Denne protokollen bruker en immunfluorescensanalyse for å oppdage PM2,5-indusertDNA-skade i dissekerte hjerter av sebrafiskembryoer.
Omgivende fint svevestøv (PM2.5) eksponering kan føre til hjerteutviklingstoksisitet, men de underliggende molekylære mekanismene er fortsatt uklare. 8-hydroksy-2’deoksygenase (8-OHdG) er en markør for oksidativ DNA-skade og γH2AX er en følsom markør for DNA-dobbeltstrengsbrudd. I denne studien hadde vi som mål å oppdage PM2,5-induserte8-OHdG- og γH2AX-endringer i hjertet av sebrafiskembryoer ved hjelp av en immunfluorescensanalyse. Sebrafiskembryoer ble behandlet med ekstraherbare organiske stoffer (EOM) fra PM2,5 ved 5 μg/ml i nærvær eller fravær av antioksidant N-acetyl-L-cystein (NAC, 0,25 μM) ved 2 timers etterbefruktning (hpf). DMSO ble brukt som kjøretøykontroll. Ved 72 hkf ble hjerter dissekert fra embryoer ved hjelp av en sprøytenål og festet og permeabilisert. Etter å ha blitt blokkert, ble prøver undersøkt med primære antistoffer mot 8-OHdG og γH2AX. Prøver ble deretter vasket og inkubert med sekundære antistoffer. De resulterende bildene ble observert under fluorescensmikroskopi og kvantifisert ved hjelp av ImageJ. Resultatene viser at EOM fra PM2,5 signifikant forbedret 8-OHdG- og γH2AX-signaler i hjertet av sebrafiskembryoer. Nac, som fungerer som en reaktiv oksygenart (ROS) scavenger, motvirket imidlertid delvis den EOM-induserte DNA-skaden. Her presenterer vi en immunfluorescence protokoll for å undersøke rollen som DNA-skade i PM2.5-induserte hjertefeil som kan brukes på påvisning av miljøkjemisk-indusert protein uttrykk endringer i hjertene til sebrafisk embryoer.
Luftforurensning er nå et alvorlig miljøproblem verden står overfor. Omgivende fint svevestøv (PM2.5), som er en av de viktigste indikatorene for luftkvalitet, kan bære et stort antall skadelige stoffer og komme inn i blodsirkulasjonssystemet, noe som forårsaker alvorlig skade på menneskers helse1. Epidemiologi studier har vist at PM2.5 eksponering kan føre til økt risiko for medfødte hjertefeil (CHDs)2,3. Bevis fra dyreforsøk viste også at PM2.5 kan forårsake unormal hjerteutvikling i sebrafiskembryoer og avkom av mus, men de molekylære mekanismene for hjerteutviklingstoksisiteten til PM2.5 er fortsatt stort sett ukjent4,5,6.
DNA-skade kan forårsake cellesyklusstans og indusere apoptose, noe som i stor grad kan ødelegge potensialet til stamceller og dermed svekkehjerteutviklingen 7). Det er godt dokumentert at miljøgifter, inkludert PM2.5, har potensial til å angripe DNA gjennom oksidative stressmekanismer8,9. Både menneskelig og sebrafisk hjerteutvikling er følsom for oksidativt stress10,11,12. 8-OHdG er en oksidativ DNA-skademarkør, og γH2AX-signal er en markør for DNA-dobbeltstrengsbrudd. N-acetyl-L-cystein (NAC), en syntetisk forløper for intracellulær cystein og glutathione, er mye brukt som en antioksidantforbindelse. I denne studien bruker vi NAC til å undersøke rollen som oksidativt stress i PM2.5– indusert DNA-skade13.
Sebrafisk som modell vertebrat har blitt mye brukt til å studere hjerteutvikling og menneskelige kardiovaskulære sykdommer fordi mekanismer for hjerteutvikling er høyt bevart blant vertebrater14,15. Fordelene ved å bruke sebrafisk som modell inkluderer deres lille størrelse, sterke reproduktive evne og lave fôringskostnader. Av spesiell interesse for disse studiene er sebrafisk embryoer ikke avhengige av sirkulasjonssystemet under tidlig utvikling og kan overleve alvorlighjertefeildannelse 14. Videre tillater deres gjennomsiktighet hele kroppen å bli direkte observert under et mikroskop. Dermed gir sebrafiskembryoer en enestående mulighet til å vurdere molekylære mekanismer som er involvert i induksjon av hjerteutviklingstoksisitet som følge av eksponering for ulike miljøkjemikalier5,16,17. Vi har tidligere rapportert at PM2,5-indusertoksidativt stress fører til DNA-skade og apoptose, noe som resulterer i hjerte misdannelser i sebrafisk18. I denne studien gir vi en detaljert protokoll for undersøkelse av PM2,5-indusertDNA-skade i hjertet av sebrafiskembryoer.
Selv om sebrafisk er en utmerket virveldyrmodell for å studere hjerteutviklingstoksisiteten til miljøkjemikalier, på grunn av den lille størrelsen på embryohjertet, er det vanskelig å skaffe nok protein til vestlig blotanalyse. Derfor presenterer vi en sensitiv immunfluorescensmetode for å kvantifisere proteinuttrykksnivåene av DNA-skadebiomarkører i hjertene til sebrafiskembryoer utsatt for PM2.5.
Under disseksjonen er det viktig å holde hjertets integritet intakt. Vår e…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Nature Sciences Foundation of China (Grant number: 81870239, 81741005, 81972999) og The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |