 μm. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en praktisk og enkel protokol til at isolere subpopulationer af spermatocytter og spermatids fra en enkelt voksen mandlig mus. For at sikre reproducerbarheden af denne protokol er der nogle kritiske trin, der kræver opmærksomhed. Før enzym fordøjelsen, vaske trin har til formål at fjerne interstitielle celler; efter fordøjelsen, dette trin hjælper med at fjerne spermatozoer og snavs. Vask/centrifugering 3 gange er vigtigt. I vores dissociation buffer opskrift, kombinationen af flere forskellige enzymer letter dissociation af testikler i enkelt-celle suspension uden overdreven celleskade. Forsigtigt pipettering for at undgå at forårsage luftbobler hjælper også med at beskytte cellereintegriteten. Kontroller cellesuspensionen under et mikroskop efter dissociation for at sikre, at suspensionen opnår etcelleniveau. Ufuldstændig dissociation eller snavs forurening fra overdreven fordøjelse vil påvirke renheden af sorterede celler; som vist i figur S2indeholder den opretstående population snavs og tetramer af spermatider. DCV farvning kræver inkubation i mørke og ingen vask bagefter.
For at foretage fejlfinding af potentielle problemer med gating og back-gating af spermatocyt-subpopulationer anbefaler vi at bruge en synkroniseret vild typemus til at finde et bestemt stadie af spermatocytter22,23,24. Det er også værd at bemærke, at nogle knockout mus stammer med spermatogenese anholdelse fænotyper kan have ualmindelige DCV profiler, fordi de mangler nogle delpopulationer. Korrekt wildtype kontrol anbefales kraftigt i dette tilfælde. Desuden kan denne protokol potentielt anvendes på voksne mus i alle aldre. Men alderen på den eksperimentelle mus kan være en confounding faktor på grund af den variable andel af kimceller.
I årenes løb er der udviklet adskillige protokoller til rensning af kimceller. Som en af de mest populære metoder adskiller STA-PUT hastighedssedimentering kimceller ved BSA-gradienten og giver et godt udbytte af intakte kimceller6,7. STA-PUT kræver imidlertid ikke kun specielle anordninger, der måske ikke er let tilgængelige for mange laboratorier, men som også er tidskrævende og arbejdskrævende at udføre i et kølerum ved 4 °C. I modsætning til STA-PUT, som er egnet til storstilet adskillelse, kan denne FACS-baserede metode give høj renhed og præcis brøk til et lille eksperiment. En storstilet sortering ved hjælp af vores protokol er mulig, men vil forlænge sorteringstiden betydeligt og kan kompromittere cellernes levedygtighed. STA-PUT er derfor stadig en praktisk mulighed, når der er behov for et stort antalceller 5,25,26.
I sammenligning med den tidligere FACS metodebaseretpå Ho342 farvefarvning 8,9,10,11, vores protokol udnytter DCV, som har en bredere excitation spektrum og kan anvendes på de fleste nuværende FACS sorteringsanlæg udstyret med en UV eller 405 nm violet laser18. Selv om der er en anden protokol ved hjælp af DCG14,15,16,17, forskellen mellem vores protokol og DCG-protokollen er, at vores DCV-protokol bruger to-dimensionel adskillelse med DCV blå og DCV rød, efterligne fordelen ved Ho342-protokollen. Med denne fordel giver vores DCV-protokol os mulighed for at isolere højt berigede kimceller fra voksne testikler. DCG-protokollen anvender ikke todimensionel adskillelse og anbefales til isolering af kimceller fra unge mus. Den to-dimensionelle adskillelse kan have bedre opløsning til at adskille substages af spermatocytter. Men vores metode er stadig ude af stand til at isolere leptotene og zygotene spermatocytter separat, samt "2C" celletyper, herunder spermatogoni, preleptotene spermatocytter, og sekundære spermatocytter.
Da det brede emissionsspektrum af DCV-plet forårsager utætte til andre kanaler, kan de fleste af cellernes levedygtighedfarvestoffer som PI og 7AAD ikke kombineres på grund af falske positive signaler. Andre celle levedygtighed farvestoffer med emission i langt røde eller nær-infrarøde kanaler kan være værd at prøve i fremtiden. Men det er vores erfaring, sorterede celler viser normalt ≥ 95% levedygtighed efter 2 timers FACS sortering(Figur S1),hvilket er tilstrækkeligt til downstream analyse.
Sorterede celler fra vores procedure kan bruges til forskellige downstream-eksperimenter, herunder næste generations sekventeringsanalyse (RNA-seq, ATAC-seq og ChIP-seq). Celler, der er fremkoment her, kan også anvendes til kortsigtetkultur 27. Afslutningsvis giver vi en enkel, men effektiv protokol, herunder en times en-celle suspension forberedelse procedure og den detaljerede gating strategi for FACS baseret på DCV farvefarvning, som er egnet til små sædceller celleisolering og kan hurtigt vedtages af mange efterforskere, selv flow cytometri begyndere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer af Namekawa, Yoshida og Maezawa laboratorier for deres hjælp; Katie Gerhardt til redigering af manuskriptet; Mary Ann Handel for deling af H1T antistof, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometri Core til deling af FACS udstyr støttet af NIH S10OD023410; Tilskud til videnskabelig forskning (KAKENHI; 17K07424) til T.N. Lalor Foundation Postdoctoral Fellowship til AS; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) til S.Y.; forskningsprojektet Grant af Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT)-Supported Program for The Private University Research Branding Project (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) og Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) til S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 til S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R.
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
