Summary
Ici, nous présentons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes des testicules adultes de souris. À l’aide d’une faible cytotoxicité, d’un colorant liant l’ADN violet et d’un tri cellulaire activé par fluorescence, on peut isoler des populations de cellules spermatogéniques hautement enrichies pour de nombreuses applications en aval.
Abstract
L’isolement des spermatocytes méiotiques est essentiel pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la méiose et à la spermatogenèse. Bien qu’il existe des protocoles établis d’isolement cellulaire à l’aide de la coloration Hoechst 33342 en combinaison avec le tri cellulaire activé par fluorescence, il nécessite des trieurs cellulaires équipés d’un laser ultraviolet. Ici nous décrivons un protocole d’isolement cellulaire utilisant la tache de violet de DyeCycle (DCV), un colorant liant d’ADN de basse cytotoxicité structurellement semblable à Hoechst 33342. DCV peut être excité par les lasers ultraviolets et violets, ce qui améliore la flexibilité du choix de l’équipement, y compris un trieur de cellules non équipé d’un laser ultraviolet. En utilisant ce protocole, on peut isoler trois sous-populations de cellules vivantes dans la prophase méiotique I, y compris le leptotene/zygotène, le pachytene et les spermatocytes diplotènes, ainsi que les spermatides ronds post-méiotiques. Nous décrivons également un protocole pour préparer la suspension à cellule unique à partir de testicules de souris. Dans l’ensemble, la procédure nécessite un court laps de temps à compléter (4-5 heures selon le nombre de cellules nécessaires), ce qui facilite de nombreuses applications en aval.
Introduction
La spermatogenèse est un processus complexe dans lequel une petite population de cellules souches spermatogoniales soutiennent la production continue d’un grand nombre de spermatozoïdes tout au long de lavie adulte 1,2. Pendant la spermatogenèse, le remodelage dynamique de chromatine a lieu quand les cellules spermatogenic subissent la méiose pour produire des spermatides haploïdes3,4,5. L’isolement des spermatocytes méiotiques est essentiel à l’investigation moléculaire, et plusieurs approches différentes pour isoler les spermatocytes méiotiques ont été établies, y compris la séparation basée sur la sédimentation6,7 et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Toutefois, ces méthodes ont des limites techniques. Alors que la séparation basée sur la sédimentation donne un grand nombre de cellules 5 ,6,7,ilestà forte intensité de main-d’œuvre. La méthode établie à base de FACS utilise Hoechst 33342 (Ho342) pour séparer les spermatocytes méiotiques en fonction de la teneur en ADN et des propriétés de diffusion de la lumière et nécessite des trieurs cellulaires FACS équipés d’un laser ultraviolet (UV)8,9,10,11. D’autres méthodes à base de FACS nécessitent des lignées de souris transgéniques qui expriment des protéines florescentes, la synchronisation de la spermatogenèse12,ou la fixation cellulaire et l’étiquetage des anticorps qui n’est pas compatible avec l’isolement des cellulesvivantes 13. Bien qu’il existe une autre méthode alternative utilisant un colorant liant l’ADN perméable à la cellule, DyeCycle Green tache14,15,16,17, cette méthode est recommandée pour l’isolement des cellules spermatogenic de testicules juvéniles. Par conséquent, il y a un besoin critique de développer une méthode simple et robuste d’isolement pour les spermatocytes méiotiques vivants qui peuvent être appliqués à n’importe quelle souche de souris de n’importe quel âge et qui peuvent être exécutés utilisant n’importe quel trieur de cellules facs.
Ici, nous décrivons un tel protocole d’isolement cellulaire recherché depuis longtemps en utilisant la tache DyeCycle Violet (DCV). Le DCV est une faible cytotoxicité, un colorant liant l’ADN perméable aux cellules structurellement similaire à Ho342, mais avec un spectre d’excitation déplacé vers la gammeviolette 18. En outre, DCV a un spectre d’émissions plus large par rapport à DCG. Ainsi, il peut être excité par les lasers UV et violets, ce qui améliore la flexibilité de l’équipement, permettant l’utilisation d’un trieur de cellules FACS non équipé d’un laser UV. Le protocole DCV présenté ici utilise la séparation bidimensionnelle avec le bleu DCV et le rouge DCV, imitant l’avantage du protocole Ho342. Avec cet avantage, notre protocole DCV nous permet d’isoler les cellules germinales hautement enrichies des testicules adultes. Nous fournissons un protocole de gating détaillé pour isoler les cellules spermatogenic vivantes des testicules adultes de souris d’une souris (de deux testicules). Nous décrivons également un protocole efficace et rapide pour préparer la suspension à cellule unique à partir de testicules de souris qui peuvent être utilisés pour cet isolement cellulaire. La procédure nécessite un court laps de temps (préparation de la suspension à cellule unique - 1 heure, colorant - 30 min, et le tri cellulaire - 2-3 heures: total - 4-5 heures selon le nombre de cellules nécessaires; Figure 1). Après l’isolement cellulaire, un large éventail d’applications en aval, y compris l’ARN-seq, ATAC-seq, ChIP-seq, et la culture cellulaire peuvent être complétés.
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Protocol
Ce protocole suit les lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (protocole no. IACUC2018-0040) au Cincinnati Children’s Hospital Medical Center.
1. Installation d’équipement et de reagent pour la préparation de la suspension des cellules testiculaires
- Préparer chaque stock d’enzymes dans la solution de sel équilibré (HBSS) de Hanks et les conserver à -20 °C.
REMARQUE : Préparez-vous à tout moment avant l’expérience. - Un jour avant l’expérience : Tubes de collecte de manteaux (tubes de 1,5 mL) avec sérum bovin fœtal (FBS) à 4 °C pendant la nuit.
- Le jour de l’expérience : Réglez le bain d’eau à 37 °C.
- Préchauffer le medium d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco à 37 °C et préparer 2 mL de tampon de dissociation 1x pour chaque échantillon juste avant utilisation (tableau 1) dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
REMARQUE : Un tampon de dissociation de 2 mL est préparé pour deux testicules. Pour la recette tampon de dissociation, veuillez consulter le tableau 1.
2. Dissection animale et préparation de la suspension des cellules testiculaires
- Sacrifiez une souris mâle de 8 semaines en partant dans une chambre de dioxyde de carbone pendant au moins 10 minutes.
- Retirer les deux testicules et les placer sur une boîte de Pétri de 60 mm contenant 2 mL de solution saline tamponnée de phosphate glacé (PBS).
- Retirer la tunica albuginea des testicules. Dispersez légèrement les tubules séminifères en les séparant doucement avec des forceps.
- Transférer les tubules séminifères dans une boîte de Pétri de 100 mm avec une nouvelle goutte de PBS glacé et démêler délicatement les tubules séminifères avec des forceps. Répétez ce lavage 3 fois pour enlever les cellules interstitielles autant que possible.
- Incuber des tubules séminifères non emmêlés dans un tube de 15 mL contenant 2 mL de tampon de dissociation à 37 °C pendant 20 min.
- Pipette doucement les tubules 20 fois à l’aide d’une micropipette de 1000 μL.
- Incuber pendant 6 min. Répétez le pipetage doux 20 fois.
- Incuber pendant 3 min. Répétez le pipetage doux 10 fois jusqu’à ce qu’il ne reste pas de morceaux visibles.
- Ajouter 10 mL de tampon FACS à la suspension. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter le supernatant.
- Répétez l’étape 2.9 deux fois pour enlever le spermatozoa et autant de débris que possible.
3. Coloration cellulaire
- Resuspendez la pastille cellulaire avec 3 mL de tampon FACS (Tableau 1) et filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire en nylon de 70 μm dans un tube de 50 mL.
