Summary
Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.
Abstract
Meyozis ve spermatogenezin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için meyotik spermatositlerin izolasyonu esastır. Floresan aktive hücre sıralama ile birlikte Hoechst 33342 boyama kullanarak kurulmuş hücre izolasyon protokolleri olmasına rağmen, ultraviyole lazer ile donatılmış hücre ayırıcılar gerektirir. Burada, Hoechst 33342'ye benzer yapısal olarak benzeyen düşük sitotoksisite DNA bağlayıcıboyası Olan DyeCycle Violet (DCV) lekesi kullanılarak bir hücre izolasyon protokolü tanımlanmaktadır. DCV hem ultraviyole hem de mor lazerler tarafından heyecanlı olabilir, hangi ekipman seçimi esnekliğini artırır, ultraviyole lazer ile donatılmış olmayan bir hücre ayırıcı dahil. Bu protokolü kullanarak, leptoten/zigotene, pachytene ve diplotene spermatositler de dahil olmak üzere meyotik profaz I'de üç canlı hücre alt popülasyonunu ve post-meiyotik yuvarlak spermatidleri izole edebilir. Ayrıca fare testislerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için bir protokol açıklarız. Genel olarak, yordamın tamamlanması için kısa bir süre (gerekli hücrelerin sayısına bağlı olarak 4-5 saat), birçok downstream uygulamaları kolaylaştırır gerektirir.
Introduction
Spermatogenez spermatogonial kök hücrelerin küçük bir popülasyon yetişkinyaşam1,2boyunca sperm çok sayıda sürekli üretimini sürdürmek karmaşık bir süreçtir. Spermatogenez sırasında, dinamik kromatin remodeling spermatojenik hücreler haploid spermatidsüretmekiçin meyozis geçmesi gerçekleşir 3,4,5. Meyotik spermatositlerin izolasyonu moleküler araştırma için gereklidir ve sedimantasyona dayalı ayırma6,7 ve floresanaktif hücre ayrıştırma (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17dahil olmak üzere meyotik spermatositleri izole etmek için çeşitli yaklaşımlar oluşturulmuştur. Ancak, bu yöntemlerin teknik sınırlamaları vardır. Sedimantasyon aparatlığı çok sayıda hücre yitirmede5,6,7, emek yoğundur. Kurulan FACS tabanlı yöntem DNA içeriği ve ışık saçılma özelliklerine göre meiotik spermatositleri ayırmak için Hoechst 33342 (Ho342) kullanır ve bir ultraviyole (UV) lazer8,9,10,11ile donatılmış FACS hücre ayırıcıları gerektirir. Alternatif FACS tabanlı yöntemler floresan proteinleri ifade transgenik fare hatları gerektirir, spermatogenez senkronizasyonu12, veya hücre fiksasyonu ve canlı hücrelerin izolasyonu ile uyumlu olmayan antikor etiketleme13. Hücre geçirgen DNA bağlayıcı boya, BoyaDöngüsüYeşil leke14, 15,16,17kullanarak başka bir alternatif yöntem olsa da, bu yöntem juvenil testislerden spermatojenik hücrelerin izolasyonu için tavsiye edilir. Bu nedenle, herhangi bir yaştaki herhangi bir fare suş uygulanabilir ve herhangi bir FACS hücre ayırıcı kullanılarak yapılabilir canlı meiotik spermatositler için basit ve sağlam bir izolasyon yöntemi geliştirmek için kritik bir ihtiyaç vardır.
