Summary
여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.
Abstract
메이오성 정자 세포의 격리는 meiosis 및 정자 발생의 근본적인 분자 기계장치를 조사하기 위하여 필수적입니다. Hoechst 33342를 사용하여 세포 격리 프로토콜이 확립되어 있지만 형광 활성화 셀 선별과 함께 염색되지만 자외선 레이저가 장착 된 세포 선별기가 필요합니다. 여기서 우리는 염료 자전거 바이올렛 (DCV) 얼룩을 사용하여 세포 격리 프로토콜을 설명, 낮은 세포 독성 DNA 결합 염료는 구조적으로 Hoechst 33342와 유사. DCV는 자외선과 보라색 레이저 모두에 의해 흥분 될 수 있으며, 자외선 레이저가 장착되지 않은 셀 선별기를 포함하여 장비 선택의 유연성을 향상시킵니다. 이 프로토콜을 사용하여, 하나는 렙토텐 / zygotene, pachytene 및 디플롯렌 정자 세포뿐만 아니라, 메이오틱 한 후 정자를 포함하여 메이오틱 프PHASE I에서 3 개의 라이브 셀 하위 집단을 격리 할 수 있습니다. 우리는 또한 마우스 고환에서 단세포 현탁액을 준비하는 프로토콜을 설명합니다. 전반적으로 이 절차는 완료하는 데 짧은 시간(필요한 셀 수에 따라 4-5시간)이 필요하며, 이는 많은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 합니다.
Introduction
정자 발생은 정자 줄기 세포의 작은 인구가 성인 생활1,2에걸쳐 많은 수의 정자의 지속적인 생산을 유지하는 복잡한 과정이다. 정자 발생 동안, 동적 크로마틴 리모델링은 정자 세포가 혈전증을 유발하여3, 4,5를생성할 때 일어난다. 메이오혈 정자 세포의 분리는 분자 조사에 필수적이며, 퇴적물 계분리6,7 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)8,9,10,11,12,13,14, 14,16, 16, 16, 16, 16을포함하여 메이오틱 정자 세포를 분리하는 몇 가지 다른접근법이확립되었습니다. 그러나 이러한 방법에는 기술적 한계가 있습니다. 침전계 분리는 다수의세포를5,6,7을산출하지만, 노동집약적이다. 설립된 FACS 기반 방법은 Hoechst 33342(Ho342)를 사용하여 DNA 함량 및 광 산란 특성에 따라 메이오틱 정자세포를 분리하고 자외선(UV) 레이저8,9,10,11을갖춘 FACS 세포 선별기가 필요합니다. 대체 FACS 기반 방법은 생동성 단백질을 발현하는 형질전환 마우스 라인, 정자발생(12)의동기화, 또는 살아있는세포(13)의분리와 호환되지 않는 세포 고정 및 항체 라벨링을 필요로 한다. 세포 투과성 DNA 결합 염료, 염료 자전거 녹색 얼룩14,15,16,17을사용하는 또 다른 대안 방법이 있지만, 이 방법은 청소년 고환으로부터 정자 유발 세포의 분리를 위해 권장된다. 따라서, 모든 연령의 마우스 변형에 적용할 수 있고 어떤 FACS 세포 선별기를 사용하여 수행될 수 있는 살아있는 메이오성 정자 세포에 대한 간단하고 강력한 격리 방법을 개발할 필요가 있다.
여기서 우리는 염료 자전거 바이올렛 (DCV) 얼룩을 사용하여 이러한 오랫동안 추구 된 세포 격리 프로토콜을 설명합니다. DCV는 호342와 구조적으로 유사하지만 흡개 스펙트럼이 바이올렛범위(18)로이동한 낮은 세포 독성, 세포 투과성 DNA 결합 염료이다. 또한 DCV는 DCG에 비해 광범위한 배기가스 스펙트럼을 가지고 있습니다. 따라서 UV와 바이올렛 레이저가 모두 흥분할 수 있어 장비의 유연성을 향상시켜 UV 레이저가 장착되지 않은 FACS 셀 선별기를 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 DCV 프로토콜은 DCV 블루 및 DCV 빨간색으로 2차원 분리를 사용하여 Ho342 프로토콜의 이점을 모방합니다. 이러한 이점을 통해 DCV 프로토콜을 사용하면 고농축 세균 세포를 성인 고환으로부터 분리할 수 있습니다. 우리는 한 마우스 (두 개의 고환에서) 한 마우스의 성인 마우스 고환에서 살아있는 정자 세포를 격리하기 위하여 상세한 게이팅 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 이 세포 격리를 위해 사용될 수 있는 마우스 고환에서 단세포 현탁액을 준비하는 효율적이고 빠른 프로토콜을 기술합니다. 절차는 완료하는 짧은 시간이 필요합니다 (단일 세포 현탁액의 준비 - 1 시간, 염색 염색 - 30 분 및 셀 정렬 - 2-3 시간 : 필요한 세포의 수에 따라 총 - 4-5 시간; 그림 1). 세포 격리에 따라 RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq 및 세포 배양을 포함한 광범위한 다운스트림 응용 프로그램을 완료할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침을 따릅니다 (프로토콜 번호. IACUC2018-0040) 신시내티 아동 병원 의료 센터에서.
1. 고환 세포 현탁액의 준비를위한 장비 및 시약 설정
- 각 효소 육수를 1x 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로준비하고 -20°C(표1)에 보관하십시오.
참고: 실험 전에 언제든지 준비합니다. - 실험 하루 전: 하룻밤 4°C에서 태아 소 혈청(FBS)을 가진 튜브 수집 튜브(1.5mL 튜브).
- 실험 당일: 수조를 37°C로 설정합니다.
- 37°C에서 미리 따뜻한 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)는 15mL 원심분리기 튜브에서 사용하기직전 각 시료에 대해 2mL의 1x 해리 버퍼를 준비한다.
참고: 2mL 해리 버퍼는 두 개의 고환에 대해 준비됩니다. 해리 버퍼 레시피의 경우 표 1을참조하십시오.
2. 고환 세포 현탁액의 동물 해부 및 준비
- 8주된 수컷 마우스를 최소 10분 동안 이산화탄소 실에 남겨두어 희생하십시오.
- 얼음-차가운 인산염 완충식식염(PBS)이 포함된 60mm 페트리 접시에 고환과 배치를 모두 제거합니다.
- 고환에서 튜니카 알부진을 제거합니다. 반열구를 부드럽게 집게로 분리하여 약간 분산시다.
- 반열구를 100mm 페트리 접시에 담아 얼음차가운 PBS를 새롭게 한 방울로 옮기고, 반열기구튜벌레를 집게로 부드럽게 풀어보냅니다. 이 세척을 3회 반복하여 간질 세포를 가능한 한 많이 제거합니다.
- 37°C에서 2mL의 해리 버퍼를 20분 동안 포함하는 15mL 튜브에서 얽힌 반열구를 배양한다.
- 1000 μL 마이크로파이프를 사용하여 튜벌레를 20번 부드럽게 피펫합니다.
- 6 분 동안 인큐베이션하십시오. 부드러운 파이펫을 20번 반복합니다.
- 3 분 동안 배양하십시오. 보이는 청크가 남아 있지 않을 때까지 부드러운 파이펫팅을 10번 반복합니다.
- 서스펜션에 10mL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 300 x g의 원심 분리기와 상류부를 폐기하십시오.
- 정자와 가능한 한 많은 파편을 제거하기 위해 2.9 단계를 두 번 반복하십시오.
3. 셀 염색
- FACS버퍼(표 1)의3mL로 세포 펠릿을 다시 중단하고 70 μm 나일론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50mL 튜브로 필터링합니다.
참고: 예상 세포 수율은 2개의 고환 당 대략 1억 개의 세포입니다 (8 주 된 B6 야생 형 마우스에서). - 세포 수를 계산하고 얼룩이 없는 부정적인 대조군으로 세포의 10%를 새로운 튜브로 분할하고 얼음위에 둡니다.
- 남은 셀 현탁액에 DCV 얼룩 6 μL(원래 농도는 5mM)을 넣고 잘 섞는다. 최종 농도는 10μM이며 용량은 약 1억 개의 세포입니다.
- 어둠 속에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 10분마다 셀 서스펜션을 부드럽게 흔들어 줍니다.
- 인큐베이션 후, 세척 단계 없이, 직접 5 μL의 DNase I(육주 농도는 10 mg/mL)를 세포 현탁액에 추가하고 35 μm 나일론 메쉬 캡을 통해 5mL FACS 튜브로 세포를 필터링합니다. 샘플을 정렬할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
4. 유동 세포측정및 실험문
- FACS 셀 선별기를 준비합니다. FACS 세포 선별기가 흥분 광학 기능이 장착되어 있는지 확인: 바이올렛 (405-nm) 레이저; 감지 광학: 450/50 밴드패스의 필터 조합 [DCV-blue 검출을 위한 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)의 동일한 필터 세트] 및 DCV-레드 감지를 위한 665/30 밴드패스[알로피코시아니안(APC)의 동일한 필터 세트]. 여기에서소니 SH800S 셀 선별기를 예로 들어 보겠습니다.
- 새 실험을 만들고 최적화할 매개 변수를 표시하는 다음 작업 플롯을 설정합니다:"워크시트 도구"메뉴 표시줄에"새 밀도"를클릭하여 전방 분산영역(FSC-A) vs. 백 분산 – 영역(BSC-A) 밀도 플롯을 선형 스케일로 만듭니다. "새로운히스토그램"을클릭하여 로그자리믹 스케일에 대한 DCV-blue 히스토그램 플롯을 만듭니다.
- 얼룩이 없는 음극제어(3.2단계에서)를 간략하게 소용돌이치며 시료를 적재합니다.
- "시작"및"기록"을클릭하여 스테인처리되지 않은 샘플 처리를 시작합니다. 샘플이 실행되는 동안"검출기 및 임계값 설정"을클릭하여 광증 튜브(PMT) 전압을 위아래로 조정하여 FSC/BSC 플롯의 척도에 스테인드셀을 배치하여 FSC 및 BSC 전압을 최적화합니다.
- 샘플이 DCV-블루 히스토그램 로사직플롯(그림 2A)의첫 10년 동안 DCV-음수 집단의 위치를 찾기 위해 실행되는 동안PMT전압을 위아래로 조정합니다. PMT 전압 조정을 완료한 후"중지"를클릭하여 얼룩진 샘플을 언로드합니다.
- 샘플을 간략하게 소용돌이 (단계 3.5에서) 샘플을로드합니다.
- "다음튜브"를클릭하여 DCV 염색 된 샘플에 대한 새로운 워크 시트를 만듭니다. DCV 염색 된 샘플을 획득하려면"시작"과"레코드"를클릭하고 1 x 106 이벤트를 ≥ 기록합니다. 다음 작업 플롯 추가:"워크시트 도구"메뉴 막대에"새 밀도"를클릭하여 선형 배율에서 FSC-H(높이) 대 FSC-W(너비) 밀도 플롯을 만듭니다. "새밀도"를클릭하여 선형 축척에서 DCV-blue 대 DCV-적색 밀도 플롯을 만듭니다. 1 x 106 이벤트를 ≥ 녹화한 후"중지"를클릭하고 샘플을 언로드합니다.
- FSC-A 대 BSC-A 밀도 플롯에서"플롯 도구"메뉴 막대에"다각형"을클릭하여 대부분의 세포를 포함하고 작은 파편을 배제합니다(그림2B). 게이트"셀"을FSC-H 대 FSC-W 밀도 플롯에 적용합니다. "사각형"을클릭하여"단일 셀"게이트를 그리면 단일 셀이 아닌 셀(그림2C)을제외합니다.
- "단일셀"게이트를 DCV-블루 대 DCV-적밀도 플롯에 적용하고 도 2D에표시된 확장 된 프로파일을 캡처하는 스케일을 조정합니다. "다각형"을클릭 "플롯 도구" 메뉴 막대는"DCV"게이트를 그리는 것은 스테인드 셀과 측면 모집단을 제외(그림2D).
- "DCV"게이트를 선형 스케일로 DCV-블루 히스토그램 플롯에 적용합니다. 3개의 주요 봉우리들은 1C, 2C 및 4C(그림2E)와같은 다른 DNA 함량을 지칭한다.
- "새로운밀도"를클릭하여 선형 척도에서 DCV-blue 대 DCV-적색 밀도 플롯을 만들고 도 2E에서 다시 게이팅을 수행하여 1C 및 4C 모집단(그림2F)을찾으려는"DCV"게이트를 적용합니다. "타원"을클릭하여 응축 된 영역 (게이트 1C) 내에있는 1C 인구에 게이트를 그립니다. "다각형"을클릭하여 연속 곡선(게이트 4C)인 4C 모집단의 게이트를 그립니다.
- 선형 축척에서 DCV-블루 대 DCV-적색 밀도 플롯을 만들고 "4C" 게이트를 적용하려면"새 밀도"를클릭합니다. 확대하여"다각형"을클릭하여 보다 정밀한 선택을 위해 "4C_1" 게이트를그립니다(그림 2G)를확대하여 클릭합니다.
- "새밀도"를클릭하여 선형 축척으로 새로운 FSC-A 대 BSC-A 밀도 플롯을 만들고 "4C_1" 게이트를 적용합니다. 렙토텐(L)/zygotene(Z), 파시텐(P) 및 디플롯텐(D) 정자세포에 해당하는 크기로 분리된 3개의 농축된 인구가 있을 것이다. "다각형"또는"타원"을클릭하여 3 개의 게이트를 그립니다 : "L / Z", "P"및 "D"는 성장하는 크기에 따라(그림 2H).
- "새로운도트 플롯"을클릭하여 선형 스케일에서 DCV-blue 대 DCV-빨간색 도트 플롯을 생성하여 게이트를 적용하고 세 모집단이 "4C_1" 게이트 내에서 연속 순서를 유지하도록 합니다(그림2I).
- 마찬가지로, 1C 인구의 경우"새로운 밀도"를클릭하여 선형 척도에 새로운 FSC-A 대 BSC-A 밀도 플롯을 만들고 "1C" 게이트를 적용하고, 순수한 둥근 정자 집단으로 세포의 통합 크기를 선택하고 "타원"을클릭하여"RS" 게이트(그림2J)를그립니다.
5. 남성 세균 세포 하위 인구 분류
- 셀 수집을 위해 500 μL 50% FBS가 포함된 1.5mL 튜브를 준비하고 수집튜브를 수집체에 로드하고"로드 컬렉션"을 클릭합니다.
- 클릭 "다음 튜브","시작","기록" 및"정렬 시작". 관심있는 두 집단을 수집 장치로 동시에 정렬 할 수있는 양방향 시스템을 사용하려면 L / Z 및 P 백 게이트를 기반으로 렙토텐 (L) / zygotene (Z) 및 pachytene (P) 정자 세포와 같은 쌍별 조합을 따르십시오. 둥근 정자 (RS) 및 디플롯데네 (D) RS와 D 백 게이트에 따라 정자.
- 샘플이 실행되는 동안 유량을 ~3000 이벤트/s로 조정하여 가장 효율적인 정렬을 얻습니다.
6. 정렬 된 세포의 순도 분석
- 10,000개의 세포/각 집단을 ≥ 수집합니다. 서브 스테이지를 확인하기 위해 세포 면역 염색을 수행합니다.
- 4°C에서 5분 동안 300 x g의 원심분리기와 조심스럽게 열판기를 폐기하여 튜브 바닥에 있는 액체의 약 110 μL을 유지합니다.
- 현미경으로 관찰하고 개요 세포 형태와 수를 평가하기 위해 세포 현탁액의 10 μL 방울을 가져 가라.
- 각 샘플 챔버 슬라이드(재료 표참조)에 셀 서스펜션 100μL을 적용하고 챔버를 Cytospin에 로드합니다.
- 실온에서 5 분 동안 30 x g에서 샘플을 회전시. 소수성 펜으로 셀 주위에 원을 그립니다. 실온에서 몇 분 동안 실험실 벤치에 건조 슬라이드.
- 슬라이드의 원에 PBS의 50 μL을 드롭하고 탭오프합니다.
- 슬라이드의 원에 1 차 항체 용액 (PBS에서 5 % 당나귀 혈청을 0.02 % 폴리소르 바테 20으로 희석)을 슬라이드의 원에 넣고 하룻밤 사이에 4 ° C에서 배양하십시오.
참고: 메이오성 정자 세포의 하위 단계를 판단하기 위해, SYCP3는 DNA 손상 반응의 마커인 메이오성 염색체 축및 γH2AX의 마커인 검출되었다. (항체 작업 농도의경우 재료 표참조)를 참조하십시오. - 슬라이드에서 기본 항체 용액을 탭합니다.
- 슬라이드의 원에 PBS의 50 μL을 드롭하고 탭오프합니다. 한 번 반복합니다.
- 슬라이드의 원에 이차 항체 용액(PBS에서 이차 항체를 0.02% 폴리소르바테 20으로 희석)하고 어두운 실내 온도에서 1시간 동안 배양한다.
- 슬라이드의 원에 PBS의 50 μL을 드롭하고 탭오프합니다. 한 번 반복합니다.
- DAPI의 50 μL을 추가 (재고 농도는 0.1 μg / mL) 5 분 동안 얼룩을 탭.
- 슬라이드에 장착 용지 1-2 방울을 추가합니다. 장착 용지를 커버 유리로 조심스럽게 덮고 커버 유리를 부드럽게 눌러 추가 장착 매체와 기포를 제거합니다. 슬라이드는 현미경 평가를 위해 준비됩니다.
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Representative Results
이 정렬 프로토콜의 대표적인 결과는 그림 3에표시됩니다. 두 고환 (1 마우스)의 총 정렬 시간은 일반적으로 약 3 시간, 셀 서스펜션의 농도 및 선별 속도에 따라 달라집니다. 선별 후, 정자 세포의 순도는 SYCP3 및 γH2AX(도 3A)의면역 염색에 의해 확인된다. 정렬된 L/Z, P, D 정자세포 분획의 대표적인 순도는 각각 약 80.4%, 90.6%, 87.6%이다(그림3C). 이전에19이전에게시한 기준에 따라 하위 스테이지를 결정했습니다. 간략하게, 렙토텐과 zygotene 단계에서, 동종 염색체 사이의 시냅스는 불완전하며, 이는 SYCP3 염색의 얇은 실로 표시됩니다. 광범위한 γH2AX 도메인은 프로그래밍된 DNA 이중 가닥 휴식으로 인해 핵 크로마틴 전체에 걸쳐 관찰된다. 파시텐 단계에서, 동종 염색체는 완전히 시냅스하고, γH2AX는 특히 성 염색체에 축적됩니다. 디플롯텐 단계에서 동종 염색체는 점진적으로 데시냅스를 겪습니다. RS의 순도는 DCV(도3B)로염색하는 핵에 의해 확인된다. RS는 DNA 염색으로 정확하게 판단될 수 있습니다: 유크로마틴에 둘러싸인 독특한 DAPI 강렬한 염색체; 또는 중간 파시텐단계(도 3B)후 핵에서 높게 발현되는 정자 및 히스톤 변이체 H1T의 개발 곡예 과립 내에 발현되는 Sp56과 같은 특정 마커와 결합한다.
RS 순도는 정렬 후 약 90.1 %입니다(그림 3C). 순도 분석의 샘플 크기는 각 실험에 대해 1,000개 이상의 세포입니다. L/P 및 D 집단의 순도는 6개의 독립적인 실험에서 평균입니다; P와 RS 집단의 순도는 3개의 독립적인 실험에서 평균됩니다. 이러한 격리 된 세포의 생존가능성은 일반적으로 95 % 이상입니다(그림 S1). 단일 성인 마우스에서 각 분수의 총 수율은 추정 및 다양한 다운스트림 분석을위한 충분한 세포를 제공하는 Fig 3C에 나열됩니다. 최근에는 ChIP-seq 분석20,21에대한 야생형 파시텐 정자세포를 분리하기 위해 이프로토콜을 사용했습니다.
| 시약 | 성분 | 재고 농도 | 볼륨 |
| (HBSS 베이스) | |||
| 해리 버퍼 | DMEM | - | 2 ml |
| (DMEM 베이스) | FBS | - | 40 μl |
| 히알루로니다제 | 100 mg/ml | 30 μl | |
| DNase I | 10 mg/ml | 50 μl | |
| 콜라게나아제 타입 I | 100 mg/ml | 40 μl | |
| 재조합 콜라게나아제 | 14000 단위/ml | 100 μl | |
| FACS 버퍼 | Pbs | - | 980 ml |
| (PBS 베이스) | FBS | - | 20 ml |
표 1: 시약 레시피. 해리 버퍼는 사용하기 직전에 준비해야 합니다. 해부를 시작하기 전에 사전 웜 DMEM. 효소 재고는 실험 전에 언제든지 제조될 수 있으며 -20°C에 저장될 수 있으며, FACS 버퍼는 진공 여과및 4°C에서 저장되어야 합니다. 사용하기 전에 실온에 예열하십시오.
그림 1: DCV 기반 선별에 대한 뮤린 정자 세포 격리의 워크플로우. 이 이미지는 조직 해리에서 FACS 분류에 이르기까지 하루 이내에 고립 된 정자 세포의 수확에 이르기까지 일반적인 절차를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DCV 형광 및 광 산란에 기초한 성인 골반 고환 세포의 FACS 분석. (A)DCV-블루 히스토그램 플롯(빨간색 막대의 왼쪽)의 첫 10년 동안 스테인드되지 않은 세포를 획득하였다. (B) (C)광 산란에 의해 제외된 파편 및 비단단전. (D)DCV 형광에 기초하여 염색되지 않은 세포 및 측면 인구 배제. (E)DCV-블루 형광에 기초한 DNA 함량 결정. 왼쪽 피크(녹색) 및 오른쪽 피크(분홍색)는 1C 및 4C 인구에 해당합니다. (F)DCV-블루/DCV-적색 형광에 기초한 1C 및 4C 고환 집단에 게이팅. (G)4C 고환 인구에 정확한 게이팅. (H)FSC/BSC 플롯의 DCV 플롯에서 게이트 4C의 백 게이팅. FSC/BSC 플롯의 최소 중첩 영역을 기반으로 L/Z, P 및 D 게이트는 각각의 정자 세포 집단을 풍부하게 하기 위해 만들어집니다. (I)FSC/BSC 플롯의 DCV 플롯에서 게이트 1C의 L/Z, P 및 D 모집단을 보여주는 컬러 도트 플롯이 연속 순서입니다. RS 게이트는 균일 한 크기로 둥근 정자 인구를 풍부하게하기 위해 만들어졌으며 정렬 중에 인구의 순도가 더 큽습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 선별에서 얻은 정자 세포의 대표적인 결과 이미지 및 통계. (A)선별된 정자세포의 면역형광 특성화. 상부 패널: 정렬 직후 살아있는 정자 세포의 핵 패턴을 보여주는 DCV 염색; L/Z(렙토텐/지고틴), P(파치텐), D(디플롯텐). 낮은 패널: SYCP3(녹색) 및 γH2AX(빨간색)에 대한 면역스테인링에 의해 각 집단에 대한 메이오틱 하위 스테이지의 확인. (B)RS의 핵 패턴을 보여주는 대표적인 DCV 이미지. 스케일 바: 50 μm(상부 패널) 및 10 μm(아래 확대 패널). 오른쪽 패널: Sp56 및 H1T로 얼룩진 둥근 정자의 면역 불발 성 확인. (C)L/Z, P 및 D의 순도는 면역염색에 의해 확인되었고, 샘플 크기는 각각의 독립적인 실험에 대해 1,000개 이상의 세포였으며, 총 6개의 독립적인 실험에서 확인되었다. RS 순도는 총 3개의 독립적인 실험으로 핵 염색에 의해 확인되었다. 8주 된 WT B6 마우스에서 고환 세포 현탁액의 총 세포 수는 정렬하기 전에 약 1 억 개의 세포였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S1: 고립 된 pachytene 정자 세포의 생존. 대표적인 이미지는 분리된 파시텐 정자 세포의 세포 생존가능성을 나타낸다(빨강: PI; 파란색: DCV). 정렬 중에 PI를 DCV와 결합할 수 없습니다. 그러나, 현미경의 밑에, DCV-빨간 신호는 아주 낮았습니다; 따라서, PI 양성 죽은 세포는 다른 살아있는 세포와 쉽게 구별되었다. 생존가능성은 보통 95% 이상입니다. 스케일 바: 10 μm. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S2: 불완전한 해리 또는 파편이 게이팅을 방해합니다. A 인구(적색 원)에는 정자의 파편과 폴리머(화살표로 표시)가 포함되어 있습니다. 더 큰 A 인구는 B 인구 (노란색 원)와 교차하고 결국 4C 인구를 오염합니다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 단일 성인 남성 마우스에서 정자 세포와 정자의 하위 인구를 격리하기 위하여 실용적이고 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 재현성을 보장하기 위해 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 효소 소화 전에, 세척 단계는 간질 세포를 제거하는 것을 목표로; 소화 후,이 단계는 정자와 파편을 제거하는 데 도움이됩니다. 세탁/원심 분리는 3배나 중요합니다. 우리의 해리 완충 레시피에서, 몇몇 다른 효소의 조합은 과도한 세포 손상 없이 단세포 현탁액으로 고환의 해리를 용이하게 합니다. 기포를 일으키지 않도록 부드럽게 파이펫팅하면 세포 무결성을 보호하는 데도 도움이 됩니다. 절개 후 현미경으로 세포 현탁액을 확인하여 현탁액이 단일 세포 수준을 달성했는지 확인하십시오. 과도한 소화로 인한 불완전한 해리 또는 이물질 오염은 정렬된 세포의 순도에 영향을 미칩니다. 그림 S2에표시된 바와 같이, 직립 인구는 정자의 파편과 테트라머를 포함합니다. DCV 염색은 어둠 속에서 인큐베이션이 필요하며 나중에 세척이 필요하지 않습니다.
정자 세포 하위 모집단의 게이팅 및 백 게이팅에 잠재적 인 어려움을 해결하기 위해 최적화를위한 옵션으로, 우리는 정자 세포의 특정 단계를 찾는 데 도움이 동기화 된 야생 유형 마우스를 사용하는 것이 좋습니다22,23,24. 그것은 또한 정자 발생 체포 표현형을 가진 몇몇 녹아웃 마우스 긴장이 몇몇 하위 인구를 누락하기 때문에 드문 DCV 단면도가 있을 수 있다는 것을 주목할 가치가 있습니다. 이 경우 적절한 야생형 컨트롤을 강력히 권장합니다. 또한,이 프로토콜은 잠재적으로 모든 연령의 성인 마우스에 적용 될 수있다. 그러나, 실험 마우스의 나이는 세균 세포의 가변 비율 때문에 혼란스러운 요인이 될 수 있었다.
수년에 걸쳐, 세균 세포를 정화하기 위하여 몇몇 프로토콜이 개발되었습니다. 가장 인기있는 방법 중 하나로서, STA-PUT 속도 침전물은 BSA 그라데이션에 의해 세균 세포를 분리하고 그대로 세균 세포의 좋은 수율을 제공합니다6,7. 그러나 STA-PUT는 많은 실험실에서 쉽게 사용할 수 없을 뿐만 아니라 4°C의 차가운 방에서 수행하기 위해 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 특수 장치가 필요합니다. 대규모 분리에 적합한 STA-PUT와 달리 이 FACS 기반 방법은 소규모 실험에 대해 높은 순도와 정확한 분수를 제공할 수 있습니다. 프로토콜을 사용하여 대규모 정렬이 가능하지만 정렬 시간을 크게 연장하고 셀 실행 가능성이 저하될 수 있습니다. 따라서, STA-PUT는 많은 수의 세포가5,25,26이필요할 때 여전히 실용적인 옵션이다.
Ho342 염료 염색8,9,10,11에기초한 이전 FACS 방법과 비교하여, 당사의 프로토콜은 더 넓은 흥분 스펙트럼을 가지고 있으며 UV 또는 405 nm 바이올렛 레이저18을장착한 대부분의 FACS 선별기에게 적용될 수 있는 DCV를 활용한다. DCG14,15,16,17을사용하는 또 다른 프로토콜이 있지만, 우리의 프로토콜과 DCG 프로토콜의 차이점은 우리의 DCV 프로토콜이 Ho342 프로토콜의 장점을 모방하여 DCV 파란색 및 DCV 빨간색으로 2차원 분리를 사용한다는 것입니다. 이러한 이점을 통해 DCV 프로토콜을 사용하면 고농축 세균 세포를 성인 고환으로부터 분리할 수 있습니다. DCG 프로토콜은 2차원 분리를 사용하지 않으며 청소년 마우스에서 세균 세포의 격리를 권장합니다. 2 차원 분리는 정자 세포의 하위 단계를 분리하는 더 나은 해상도를 가질 수 있습니다. 그러나, 우리의 방법은 아직도 별도로 렙토텐과 zygotene 정자 세포를 분리할 수 없습니다, 뿐만 아니라 "2C" 정자를 포함 하 여 세포 유형, preleptotene 정자 세포, 그리고 이차 정자 세포.
DCV 얼룩의 넓은 방출 스펙트럼은 다른 채널로 누출되기 때문에 PI 및 7AAD와 같은 대부분의 세포 생존 성 염료는 거짓 긍정 신호로 인해 결합 될 수 없습니다. 원색 또는 근적외선 채널에서 방출이 있는 다른 세포 생존성 염료는 미래에 시도할 가치가 있을 수 있습니다. 그러나 우리의 경험에서 정렬 된 세포는 일반적으로 다운스트림 분석에 충분한 FACS 정렬(그림 S1)의2 시간 후에 95 %의 생존력을 ≥ 보여줍니다.
당사의 절차에서 얻은 선별된 세포는 차세대 염기서열 분석(RNA-seq, ATAC-seq 및 ChIP-seq)을 포함한 다양한 다운스트림 실험에 사용될 수 있다. 여기서 수득된 세포는 단기배양(27)에도사용될 수 있다. 결론적으로, 우리는 1 시간 단일 세포 서스펜션 준비 절차 및 DCV 염료 염색에 기초한 FACS에 대한 상세한 게이팅 전략을 포함하여 간단하지만 효율적인 프로토콜을 제공하며, 이는 소규모 정자 세포 격리에 적합하며 많은 조사자, 심지어 흐르는 세포학 초보자도 신속하게 채택 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
네카와, 요시다, 마에자와 연구소 회원들에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 원고편집을 위한 케이티 게르하르트; H1T 항체를 공유하기위한 메리 앤 헨델, 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC) NIH S10OD023410에 의해 지원 되는 FACS 장비를 공유 하기 위한 연구 흐름 사이토 메 트리 코어; 과학 연구를 위한 보조금 지원 (KAKENHI; 17K07424) T.N.에; Lalor 재단 박사 후 A.S.에 대한 펠로우십; AMED-CREST (JP17gm110005h00001) - S.Y.; 아자부대학 연구서비스부, 교육부, 문화체육과학기술부(MEXT) 지원 프로그램 (2016~2019), 연구활동 스타트업 보조금 지원(19K21196), 다케다과학재단(2019), 우에하라재단(2019년.M) 건강의 국립 연구소 R01 GM122776 에 S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
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