REMARQUE : Le rendement cellulaire attendu est d’environ 100 millions de cellules par deux testicules (provenant d’une souris de type sauvage B6 de 8 semaines). - Comptez le numéro de cellule et divisez 10% des cellules en un nouveau tube comme le contrôle négatif non taché et laissez sur la glace.
- Ajouter 6 μL de tache DCV (la concentration initiale est de 5 mM) à la suspension cellulaire restante et bien mélanger. La concentration finale est de 10 μM, et la capacité est d’environ 100 millions de cellules.
- Incuber à 37 °C pendant 30 min dans l’obscurité. Secouez doucement la suspension cellulaire toutes les 10 minutes.
- Après l’incubation, sans étape de lavage, ajouter directement 5 μL de DNase I (la concentration en stock est de 10 mg/mL) à la suspension cellulaire et filtrer les cellules dans un tube FACS de 5 mL à travers le bouchon en nylon de 35 μm. Gardez les échantillons sur la glace jusqu’au tri.
4. Cytométrie d’écoulement et portes expérimentales
- Préparez le trieur de cellules FACS. Assurez-vous que le trieur de cellules FACS est équipé de l’optique Excitation : laser Violet (405 nm); Optique de détection : combinaison de filtre de 450/50 bandpass [même ensemble de filtre de 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pour la détection bleu DCV] et de 665/30 bandpass [même ensemble de filtre d’Allophycocyanin (APC) pour la détection rouge DCV]. Ici, nous utilisons Sony SH800S trieur de cellules à titre d’exemple.
- Créez une nouvelle expérience et configurez les parcelles de travail suivantes affichant les paramètres à optimiser : Cliquez sur la barre de menu «Outils defeuillede travail » pour créer une zone de dispersion vers l’avant - zone (FSC-A) vs dispersion arrière – parcelle de densité de zone (BSC-A) à l’échelle linéaire. Cliquez sur" Nouvel histogramme" pour créer une intrigue d’histogramme bleu DCV à l’échelle logarithmique.
- Vortex brièvement le contrôle négatif non taché (à partir de l’étape 3.2) et charger l’échantillon.
- Cliquez sur "Démarrer" et "Enregistrer" pour commencer à traiter l’échantillon non taché. Pendant que l’échantillon est en cours d’exécution, cliquez sur «Paramètres détecteuret seuil » pour optimiser les tensions FSC et BSC en ajustant à la fois les tensions du tube photomultiplier (PMT) vers le haut ou vers le bas pour placer les cellules non tachées sur l’échelle de la parcelle FSC/BSC.
- Ajustez la tension pmt de haut en bas sur "FL1: DAPI" tandis que l’échantillon est en cours d’exécution pour localiser la position de la population négative de DCV dans la première décennie de la parcelle logarithmique d’histogramme bleu DCV (figure 2A). Après avoir terminé l’ajustement de tension PMT, cliquez sur" Stop" pour décharger l’échantillon non taché.
- Vortex brièvement l’échantillon (à partir de l’étape 3.5) et charger l’échantillon.
- Cliquez sur "Next Tube" pour créer une nouvelle feuille de travail pour l’échantillon teinté de DCV; et cliquez sur "Démarrer" et "Enregistrer" pour acquérir l’échantillon teinté de DCV, enregistrer ≥ 1 x 106 événements. Ajouter les parcelles de travail suivantes : Cliquez sur la barre de menu «Nouvelles densités» sur la barre de menu «Worksheet Tools» pour créer une parcelle de densité FSC-H (hauteur) vs FSC-W (largeur) à l’échelle linéaire; Cliquez sur" Nouvelle densité" pour créer une parcelle de densité bleu DCV vs DCV-rouge sur une échelle linéaire. Après avoir enregistré ≥ 1 x 106 événements, cliquez sur "Stop" et déchargez l’échantillon.
- Sur la parcelle de densité FSC-A vs BSC-A, cliquez sur "Polygone" sur la barre de menu "Plot Tools" pour dessiner une grande porte "Cells" pour inclure la plupart des cellules et exclure les petits débris (Figure 2B). Appliquez la porte "Cellules" sur la parcelle de densité FSC-H vs FSC-W. Cliquez sur" Rectangle" pour dessiner une porte "Cellules simples" pour exclure les cellules non-individuelles (Figure 2C).
- Appliquezla porte« Cellules simples » sur la parcelle de densité bleu DCV vs DCV-rouge et ajustez l’échelle pour capturer un profil étendu tel qu’indiqué dans la figure 2D. Cliquez sur "Polygone" sur la barre de menu "Plot Tools" pour dessiner une porte "DCV" pour exclure les cellules non tachées et la population latérale (Figure 2D).
- Appliquez laporte « DCV» sur la parcelle d’histogramme bleu DCV à l’échelle linéaire. Les trois principaux pics se réfèrent à des teneurs en ADN différentes : 1C, 2C et 4C (Figure 2E).
- Cliquez sur «Nouvelle densité» pour créer une parcelle de densité bleu DCV vs DCV-rouge sur une échelle linéaire et appliquer la porte «DCV» pour effectuer des gations arrière à partir de la figure 2E pour localiser les populations de 1C et 4C (figure 2F). Cliquez sur" Ellipse" pour dessiner une porte sur la population de 1C, qui se trouve dans une zone condensée (porte 1C). Cliquez sur" Polygone" pour dessiner une porte sur la population 4C qui est une courbe continue (porte 4C).
- Cliquez sur« Nouvelle densité» pour créer une parcelle de densité bleu DCV vs DCV-rouge sur une échelle linéaire et appliquer la porte « 4C » ; ajuster l’échelle pour zoomer et cliquer sur "Polygone" pour dessiner une porte " 4C_1 " pour une sélection plus précise (Figure 2G).
- Cliquez sur« Nouvelle densité» pour créer une nouvelle parcelle de densité FSC-A vs BSC-A sur une échelle linéaire et appliquer la porte « 4C_1 » ; il y aura trois populations enrichies séparées par taille correspondant aux spermatocytes leptotene (L) /zygotène (Z), pachytene (P) et diplotène (D). Cliquez sur "Polygone" ou "Ellipse" pour dessiner 3 portes: « L/Z », « P », et « D » en fonction de la taille croissante (Figure 2H).
- Cliquez sur "Nouvelle parcelle de point" pour créer une parcelle de point couleur bleu DCV vs DCV-rouge sur une échelle linéaire pour appliquer la porte et s’assurer que les trois populations sont dans un ordre continu dans la porte " 4C_1 " ( Figure2I).
- De même, pour la population de 1C, cliquez sur «Nouvelle densité» pour créer une nouvelle parcelle de densité FSC-A vs BSC-A sur une échelle linéaire et appliquez la porte « 1C », sélectionnez la taille unifiée des cellules comme population ronde pure de spermatid, et cliquez sur« Ellipse» pour dessiner une porte« RS»(figure 2J).
5. Trier les sous-populations masculines de cellules germinales
- Préparez des tubes de 1,5 mL contenant 500 μL 50% FBS pour la collecte cellulaire et chargez le tube de collecte dans le collecteur et cliquez sur "Load Collection« .
- Cliquez sur "Next Tube« , "Start« , "Record" et "Sort Start« . Pour l’utilisation d’un système bi-sens qui permet de trier deux populations d’intérêt en même temps dans le dispositif de collecte, suivez des combinaisons bi-sensées : leptotene (L) /zygotène (Z) et spermatocytes pachytene (P) basés sur les portes arrière L/Z et P; Spermatocytes ronds (RS) et diplotène (D) à base de portes arrière RS et D.
- Pendant que l’échantillon est en cours d’exécution, ajustez le débit à ~3000 événements/s pour obtenir le tri le plus efficace.
6. Analyse de pureté des cellules triées
- Recueillir ≥ 10 000 cellules/chaque population. Effectuer l’immunostaining cellulaire pour confirmer le sous-scène.
- Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter soigneusement le supernatant, en gardant environ 110 μL du liquide dans le fond du tube.
- Prenez une goutte de suspension cellulaire de 10 μL pour observer au microscope et évaluer la morphologie et le nombre des cellules.
- Appliquez 100 μL de suspension cellulaire sur chacune des diapositives de chambre de l’échantillon (voir tableau des matériaux)et chargez les chambres sur le Cytospin.
- Faire tourner les échantillons à 30 x g pendant 5 min à température ambiante. Dessinez un cercle autour de la cellule avec un stylo hydrophobe. Toboggans secs sur le banc de laboratoire pendant quelques minutes à température ambiante.
- Déposez 50 μL de PBS dans le cercle de la diapositive et appuyez sur.
- Ajouter la solution d’anticorps primaires (diluer les anticorps primaires avec 5% de sérum d’âne dans PBS avec 0,02% polysorbate 20) dans le cercle de la lame et incuber à 4 °C pendant la nuit.
NOTE : Pour juger le sous-étage des spermatocytes méiotiques, SYCP3 a été détecté, qui est un marqueur des axes méiotiques de chromosome, et γH2AX, qui est un marqueur de réponse de dommages d’ADN. (Pour la concentration de travail des anticorps, veuillez consulter le Tableau des matériaux). - Appuyez sur la solution d’anticorps primaire à partir des diapositives.
- Déposez 50 μL de PBS dans le cercle de la diapositive et appuyez sur. Répétez une fois.
- Ajouter la solution secondaire d’anticorps (diluer les anticorps secondaires dans pbs avec 0,02% Polysorbate 20) dans le cercle de la glissière et incuber à température ambiante pendant 1 h dans l’obscurité.
- Déposez 50 μL de PBS dans le cercle de la diapositive et appuyez sur. Répétez une fois.
- Ajouter 50 μL de DAPI (la concentration en stock est de 0,1 μg/mL) tache pendant 5 min et appuyez sur.
- Ajouter 1-2 gouttes de supports de montage sur les diapositives. Couvrez soigneusement le support de montage avec un verre de couverture et appuyez doucement sur le verre de couverture pour enlever le support supplémentaire et la bulle d’air. Les diapositives sont prêtes pour l’évaluation de la microscopie.
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Representative Results
Un résultat représentatif de ce protocole de tri est indiqué à la figure 3. Le temps total de tri de deux testicules (une souris) est généralement d’environ 3 heures, ce qui dépend de la concentration de suspension cellulaire et de la vitesse de tri. Après le tri, la pureté des spermatocytes est confirmée par l’immunostaining de SYCP3 et γH2AX (Figure 3A). La pureté représentative des fractions triées de spermatocytes L/Z, P, D est d’environ 80,4 %, 90,6 % et 87,6 %, respectivement (figure 3C). Nous avons déterminé les sous-scènes en fonction des critères que nous avons publiés précédemment19. En bref, dans le stade leptotene et zygotène, la synapse entre les chromosomes homologues est incomplète, ce qui est indiqué par de minces fils de coloration SYCP3. De larges domaines γH2AX sont observés dans toute la chromatine nucléaire en raison de ruptures programmées de l’ADN à double brin. Au stade du pachytene, les chromosomes homologues se sont complètement synchronisés, et γH2AX s’accumule spécifiquement sur les chromosomes sexuels. Au stade du diplotène, les chromosomes homologues subissent progressivement une desynapsie. La pureté de RS est confirmée par la coloration du noyau avec DCV (Figure 3B). RS peut être jugé avec précision avec la coloration de l’ADN: un chromocenter unique DAPI-intense entouré d’euchromatine; ou combiner avec des marqueurs spécifiques, tels que Sp56 qui est exprimé dans le granule acrosomal en développement de spermatid et sa variante histone H1T qui est fortement exprimé dans le noyau après le stade mi-pachytene (Figure 3B).
La pureté rs est d’environ 90,1% après le tri( Figure 3C). La taille de l’échantillon de l’analyse de pureté est de plus de 1000 cellules pour chaque expérience; la pureté des populations de L/P et D est moyenne à partir de 6 expériences indépendantes; la pureté des populations de P et de RS est moyenne de 3 expériences indépendantes. La viabilité de ces cellules isolées est généralement de plus de 95 %(figure S1). Le rendement total de chaque fraction d’une seule souris adulte est estimé et répertorié à la figure 3C, qui fournit suffisamment de cellules pour diverses analyses en aval. Récemment, nous avons utilisé ce protocole pour isoler les spermatocytes pachytene de type sauvage pour l’analyse ChIP-seq20,21.
| Réactif | Ingrédient | Concentration des stocks | Volume |
| (Base HBSS) | |||
| Tampon de dissociation | Dmem | - | 2 ml |
| (Base DMEM) | Fbs | - | 40 μl |
| Hyaluronidase | 100 mg/ml | 30 μl | |
| DNase I | 10 mg/ml | 50 μl | |
| Collagène Type I | 100 mg/ml | 40 μl | |
| Collagène recombinant | 14000 unité/ml | 100 μl | |
| Tampon FACS | Pbs | - | 980 ml |
| (Base PBS) | Fbs | - | 20 ml |
Tableau 1 : Recette de reagent. Le tampon de dissociation doit être préparé juste avant l’utilisation. DMEM d’avant-guerre avant de commencer la dissection. Les stocks d’enzymes peuvent être préparés à tout moment avant l’expérience et stockés à -20 °C. Le tampon FACS doit être filtré sous vide et stocké à 4 °C; température ambiante avant utilisation.
Figure 1 : Flux de travail des cellules spermatogéniques murines isolées sur le tri à base de DCV. Cette image illustre la procédure générale, de la dissociation des tissus au tri facs, à la récolte de cellules spermatogenic isolées dans un délai d’un jour. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyse facs des cellules testiculaires murines adultes basées sur la fluorescence du DCV et la diffusion de la lumière. (A) Acquis des cellules non tachées dans la première décennie d’une parcelle d’histogramme bleu DCV (côté gauche de la barre rouge). (B) (C) Débris et cellules non-simples exclus par la diffusion de la lumière. (D) Exclusion des cellules non tachées et de la population latérale basée sur la fluorescence du DCV. (E) détermination du contenu de l’ADN basée sur la fluorescence bleu DCV. Le pic gauche (vert) et le pic droit (rose) correspondent aux populations de 1C et 4C. (F) Gating sur les populations testiculaires 1C et 4C basées sur la fluorescence DCV-bleu/DCV-rouge. (G) G) Gating précis sur les populations testiculaires 4C. (H) Back-gating de la porte 4C de la parcelle DCV sur une parcelle FSC / BSC. Basées sur des régions où le chevauchement est minimal sur la parcelle FSC/BSC, les portes L/Z, P et D sont créées pour enrichir leurs populations respectives de spermatozoïdes. (I) Parcelle de points de couleur montrant les populations L/Z, P et D sont en ordre continu dans la porte 4C. (J) Back-gating de la porte 1C de la parcelle DCV sur une parcelle FSC / BSC. La porte RS a été créée pour enrichir la population ronde de spermatids avec la taille uniforme, ayant pour résultat une plus grande pureté des populations pendant le tri. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Images représentatives des résultats et statistiques des spermatogénogènes obtenues à partir du tri. (A) Caractérisation immunofluorescence des spermatocytes triés. Panneau supérieur : Coloration de DCV montrant le modèle de noyau des spermatocytes vivants juste après tri ; L/Z (leptotene/zygotène), P (pachytene) et D (diplotène). Panneau inférieur : Confirmation des sous-étapes méiotiques pour chaque population par immunostaining pour SYCP3 (vert) et γH2AX (rouge). (B) Image DCV représentative montrant le modèle de noyau de RS. Barres d’échelle : 50 μm (panneaux supérieurs) et 10 μm (panneaux grossissants inférieurs). Panneaux de droite : Confirmation d’immunofluorescence des spermatidés ronds tachés avec Sp56 et H1T. (C) La pureté de L/Z, P, et D ont été confirmées par immunostaining, taille de l’échantillon était plus de 1.000 cellules pour chaque expérience indépendante, au total 6 expériences indépendantes. La pureté RS a été confirmée par la coloration du noyau avec un total de 3 expériences indépendantes. Le nombre total de cellules de la suspension cellulaire testiculaire d’une souris WT B6 vieille de 8 semaines était d’environ 100 millions de cellules avant le tri. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure S1 : Viabilité des spermatocytes pachytene isolés. Une image représentative montre la viabilité cellulaire des spermatocytes pachytene isolés (rouge : PI ; Bleu: DCV). L’IP n’a pas pu être combiné avec le DCV pendant le tri. Toutefois, au microscope, le signal rouge DCV était assez faible; par conséquent, les cellules mortes PI-positives ont été facilement distinguées des autres cellules vivantes. La viabilité est généralement de plus de 95%. Barres d’échelle : 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure S2 : La dissociation incomplète ou les débris perturbent les gations. La population A (cercle rouge) contient des débris et du polymère de spermaturdes (indiqués par flèche). La population A la plus importante croise avec la population B (cercle jaune) et contaminera éventuellement la population de 4°C. Barres d’échelle : 200 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Ici nous présentons un protocole pratique et simple pour isoler des sous-populations des spermatocytes et des spermatds d’une souris mâle adulte simple. Pour assurer la reproductibilité de ce protocole, certaines étapes critiques doivent être prises. Avant la digestion des enzymes, l’étape de lavage vise à éliminer les cellules interstitielles; après digestion, cette étape aide à enlever le spermatozoa et les débris. Le lavage/centrifugage 3 fois est important. Dans notre recette tampon de dissociation, la combinaison de plusieurs enzymes différentes facilite la dissociation des testicules dans la suspension à cellule unique sans dommages cellulaires excessifs. Le pipetting doucement pour éviter de causer des bulles d’air aide également à protéger l’intégrité de cellules. S’il vous plaît vérifier la suspension cellulaire au microscope après la dissociation pour s’assurer que la suspension atteint le niveau d’une seule cellule. La dissociation incomplète ou la contamination par les débris par digestion excessive affectera la pureté des cellules triées; comme le montre la figure S2, la population verticale contient des débris et du tétramer de spermaturdes. La coloration du DCV nécessite une incubation dans l’obscurité et aucun lavage par la suite.
Pour résoudre les difficultés potentielles sur le gating et le back-gating des sous-populations de spermatocytes, comme option d’optimisation, nous recommandons d’utiliser une souris synchronisée de type sauvage pour aider à localiser un stade spécifique des spermatocytes22,23,24. Il est également intéressant de noter que certaines souches de souris KNOCKOUT avec phénotypes d’arrêt spermatogenèse peuvent avoir des profils de DCV rares parce qu’ils manquent certaines sous-populations. Une bonne lutte contre les types sauvages est fortement recommandée dans ce cas. En outre, ce protocole peut être potentiellement appliqué aux souris adultes de tout âge. Cependant, l’âge de la souris expérimentale pourrait être un facteur de confusion en raison de la proportion variable de cellules germinales.
Au fil des ans, plusieurs protocoles de purification des cellules germinales ont été mis au point. Comme l’une des méthodes les plus populaires, sta-PUT sédimentation vitesse sépare les cellules germinales par le gradient BSA et fournit un bon rendement de cellules germinales intactes6,7. Toutefois, STA-PUT nécessite non seulement des dispositifs spéciaux qui ne sont peut-être pas facilement accessibles à de nombreux laboratoires, mais qui prennent aussi beaucoup de temps et de main-d’œuvre pour être conduits dans une pièce froide à 4 °C. Contrairement à STA-PUT, qui convient à la séparation à grande échelle, cette méthode à base de FACS pourrait fournir une pureté élevée et une fraction précise pour une expérience à petite échelle. Un tri à grande échelle à l’aide de notre protocole est possible, mais prolongera considérablement le temps de tri et peut compromettre la viabilité des cellules. Par conséquent, STA-PUT est toujours une option pratique quand un grand nombre de cellules est nécessaire5,25,26.
Par rapport à la méthode FACS précédente basée sur ho342 colorant colorant8, 9,10,11, notre protocole utilise DCV, qui a un spectre d’excitation plus large et peut être appliqué à la plupart des trieurs FACS actuels équipés d’un UV ou 405 nm violet laser18. Bien qu’il existe un autre protocole utilisant DCG14,15,16,17, la différence entre notre protocole et le protocole DCG est que notre protocole DCV utilise la séparation bidimensionnelle avec bleu DCV et rouge DCV, imitant l’avantage du protocole Ho342. Avec cet avantage, notre protocole DCV nous permet d’isoler les cellules germinales hautement enrichies des testicules adultes. Le protocole DCG n’utilise pas de séparation bidimensionnelle et est recommandé pour l’isolement des cellules germinales des souris juvéniles. La séparation bidimensionnelle peut avoir une meilleure résolution pour séparer les sous-étapes des spermatocytes. Cependant, notre méthode est toujours incapable d’isoler les spermatocytes de leptotene et de zygotène séparément, aussi bien que les types de cellules de « 2C » comprenant le spermatogonia, les spermatocytes de preleptotene, et les spermatocytes secondaires.
Étant donné que le large spectre d’émissions de taches de DCV provoque des fuites vers d’autres canaux, la plupart des colorants de viabilité cellulaire comme pi et 7AAD ne peuvent pas être combinés en raison de faux signaux positifs. D’autres dyes de viabilité cellulaire avec émission dans les canaux infrarouges lointains ou proches pourraient être la peine d’essayer à l’avenir. Mais d’après notre expérience, les cellules triées montrent habituellement ≥ une viabilité de 95 % après 2 heures de tri facs (figure S1), ce qui est suffisant pour l’analyse en aval.
Les cellules triées obtenues à partir de notre procédé peuvent être utilisées pour diverses expériences en aval, y compris l’analyse de séquençage de prochaine génération (ARN-seq, ATAC-seq et ChIP-seq). Les cellules obtenues ici peuvent également être utilisées pour la culture à courtterme 27. En conclusion, nous fournissons un protocole simple mais efficace comprenant une procédure de préparation de suspension d’une seule cellule d’une heure et la stratégie détaillée de gating pour FACS basée sur la coloration de colorant de DCV, qui convient à l’isolement spermatogenic à petite échelle de cellules et peut être rapidement adoptée par beaucoup d’investigateurs, même les débutants de cytométrie de flux.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions les membres des laboratoires Namekawa, Yoshida et Maezawa pour leur aide; Katie Gerhardt pour l’édition du manuscrit; Mary Ann Handel pour avoir partagé l’anticorps H1T, le centre de cytométrie de flux de recherche du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) pour le partage de l’équipement FACS soutenu par nih S10OD023410; Subvention d’aide à la recherche scientifique (KAKENHI; 17K07424) à T.N.; Bourse postdoctorale de la Fondation Lalor aux AA; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) à S.Y.; la subvention du projet de recherche de la Division des services de recherche de l’Université d’Azabu, Programme soutenu par le ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (MEXT) pour le Projet d’image de marque de la recherche universitaire privée (2016-2019), la subvention d’aide au démarrage d’activités de recherche (19K21196), la Takeda Science Foundation (2019) et la Subvention pour l’encouragement à la recherche de la Fondation commémorative Uehara (2018) à S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 à S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
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