Burada Boya Döngüsü Menekşe (DCV) lekekullanarak böyle uzun zamandır aranan hücre izolasyon protokolü açıklar. DCV düşük sitotoksisite, hücre geçirilebilir DNA bağlayıcı boya yapısal Ho342 benzer ama bir uyarma spektrumu ile menekşe aralığı doğru kaymıştır18. Buna ek olarak, DCV DCG ile karşılaştırıldığında daha geniş bir emisyon spektrumuna sahiptir. Böylece, uv lazer ile donatılmış olmayan bir FACS hücre ayırıcı kullanımına izin, ekipman esnekliğini artırır hem UV ve menekşe lazerler, tarafından heyecan verici olabilir. Burada sunulan DCV protokolü, Ho342 protokolünün avantajını taklit eden, DCV mavi ve DCV kırmızı ile iki boyutlu ayırma kullanır. Bu avantajla, DCV protokolümüz yetişkin testislerinden yüksek oranda zenginleştirilmiş mikrop hücrelerini izole etmemizi sağlar. Canlı spermatojenik hücreleri bir farenin yetişkin fare testislerinden (iki testisten) izole etmek için ayrıntılı bir gating protokolü salıyoruz. Ayrıca, bu hücre yalıtımı için kullanılabilecek fare testislerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için etkili ve hızlı bir protokol açıklarız. Prosedürütamamlamak için kısa bir süre gerektirir (tek hücreli süspansiyon hazırlanması - 1 saat, boya boyama - 30 dk ve hücre sıralama - 2-3 saat: toplam - 4-5 saat gerekli hücrelerin sayısına bağlı olarak; Şekil 1). Hücre izolasyonu sonrasında, RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq ve hücre kültürü gibi çok çeşitli downstream uygulamaları tamamlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerini takip eder (protokol no. IACUC2018-0040) Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi'nde.
1. Testis hücre süspansiyonu hazırlanması için ekipman ve reaktif kurulumu
- Her enzim stoğunu 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) olarak hazırlayın ve -20 °C.'de saklayın (Tablo1).
NOT: Denemeden önce herhangi bir zaman hazırlayın. - Deneyden bir gün önce: Bir gecede 4 °C'de Fetal büyükbaş serumu (FBS) ile palto toplama tüpleri (1,5 mL tüpler).
- Deney günü: Su banyosunu 37 °C'ye ayarlayın.
- Pre-sıcak Dulbecco's Modifiye Kartal Orta (DMEM) 37 °C ve her örnek için 2 mL 1x ayrışma tampon hemen önce 15 mL santrifüj tüp (Tablo 1) hazırlayın.
NOT: İki testis için 2 mL dissosiyatasyon tamponu hazırlanır. Dissociation tampon tarifi için, Tablo 1bakın .
2. Hayvan diseksiyonu ve testis hücre süspansiyonunun hazırlanması
- En az 10 dakika karbondioksit odasında bırakarak 8 haftalık bir erkek fare kurban.
- Her iki testisi de çıkarın ve 2 mL buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 60 mm'lik Petri kabının üzerine yerleştirin.
- Testislerden tunica albuginea'yı çıkarın. Forceps ile hafifçe ayırarak seminiferous tübülleri hafifçe dağıtın.
- Seminiferous tübülleri 100 mm'lik petri kabına yeni bir damla buz gibi PBS ile aktarın ve seminiferous tubules'i forceps ile hafifçe çözün. Interstisyel hücreleri mümkün olduğunca çıkarmak için bu yıkamayı 3 kez tekrarlayın.
- 20 dakika boyunca 37 °C'de 2 mL ayrışma tamponu içeren 15 mL'lik bir tüpte kuluçkaya yatan seminiferous tübüller.
- 1000 μL mikropipet kullanarak boruları 20 kez hafifçe pipetlayın.
- 6 dakika kuluçka. Nazik pipetlemeyi 20 kez tekrarlayın.
- 3 dakika kuluçka. Görünür parça kalmayana kadar hafif pipetlemeyi 10 kez tekrarlayın.
- Süspansiyona 10 mL FACS arabelleği ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika için 300 x g santrifüj ve supernatant atın.
- Spermatozoa ve mümkün olduğunca çok enkaz kaldırmak için adım 2.9 iki kez tekrarlayın.
3. Hücre boyama
- 3 mL FACS tamponu(Tablo 1)ile hücre peletini yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonuna 70 m naylon hücresüzsüzden 50 mL'lik bir tüpe filtre uygulayın.
NOT: Beklenen hücre verimi iki testis başına yaklaşık 100 milyon hücredir (8 haftalık Bir B6 vahşi fareden). - Hücre sayısını sayın ve hücrelerin %10'u lekelenmemiş negatif kontrol olarak yeni bir tüpe bölün ve buzüzerinde bırakın.
- Kalan hücre süspansiyonuna 6 μL DCV lekesi (orijinal konsantrasyon 5 mM) ekleyin ve iyice karıştırın. Son konsantrasyon 10 μM ve kapasitesi yaklaşık 100 milyon hücredir.
- Karanlıkta 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonuna her 10 dakikada bir hafifçe sallayın.
- Kuluçkadan sonra, yıkama adımı olmadan, hücre süspansiyonuna doğrudan 5 μL DNase I (stok konsantrasyonu 10 mg/mL) ekleyin ve hücreleri 35 μm naylon kafes kapağı ndan 5 mL'lik bir FACS tüpüne filtreleyin. Sıralama kadar buz üzerinde örnekleri tutun.
4. Akış sitometrisi ve deneysel kapılar
- FACS hücre ayırıcısını hazırlayın. FACS hücre ayırıcısı Uyarma optik ile donatılmıştır emin olun: Violet (405-nm) lazer; Algılama optik: 450/50 bandpass filtre kombinasyonu [4', 6-diamidino-2-fenilindole aynı filtre seti (DAPI) DCV-mavi algılama için] ve 665/30 bandpass [DCV-kırmızı algılama için Allophycocyanin (APC) aynı filtre seti]. Burada örnek olarak Sony SH800S hücre ayırıcısı kullanıyoruz.
- Yeni bir deneme oluşturun ve optimize edilecek parametreleri gösteren aşağıdaki çalışma çizimlerini ayarlayın: "Çalışma Sayfası Araçları" menü çubuğunda "Yeni Yoğunluk" a tıklayın, ileri dağılım - alan (FSC-A) ve geri dağılım - alan (BSC-A) yoğunluk çizimi doğrusal ölçekte. Logaritmik ölçekte DCV-mavi histogram çizimi oluşturmak için "Yeni Histogram" seçeneğini tıklayın.
- Kısaca lekesiz negatif kontrol girdap (adım 3.2) ve örnek yükleyin.
- Lekesiz numuneyi işlemebaşlamak için "Başlat" ve "Kayıt" 'yi tıklatın. Örnek çalışırken,"Dedektör ve Eşik Ayarları" nu tıklayarak FSC ve BSC gerilimlerini optimize ederek hem fotoçarpan tüpünü (PMT) gerilimleri yukarı veya aşağı ayarlayarak lekesiz hücreleri FSC/BSC çizimölçeğine yerleştirin.
- Örnek DCV-mavi histogram logaritmik çizimin ilk on yılında DCV-negatif popülasyonun konumunu bulmak için çalışırken "FL1: DAPI" üzerinde PMT gerilimini yukarı ve aşağı ayarlayın (Şekil 2A). PMT gerilim ayarını tamamladıktan sonra, lekelenmemiş numuneyi boşaltmak için "Dur" seçeneğini tıklayın.
- Kısaca numuneyi girdap (adım 3.5'ten) ve numuneyi yükleyin.
- DCV lekeli örnek için yeni bir çalışma sayfası oluşturmak için "Sonraki Tüp" seçeneğini tıklatın; dcv-lekeli örnek almak için "Başlat" ve "Kayıt" tıklayın, 1 x 106 olay ≥ kaydedin. Aşağıdaki çalışma çizimlerini ekleyin: Doğrusal ölçekte FSC-H (yükseklik) ve FSC-W (genişlik) yoğunluk çizimi oluşturmak için "Çalışma Sayfası Araçları" menü çubuğunda " YeniYoğunluk" a tıklayın; Doğrusal ölçekte DCV-mavi vs DCV-kırmızı yoğunluk çizimi oluşturmak için "Yeni Yoğunluk"'u tıklatın. 1 x 106 olay ≥ kaydettikten sonra "Dur" seçeneğini tıklayın ve örneği boşaltın.
- FSC-A vs BSC-A yoğunluk çiziminde, "Plot Tools" menü çubuğunda "Çokgen" menü çubuğuna tıklayarak büyük bir kapı çizmek için "Hücreler" çoğu hücreyi içerir ve küçük enkazı hariç tutar (Şekil 2B). FSC-H vs FSC-W yoğunluk çizimine "Cells" kapısını uygulayın. Tek hücre dışı hücreleri dışlamak için "Tek Hücreler" kapısı çizmek için "Dikdörtgen" tuşuna basın (Şekil 2C).
- DCV-mavi vs DCV-kırmızı yoğunluk çizim "Tek Hücreler" kapısı uygulayın ve Şekil 2Dgösterildiği gibi genişletilmiş bir profil yakalamak için ölçek ayarlayın. Lekesiz hücreleri ve yan popülasyonu dışlamak için "DCV" kapısı çizmek için "Çizim Araçları" menü çubuğunda "Çokgen" i tıklayın (Şekil 2D).
- Doğrusal ölçekte DCV-mavi histogram çizimine "DCV" kapısını uygulayın. Üç ana zirve farklı DNA içeriğine başvurur: 1C, 2C ve 4C(Şekil 2E).
- Doğrusal ölçekte DCV-mavi vs DCV-kırmızı yoğunluk çizimi oluşturmak için "Yeni Yoğunluk" seçeneğini tıklayın ve 1C ve 4C popülasyonlarını bulmak için Şekil 2E'den geriye gating yapmak için "DCV" kapısını uygulayın (Şekil 2F). Yoğunlaştırılmış bir alan (kapı 1C) içinde bulunan 1C popülasyonuna bir kapı çizmek için "Elips" seçeneğini tıklayın. Sürekli bir eğri (kapı 4C) olan 4C popülasyonuna bir kapı çizmek için "Çokgen" seçeneğini tıklayın.
- Doğrusal ölçekte DCV-mavi vs DCV-kırmızı yoğunluk çizimi oluşturmak ve "4C" kapısını uygulamak için "Yeni Yoğunluk" seçeneğini tıklayın; yakınlaştırmak için ölçeği ayarlayın ve daha hassas seçim için "4C_1" kapısı çizmek için "Çokgen" düğmesine tıklayın (Şekil 2G).
- Doğrusal ölçekte yeni bir FSC-A vs BSC-A yoğunluk çizimi oluşturmak ve "4C_1" kapısını uygulamak için "Yeni Yoğunluk" seçeneğini tıklayın; leptoten (L) /zigotene (Z), pachytene (P) ve diploten (D) spermatositlerine karşılık gelen boyuta göre ayrılmış üç zenginleştirilmiş popülasyon olacaktır. 3 kapı çizmek için "Çokgen" veya "Elips" 'yi tıklatın: "L/Z", "P" ve "D" büyüyen boyuta göre (Şekil 2H).
- Kapı uygulamak ve üç popülasyonun "4C_1" kapısı içinde sürekli sırada olduğundan emin olmak için doğrusal ölçekte DCV-mavi vs DCV-kırmızı renkli nokta çizimi oluşturmak için "Yeni Nokta Çizimi" ni tıklayın (Şekil 2I).
- Benzer şekilde, 1C popülasyonu için "New Density" seçeneğini tıklayarak doğrusal ölçekte yeni bir FSC-A vs. BSC-A yoğunluk çizimi oluşturun ve "1C" kapısı uygulayın, saf yuvarlak spermatid popülasyonu olarak hücrelerin birleşik boyutunu seçin ve "Elips" i tıklatarak bir "RS" kapısı(Şekil 2J)tıklayın.
5. Erkek germ hücre alt popülasyonlarını sıralayın
- Hücre toplama için 500°L 50 FBS içeren 1,5 mL tüpler hazırlayın ve toplama tüpünü kolektöre yükleyin ve "Load Collection" 'a tıklayın.
- "Next Tube", "Başlat", "Kayıt" ve "Sıralama Başlat" İki ilgi popülasyonunun aynı anda toplama cihazına sıralanmasını sağlayan iki yönlü bir sistem kullanmak için, çift yönlü kombinasyonları takip edin: L/Z ve P arka kapılarına dayalı leptoten (L) /zigot (Z) ve pachytene (P) spermatositler; Yuvarlak spermatidler (RS) ve diploten (D) spermatositler RS ve D arka kapılara göre.
- Örnek çalışırken, en verimli sıralamayı elde etmek için akış hızını ~3000 olaylara/s'ye ayarlayın.
6. Sıralanmış hücrelerin saflık analizi
- 10.000 hücre/ her nüfus ≥ toplamak. Alt aşamayı onaylamak için hücre immünostaining gerçekleştirin.
- 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de santrifüj edin ve tüpün dibinde sıvının yaklaşık 110 μL'sini tutarak süpernatantı dikkatlice atın.
- Mikroskop altında gözlemlemek ve hücre morfolojisi ve sayısını değerlendirmek için hücre süspansiyonu 10 μL'lik bir damla alın.
- Örnek hazne slaytlarının her birine 100 μL hücre süspansiyonu uygulayın (Bkz. Malzemeler Tablosu)ve odaları Cytospin'e yükleyin.
- Örnekleri oda sıcaklığında 5 dk boyunca 30 x g'da döndürün. Hidrofobik kalemile hücrenin etrafında bir daire çizin. Oda sıcaklığında birkaç dakika laboratuar tezgahında kuru slaytlar.
- Slaytın çevresine 50 μL PBS bırakın ve dokunun.
- Slayt ın çevresine primer antikor solüsyonu (PBS'de %5 Eşek Serumu ile %0,02 Polisorbat 20 ile seyreltilmiş primer antikorlar) ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Meyyoletik spermatositlerin alt evresini değerlendirmek için, meyiyotik kromozom eksenlerinin bir belirteci olan SYCP3 ve DNA hasar yanıtının bir belirteci olan γH2AX saptandı. (Antikor çalışma konsantrasyonu için lütfen Malzeme Tablosu'nabakın). - Slaytlardan birincil antikor çözeltisini çıkartın.
- Slaytın çevresine 50 μL PBS bırakın ve dokunun. Bir kez daha tekrarla.
- Kaydıranın çevresine ikincil antikor solüsyonu (PBS'de %0,02 Polissorbat 20 ile seyreltik sekonder antikorlar) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat karanlıkta kuluçkaya yatırın.
- Slaytın çevresine 50 μL PBS bırakın ve dokunun. Bir kez daha tekrarla.
- 5 dakika boyunca 50 μL DAPI (stok konsantrasyonu 0,1 μg/mL) lekesi ekleyin ve dokunun.
- Slaytlara 1-2 damla montaj ortamı ekleyin. Montaj ortamını bir kapak camıyla dikkatlice kapatın ve ekstra montaj ortamını ve hava kabarcığını çıkarmak için kapak camı nazikçe bastırın. Slaytlar mikroskopi değerlendirmesi için hazırdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu sıralama protokolünün temsili bir sonucu Şekil 3'tegösterilmiştir. İki testisin (bir fare) toplam sıralama süresi genellikle hücre süspansiyonunun konsantrasyonuna ve sıralama hızına bağlı olarak yaklaşık 3 saattir. Sıralamadan sonra spermatositlerin saflığı SYCP3 ve γH2AX(Şekil 3A)immünboyboyama ile doğrulanır. Sıralanmış L/Z, P, D spermatosit fraksiyonlarının temsili saflıkları sırasıyla %80.4, %90.6 ve %87.6 civarındadır (Şekil 3C). Alt aşamaları daha önce19olarak yayınladığımız kriterlere göre belirledik. Kısaca, leptoten ve zigot evresinde homolog kromozomlar arasındaki sinaps eksiktir ve bu sycp3 boyama ince iplikleri ile gösterilir. Geniş γH2AX etki alanları programlanmış DNA çift iplikçik kırıkları nedeniyle nükleer kromatin boyunca gözlenir. Pakimeten evresinde homolog kromozomlar tamamen sinapsa sahiptir ve γH2AX özellikle cinsiyet kromozomları üzerinde birikir. Diplotene evresinde homolog kromozomlar giderek desinaps alarir. RS saflığı DCV ile çekirdek boyama ile doğrulanır (Şekil 3B). RS tam DNA boyama ile değerlendirilebilir: benzersiz bir DAPI yoğun kromocenter euchromatin ile çevrili; veya orta pachyten etabı sonra çekirdekte yüksek oranda ifade edilen spermatid ve histon varyantı H1T'nin gelişen akrozomal granüliçinde ifade edilen Sp56 gibi spesifik belirteçlerle birleşin(Şekil 3B).
Rs saflığı sıralamadan sonra %90,1 civarındadır(Şekil 3C). Saflık analizinin örneklem büyüklüğü her deney için 1.000'den fazla hücredir; L/P ve D popülasyonlarının saflığı ortalama 6 bağımsız deneyden; P ve SC popülasyonlarının saflığı ortalama 3 bağımsız deneyden elde edilir. Bu izole hücrelerin canlılığı genellikle %95'in üzerindedir(Şekil S1). Tek bir yetişkin fareden her bir fraksiyonun toplam verimi tahmin edilir ve çeşitli downstream analizleri için yeterli hücre sağlayan Şekil 3C'de listelenir. Son zamanlarda, biz ChIP-seq analizi20,21için yabani tip pachytene spermatositizole etmek için bu protokolü kullandık.
| Reaktif | Madde | Stok konsantrasyonu | Birim |
| (HBSS tabanı) | |||
| Dissociation Arabellek | DMEM | - | 2 ml |
| (DMEM tabanı) | Fbs | - | 40 μl |
| Hyaluronidase | 100 mg/ml | 30 μl | |
| DNase I | 10 mg/ml | 50 μl | |
| Kollajenaz Tip I | 100 mg/ml | 40 μl | |
| Rekombinant Kollajenaz | 14000 birim/ml | 100 μl | |
| FACS arabelleği | Pbs | - | 980 ml |
| (PBS tabanı) | Fbs | - | 20 ml |
Tablo 1: Reaktif Tarifi. Dissociation tampon hemen kullanmadan önce hazırlanmalıdır. Diseksiyona başlamadan önce Prewarm DMEM. Enzim stokları deneyden önce her zaman hazırlanabilir ve -20 °C. FACS tamponunda saklanabilir vakumlu filtrelenmeli ve 4 °C'de saklanabilir; kullanmadan önce oda sıcaklığına önceden ısıtın.
Şekil 1: DCV tabanlı sıralamada murine spermatojenik hücrelerin izolasyonunun iş akışı. Bu resim, doku ayrıştırMa FACS sıralama, bir gün içinde izole spermatojenik hücrelerin hasat için genel prosedürü göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: DCV floresan ve ışık saçılımına dayalı yetişkin murin testis hücrelerinin FACS analizi. (A) Bir DCV-mavi histogram arsa (kırmızı çubuğun sol tarafı) ilk on yıl içinde lekesiz hücreleri elde etti. (B) (C) Enkaz ve ışık saçılma tarafından dışlanan tek hücreli olmayan. (D) DCV floresandayalı lekesiz hücre ve yan nüfus dışlama. (E) DCV-mavi floresan dayalı DNA içeriği tayini. Sol tepe (yeşil) ve sağ tepe (pembe) 1C ve 4C popülasyonlarına karşılık gelir. (F) DCV-mavi/DCV-kırmızı floresandayalı 1C ve 4C testis popülasyonlarında gating. (G) 4C testis popülasyonlarında hassas gating. (H) Bir FSC/BSC arsa üzerinde DCV arsa Dan Gate 4C geri gating. FSC/BSC arsaüzerinde minimal örtüşme bölgelere dayanarak, L / Z, P ve D kapıları kendi spermatosit popülasyonları zenginleştirmek için oluşturulur. (I) L/Z, P ve D popülasyonlarını gösteren renkli nokta çizimi, Kapı 4C içinde sürekli sıradadır. (J) FSC/BSC çizimi üzerindeki DCV çiziminden Kapı 1C'nin geri gating'i. RS kapısı, yuvarlak spermatid popülasyonunu tek tip ebatta zenginleştirmek için oluşturuldu ve bu da sıralama sırasında popülasyonların daha fazla saflıkta olmasıyla sonuçlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sıralamadan elde edilen spermatojenik hücrelerin temsili sonuç görüntüleri ve istatistikleri. (A) Sıralanmış spermatositlerin immünororeskence karakterizasyonu. Üst panel: Canlı spermatositlerin çekirdek deseni gösteren DCV boyama, sıralamadan hemen sonra; L/Z (leptoten/zigotene), P (pachytene) ve D (diploten). Alt panel: SYCP3 (yeşil) ve γH2AX (kırmızı) için immünboyama ile her popülasyon için meiyotik alt aşamaların teyidi. (B) RS çekirdek deseni gösteren temsili DCV görüntüsü. Ölçek çubukları: 50 μm (üst paneller) ve 10 μm (alt büyütülmüş paneller). Sağ Paneller: Sp56 ve H1T ile boyanmış yuvarlak spermatidlerin immünororeskence onayı. (C) L/Z, P ve D saflığı immünboyama ile doğrulandı, örneklem büyüklüğü her bağımsız deney için 1.000'den fazla hücreydi, toplam 6 bağımsız deney. SC saflığı toplam 3 bağımsız deneyle çekirdek boyama ile doğrulandı. 8 haftalık Bir WT B6 fareden testis hücre süspansiyonunun toplam hücre sayısı sıralamadan önce yaklaşık 100 milyon hücreydi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S1: İzole pakimeten spermatositlerin canlılığı. Temsili bir görüntü izole pachytene spermatositlerin hücre canlılığını gösterir (Kırmızı: PI; Mavi: DCV). PI sıralama sırasında DCV ile birleştirilemedi. Ancak, mikroskop altında, DCV-kırmızı sinyal oldukça düşüktü; bu nedenle, PI-pozitif ölü hücreler kolayca diğer canlı hücrelerden ayırt edildi. Canlılık genellikle %95'in üzerindedir. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil S2: Eksik dissociasyon veya enkaz gating rahatsız. A popülasyonu (kırmızı daire) enkaz ve spermatid polimeri içerir (ok ile gösterilir). Büyük A popülasyonu B popülasyonuyla (sarı daire) geçecektir ve sonunda 4C popülasyonunu kirletecektir. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada spermatosit ve spermatid alt popülasyonlarını tek bir yetişkin erkek fareden izole etmek için pratik ve basit bir protokol salıyoruz. Bu protokolün tekrarlanabilirliğini sağlamak için dikkat gerektiren bazı kritik adımlar vardır. Enzim sindiriminden önce, yıkama adımı interstisyel hücreleri ortadan kaldırmayı amaçlar; sindirim sonra, bu adım spermatozoa ve enkaz kaldırmak için yardımcı olur. Yıkama / santrifüj 3 kez önemlidir. Bizim dissosyasyon tampon tarifi, birkaç farklı enzimlerin kombinasyonu aşırı hücre hasarı olmadan tek hücreli süspansiyon içine testislerin dissociation kolaylaştırır. Hava kabarcıklarına neden olmasını önlemek için yavaşça pipetleme hücre bütünlüğünün korunmasına da yardımcı olur. Süspansiyonun tek hücre li seviyeye ulaştığından emin olmak için lütfen bir mikroskop altında hücre süspansiyonunu kontrol edin. Aşırı sindirim eksik dissociation veya enkaz kirlenme sıralanmış hücrelerin saflığını etkileyecektir; Şekil S2'degösterildiği gibi, dik popülasyon da enkaz ve spermatid tetramer içerir. DCV boyama karanlıkta kuluçka gerektirir ve daha sonra yıkama.
Spermatosit alt popülasyonlarının gating ve geri gating potansiyel zorlukları gidermek için, optimizasyon için bir seçenek olarak, spermatositlerin belirli bir aşama bulmak için senkronize vahşi tip fare kullanmanızı öneririz22,23,24. Ayrıca spermatogenez arrest fenotipler ile bazı nakavt fare suşları bazı alt popülasyonları eksik çünkü nadir DCV profilleri olabilir dikkati çekiyor. Bu durumda uygun wildtype denetimi şiddetle önerilir. Buna ek olarak, bu protokol potansiyel olarak her yaştaki yetişkin farelere uygulanabilir. Ancak, deneysel farenin yaşı mikrop hücrelerinin değişken oranı nedeniyle şaşırtıcı bir faktör olabilir.
Yıllar içinde, mikrop hücrelerini arındırmak için çeşitli protokoller geliştirilmiştir. En popüler yöntemlerden biri olarak, STA-PUT hız sedimantasyonu BSA gradyan tarafından mikrop hücreleri ayırır ve bozulmamış mikrop hücrelerinin iyi bir verim sağlar6,7. Ancak, STA-PUT sadece birçok laboratuvar için hazır olmayabilir özel cihazlar gerektirir ama aynı zamanda 4 ° C soğuk bir odada yürütmek için zaman alıcı ve emek yoğun. Büyük ölçekli ayırma için uygun olan STA-PUT'un aksine, bu FACS tabanlı yöntem küçük ölçekli bir deney için yüksek saflıkta ve hassas fraksiyon sağlayabilir. Protokolümüzü kullanarak büyük ölçekli bir sıralama mümkündür, ancak sıralama süresini önemli ölçüde uzatır ve hücre nin canlılığını tehlikeye atabilir. Bu nedenle, STA-PUT hala pratik bir seçenek zaman hücrelerin çok sayıda5,25,26gereklidir.
Ho342 boya boyama 8 dayalı önceki FACS yöntemi ile karşılaştırıldığında8,9,10,11, bizim protokol DCV kullanır, hangi daha geniş bir uyarma spektrumu vardır ve en güncel FACS ayırıcılar uv veya 405 nm mor lazer18ile donatılmış uygulanabilir . DCG 14,15,16,17kullanılarak başka bir protokol olmasına rağmen, protokolümüz ile DCG protokolü arasındaki fark, DCV protokolümüzde Ho342 protokolünün avantajını taklit eden DCV mavisi ve DCV kırmızısı ile iki boyutlu ayırma kullanılmasıdır. Bu avantajla, DCV protokolümüz yetişkin testlerinden yüksek oranda zenginleştirilmiş mikrop hücrelerini izole etmemizi sağlar. DCG protokolü iki boyutlu ayırma kullanmaz ve mikrop hücrelerinin yavru farelerden izole edilmesi için önerilir. İki boyutlu ayırma spermatositlerin alt aşamalarını ayırmak için daha iyi çözünürlüğe sahip olabilir. Ancak yöntemimiz hala leptoten ve zigotene spermatositleri ayrı ayrı izole etmekten, spermatogonia, preleptoten spermatositler ve sekonder spermatositler gibi "2C" hücre tiplerini ayrı ayrı izole etmekten acizdir.
DCV lekesinin geniş emisyon spektrumu diğer kanallara sızmaya neden olduğundan, PI ve 7AAD gibi hücre canlılık boyalarının çoğu yanlış pozitif sinyaller nedeniyle birleştirilemez. Uzak kırmızı veya yakın kızılötesi kanallarda emisyon ile diğer hücre canlılık boyaları gelecekte denemeye değer olabilir. Ama bizim deneyim, sıralanmış hücreler genellikle FACS sıralama 2 saat sonra% 95 canlılık ≥ göstermek(Şekil S1),hangi downstream analizi için yeterlidir.
Prosedürümüzden elde edilen sıralanmış hücreler, yeni nesil sıralama analizleri (RNA-seq, ATAC-seq ve ChIP-seq) dahil olmak üzere çeşitli downstream deneyleri için kullanılabilir. Burada elde edilen hücreler kısa süreli kültür27için de kullanılabilir. Sonuç olarak, bir saatlik tek hücreli süspansiyon hazırlama prosedürü ve küçük ölçekli spermatojenik hücre izolasyonu için uygun olan ve birçok araştırmacı tarafından hızlı bir şekilde benimsenen, hatta akış sitometri yeni başlayanlar tarafından kabul edilebilir DCV boya boyama dayalı FACS için ayrıntılı gating stratejisi de dahil olmak üzere basit ama verimli bir protokol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip çıkarları olduğunu beyan.
Acknowledgments
Biz Yardımları için Namekawa, Yoshida ve Maezawa laboratuvarları üyelerine teşekkür ederiz; Katie Gerhardt el yazması düzenleme için; Mary Ann Handel H1T antikor paylaşımı için, Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC) Araştırma Akış Sitometri Core NIH S10OD023410 tarafından desteklenen FACS ekipman paylaşımı için; T.N.'ye Bilimsel Araştırma Yardımı (KAKENHI; 17K07424); Lalor Vakfı Doktora Sonrası Bursu A.Ş.'ye; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) için S.Y.; Azabu Üniversitesi Araştırma Hizmetleri Bölümü, Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MEXT)-Özel Üniversite Araştırma Markalaşma Projesi Destekli Programı (2016-2019), Araştırma Faaliyeti Başlatma Hibesi (19K21196), Takeda Bilim Vakfı (2019) ve Uehara Memorial Vakfı Araştırma Teşviki (2018) tarafından S.M' ye; Ulusal Sağlık Enstitüsü R01 GM122776 Için S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R.
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
