Summary
توضح هذه المقالة الإجراءات المستخدمة لتقييم سمية الأشعة فوق البنفسجية والسموم الكيميائية على خط الخلية الأولية والخالدة.
Abstract
توضح هذه المقالة طرق قياس سمية الأشعة فوق البنفسجية (UV) والسموم العينية على مزارع الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية (pHCEC) والخالدة (iHCEC). تعرضت الخلايا للأشعة فوق البنفسجية والجرعات السامة من كلوريد البنزالكونيوم (BAK) وبيروكسيد الهيدروجين (H 2O2) وكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). تم قياس النشاط الأيضي باستخدام مقايسة التمثيل الغذائي. تم قياس إطلاق السيتوكينات الالتهابية باستخدام إنترلوكين متعدد الإرسال (IL) -1β و IL-6 و IL-8 ومقايسة عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، وتم تقييم الخلايا للتأكد من صلاحيتها باستخدام الأصباغ الفلورية.
حدثت الآثار الضارة للأشعة فوق البنفسجية على النشاط الأيضي للخلايا وإطلاق السيتوكين في 5 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية ل iHCEC و 20 دقيقة ل pHCEC. حدثت انخفاضات مماثلة في النسبة المئوية في النشاط الأيضي ل iHCEC و pHCEC بعد التعرض ل BAK أو H2O2 أو SDS ، وحدثت أهم التغييرات في إطلاق السيتوكين ل IL-6 و IL-8. أظهر الفحص المجهري للخلايا المعرضة ل iHCEC و pHCEC BAK الملطخة بالفلورسنت موت الخلايا عند التعرض بنسبة 0.005٪ ل BAK ، على الرغم من أن درجة تلطيخ الإيثيديوم كانت أكبر في iHCECs من pHCECs. باستخدام طرق متعددة لتقييم التأثيرات السامة باستخدام الفحص المجهري ، وتقييم النشاط الأيضي ، وإنتاج السيتوكين ، يمكن تحديد سمية الأشعة فوق البنفسجية والسموم الكيميائية لكل من خطوط الخلايا الأولية والخالدة.
Introduction
يتم إجراء دراسات علم السموم في المختبر للتنبؤ بالآثار السامة للمواد الكيميائية والعوامل الأخرى التي يمكن أن تسبب تلفا للخلايا. في تقييم السمية للقرنية ، تم استخدام الخلايا الظهارية القرنية البشرية (HCECs) في نماذج لتقييم هذه التأثيرات1،2،3،4. تقوم هذه النماذج عادة بتقييم التأثيرات الفسيولوجية مثل التغيرات في النشاط الأيضي للخلية ، وتكاثر الخلايا ، ووظائف الخلية الأخرى مثل إنتاج وإطلاق السيتوكينات الالتهابية. بالنسبة لدراسات السموم هذه ، تم اختيار خلايا من مصادر مختلفة لتقييم الآثار الضارة للمواد الكيميائية والأشعة فوق البنفسجية على HCECs 2,3. تتوفر خطوط pHCEC من الشركات التي توفر هذه الخلايا من الأنسجة المانحة للبالغين. يمكن علاج الخلايا الأولية ب dispase وكشط القرنية بلطف للثقافة5. ثم يتم اختبار الخلايا بحثا عن الفيروسات والتلوث ثم يتم شحنها بالتبريد في 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
ميزة خطوط الخلايا الأولية هي أن الخلايا متطابقة وراثيا مع خلايا المتبرع. هذا مثالي ، حيث يجب أن يحاكي النموذج في المختبر الأنسجة في الجسم الحي قدر الإمكان. عيب خطوط الخلايا الأولية هو أن لديها عددا محدودا من انقسامات الخلايا أو الممرات6. يحد العدد المحدود من الخلايا المتاحة من عدد التجارب التي يمكن إجراؤها باستخدام ثقافة أولية واحدة ، مما يزيد من تكلفة التجارب.
كما تم استخدام خطوط الخلايا الخالدة في نماذج سمية زراعة الخلايا. ومع ذلك ، على عكس خط الخلية الأساسي الذي تم الحصول عليه من الأنسجة الحية ، فقد تم تغيير خط الخلية الخالد وراثيا. يتم إنشاء الخلايا الخالدة عن طريق دمج جينات الفيروس في الحمض النووي للخلايا الأولية6،7،8. يتم اختيار الخلايا ذات الدمج الجيني الفيروسي الناجح لخط الخلية الخالد. ميزة الخلود هي أنه يسمح بالانتشار السريع إلى أجل غير مسمى ، مما يوفر عددا غير محدود من الخلايا لإجراء تجارب متعددة باستخدام نفس خط الخلية. هذا يسمح بالاتساق بين التجارب ويقلل التكلفة.
بالإضافة إلى التغيرات في الجينات التي تحد من تكاثر الخلايا ، يمكن أن تحدث أيضا تغييرات في التعبير عن الجينات ذات الوظائف الحرجة9. لذلك ، فإن عيب استخدام الخلايا الخالدة هو أنها قد لا تمثل الخلايا الأصلية في الجسم الحي من حيث استجابتها للمحفزات الخارجية المختلفة10. تضمنت المقارنات مراقبة الآثار السامة للمواد الكيميائية على الخلايا القرنية البشرية الأولية والخالدة11 ، وكذلك HCECs الخالدة والخلايا الأولية الظهارية لقرنيةالأرانب 12. أظهرت المقارنة بين تأثيرات السموم على خلايا القرنية البشرية الأولية والخلايا القرنية الخالدة عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية11. باستخدام الطرق المفصلة في هذه المقالة ، سيتم تحديد فعالية هذه المقايسات لتقييم سمية الأشعة فوق البنفسجية والسموم العينية على pHCECs و iHCECs.
تم اختيار ثلاثة سموم عينية شائعة الاستخدام في المقايسات المختبرية: BAK و H2O2 و SDS. BAK هو مادة حافظة كاتيونية شائعة الاستخدام في محاليل العيون 13،14 ، H 2 O2يستخدم عادة لتطهير العدسات اللاصقة 15 ، و SDS هو خافض للتوتر السطحي أنيوني موجود في المنظفات والشامبو 14. على غرار السموم العينية ، يمكن أن تسبب الأشعة فوق البنفسجية أيضا أضرارا كبيرة ل HCECs3. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسبب التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية حالة عينية تعرف باسم التهاب القرنية الضوئي تتميز بأعراض التمزق والحساسية للضوء والشعور بالحصى16.
هناك عدد غير محدود من مزارع الخلايا الأولية التي يمكن استخدامها والعديد من خطوط الخلايا الخالدة التي تم تطويرها. لذلك ، تم إجراء تحقيق لمقارنة HCECs الأولية بخط HCEC الخالد لتحديد أوجه التشابه والاختلاف بين النماذج التي تتضمن هذه الأنواع من الخلايا.
استخدم هذا التحقيق الفحص المجهري لتقييم الاختلافات المحتملة بين pHCECs و iHCECs على الاستجابة الفسيولوجية للخلايا للأشعة فوق البنفسجية والسموم. كما تم تقييم آثار الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية على النشاط الأيضي للخلايا وإطلاق السيتوكين الالتهابي لخطي الخلية. تكمن أهمية تحديد الاختلافات بين خطي الخلية في فهم الاستخدام الأمثل لخطوط الخلايا هذه لتقييم: 1) تأثير الأشعة فوق البنفسجية على الخلايا ، 2) آثار السموم على الخلايا ، و 3) التغييرات الناتجة في التمثيل الغذائي ، وصلاحية الخلية ، وإطلاق السيتوكين الخلوي للدراسات المستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ثقافة pHCECs و iHCECs
- قم بتنمية pHCECs و iHCECs في الوسط الظهاري العيني البشري (HOEM) مع المكملات التالية: 6 mM L-glutamine ، 0.002٪ مكمل وسائط الخلية O (جدول المواد) ، 1.0 ميكرومتر ادرينالين ، 0.4٪ مكمل وسائط الخلية P (جدول المواد) ، 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين rh ، 5 ميكروغرام / مل apo-transferrin ، و 100 نانوغرام / مل هيدروكورتيزون هيميسوكسينات في قوارير الثقافة المغلفة بالكولاجين -1 (18 مل في دورق ثقافة 75 سم2).
- قم بتغيير الوسط في القوارير كل 2-3 أيام عن طريق إزالة الوسط بعد نمو الخلايا إلى ~ 80٪ التقاء. أضف محلول التفكك بدون الفينول الأحمر واحتضن القارورة عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا تماما. تحييد محلول التفكك باستخدام DMEM / F12 مع المصل ثم طرد الخلايا عند 500 × جم. قم بإزالة الوسط الطافي وأعد تعليق الخلايا في وسط HOEM.
2. تحديد حجم الخلية باستخدام المجهر متحد البؤر
- قم بزرع كل من pHCECs و iHCECs على أطباق بتري المغلفة بالكولاجين مع أغطية زجاجية القاع بتركيز 1 × 105 مع 1 مل من HOEM. قم بزراعة pHCECs و iHCECs ، مجموعة واحدة من الثقافات لمدة 24 ساعة ومجموعة أخرى من الثقافات لمدة 48 ساعة ، في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- بعد فترة الحضانة ، قم بتلطيخ الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول عازل تلطيخ الملحق يحتوي على الكالسيين (4 ميكرومتر) ، إيثيديوم هوموديمر-1 (8 ميكرومتر) ، والملحق الخامس (5 ميكرولتر في 500 ميكرولتر عازلة - أليكسا فلور 647 مترافق) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد تلطيخ الخلايا ، اضبط المجهر لالتقاط الأطوال الموجية للإثارة / الانبعاث البالغة 488/515 نانومتر للكالسيين-AM ، و 543/600 نانومتر للإيثيديوم هوموديمر-1 ، و 633/665 نانومتر للملحق الخامس باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.
- احصل على الصور والتقط مكدسات Z لتقييم حجم الخلية في ثلاثة أبعاد.
- للحصول على الصور ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) ، ابحث عن المنطقة المراد تصويرها باستخدام هدف مائي apochromat 40x / 1.2. باستخدام ليزر Argon (488) (المسح الأول) و HeNe1 (543) (المسح الثاني و HeNe2 (633) (المسح الثالث) ، قم بالمسح في ثلاث قنوات منفصلة باستخدام مقسمات الحزمة ، HFT 488/543/633 ، NFT 635 Vis ، و NFT 545 LP560 ، LP505.
- استخدم المسح المتسلسل متعدد المسارات لتقليل الحديث المتبادل.
ملاحظة: يستخدم LP505 للقناة 2 مع ليزر 488 لالتقاط انبعاث صبغة الكالسيين. يستخدم LP560 في القناة 3 مع ليزر 543 لالتقاط انبعاث إيثيديوم هوموديمر 1. يستخدم NFT 635 مع ليزر 633 لالتقاط انبعاث الملحق V. الغرض من HFT هو فصل ضوء الإثارة والانبعاث. يقسم NFT الضوء عن طريق عكس الضوء < الطول الموجي المحدد إلى قناة منفصلة مع السماح للضوء > طول موجي محدد بالمرور إلى قناة ثانية. تمنع مرشحات LP الأطوال الموجية الأقصر من الطول الموجي المحدد وتسمح للأطوال الموجية الأطول بالمرور. - للتصوير في 3D ، اضبط البؤر على Z-stack وامسح 20 إطارا على الأقل.
3. تعرض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية
- قم بزرع الخلايا عند 5 × 104 / مل من HOEM في كل بئر من صفيحة استزراع مغلفة بالكولاجين -1 مكونة من 24 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 3 ساعات. بعد فترة الحضانة ، قلل حجم الوسط في الآبار إلى 300 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بتعريض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية (كل من UVA عند 6.48 W / m 2 و UVB عند 1.82 W / m2 حيث يتم تشغيل كل من أنابيب UVA و UVB في الحاضنة في نفس الوقت) في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 و 20 دقيقة في تجارب منفصلة.
- بعد الأشعة فوق البنفسجية ، أضف 200 ميكرولتر من HOEM الطازج إلى كل بئر واحتضانها لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- بعد الحضانة ، اجمع طاف الخلية في كل بئر وانقله إلى أنابيب معقمة من مادة البولي بروبيلين سعة 2 مل. تجمد عند -80 درجة مئوية. لتحديد مستويات السيتوكين الصادرة عن pHCECs و iHCECs بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، استخدم مقايسة السيتوكين المتعدد واتبع تعليمات المجموعة لتحديد كمية السيتوكينات الأربعة التالية: IL-6 و IL-8 و IL-1β و TNF-α.
- أضف كاشف الفحص الأيضي إلى الخلايا الموجودة في الآبار.
- تحضير كاشف فحص التمثيل الغذائي بنسبة 10٪ في DMEM / F12. استبدل وسط الاستزراع في كل بئر ب 1 مل من محلول الفحص الأيضي بنسبة 10٪ واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 ساعات.
- قم بقياس مضان كل محلول باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت عند أطوال موجية للإثارة / الانبعاث 530/590 نانومتر.
4. تعرض الخلايا للسموم الكيميائية
- خلايا البذور عند 5 × 104 / مل من HOEM في كل بئر من صفيحة استزراع مغلفة بالكولاجين -1 24 بئرا وحضنها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 3 ساعات. بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة الوسط وتعريض الخلايا ل 1 مل من السموم الكيميائية (BAK 0.001٪ ، H 2 O20.01٪ ، و SDS 0.0025٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)) لمدة 5 و 15 دقيقة.
- بعد التعرض للسموم الكيميائية ، قم بإزالة السموم من الآبار ، واشطفها ب 1 مل من PBS ، وأضف 1 مل من HOEM إلى كل بئر. بعد 20 ساعة من الحضانة ، قم بإجراء مقايسة التمثيل الغذائي عن طريق استبدال الوسط ب 1 مل من محلول مقايسة التمثيل الغذائي بنسبة 10٪ والحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 ساعات. قم بقياس التألق باستخدام قارئ لوحة مضان متعدد الآبار عند أطوال موجية للإثارة / الانبعاث 530/590 نانومتر.
- نقل طافات الخلايا من الآبار بعد حضانة 20 ساعة إلى أنابيب بولي بروبيلين معقمة منفصلة سعة 2 مل وتجميدها عند -80 درجة مئوية. تحديد كمية السيتوكينات المنبعثة من pHCECs و iHCECs بعد التعرض للمواد الكيميائية. استخدم نفس منصة تعدد الإرسال المستخدمة لتقييم السيتوكينات من الخلايا المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية. استخدم مقايسة السيتوكين المتعدد باتباع تعليمات المجموعة لتحديد كمية السيتوكينات الأربعة التالية: IL-6 و IL-8 و IL-1β و TNF-α.
5. فحص الخلايا المعرضة لتركيزات مختلفة من BAK
- خلايا البذور عند 1 × 10 5 / مل من HOEM في كل بئر من صفيحة استزراع مغلفة بالكولاجين -1 مكونة من 24 بئرا وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع5٪ CO2 لمدة 24 ساعة. بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة الوسط وتعريض الخلايا ل 1 مل من السموم الكيميائية (BAK 0.001٪ ، BAK 0.005٪ ، و BAK 0.01٪ في PBS) لمدة 5 دقائق.
- بعد التعرض ، قم بإزالة السموم الكيميائية ، وشطف الآبار ب 1 مل من PBS ، وإضافة 1 مل من HOEM إلى كل بئر. بعد 20 ساعة من الحضانة ، قم بتلطيخ الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول عازل تلطيخ الملحق يحتوي على الكالسيين (4 ميكرومتر) ، إيثيديوم هوموديمر-1 (8 ميكرومتر) ، والملحق الخامس (5 ميكرولتر في 500 ميكرولتر عازلة - أليكسا فلور 647 مترافق) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اضبط المجهر لقياس شدة تلطيخ الملحق V والكالسيين AM والإيثيديوم -1 عند الأطوال الموجية للإثارة / الانبعاث 630/675 نانومتر و 495/515 نانومتر و 528/617 نانومتر على التوالي. صورة الخلايا باستخدام المجهر الفلوري
6. تحليل البيانات
- قم بإجراء اختبار الحالة الطبيعية واختبار الفروق المتساوية قبل إجراء تحليل التباين (ANOVA) أو اختبار Welch ANOVA أو Kruskal-Wallis. استخدم الاختبار اللاحق المناسب لمقارنة كل مجموعة تم اختبارها. اضبط p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حجم الخلية
تم تصور HCECs الأولية والخالدة بثلاثة أصباغ فلورية ، والتي تعكس ثلاث مراحل مختلفة من صلاحية الخلية. الخلايا الحية خضراء (calcein-AM) ، والخلايا الميتة حمراء (ethidium homodimer-1) ، والخلايا المبرمج صفراء (لون ملحق V- مضبوط بالكمبيوتر لتصور أفضل للإشارة الفلورية). تحتوي الخلايا الحية على استرات في سيتوبلازم الخلية وتحول الكالسين-AM إلى الكالسيين. تحتوي الخلايا الميتة على أغشية خلوية منفذة للإيثيديوم هوموديمر-1. الخلايا المبرمج لها تلطيخ في غشاء الخلية حيث يتم نقل فوسفاتيديل سيرين إلى الغشاء الخارجي.
تم إجراء مقارنة بين حجم الخلية لنوعي HCECs بعد 24 و 48 ساعة من النمو باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، كما هو موضح في الشكل 1. iHCECs (الشكل 1A) هي خلايا أصغر تتراوح من 10 ميكرومتر إلى 20 ميكرومتر ، ويتراوح حجم pHCECs (الشكل 1B) من 20 ميكرومتر إلى 50 ميكرومتر بعد 24 ساعة من النمو. لوحظت اختلافات مماثلة في نطاق الحجم ل iHCECs (الشكل 1C) و pHCECs (الشكل 1D) بعد 48 ساعة من النمو. تم إجراء صور ثلاثية الأبعاد لنوعين من HCECs باستخدام المجهر متحد البؤر (يوضح الشكل 2A pHCECs; يوضح الشكل 2B iHCECs).
الشكل 1: مقارنة حجم الخلية باستخدام المجهر متحد البؤر . iHCECs بعد 24 (A) و 48 (C) h من النمو مع خلايا يتراوح حجمها من 10 إلى 20 ميكرومتر. pHCECs بعد 24 (B) و 48 (D) h من النمو مع خلايا يتراوح حجمها من 20 إلى 50 ميكرومتر. 40x هدف المياه. قضبان المقياس = 10 و 20 ميكرومتر (أ) ؛ 25 و 50 ميكرومتر (ب) ؛ 10 و 20 ميكرومتر (ج) ؛ 50 ميكرومتر (د). الاختصارات: iHCECs = خلدت الخلايا الظهارية القرنية البشرية. pHCECs = الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور ثلاثية البؤر ثلاثية الأبعاد. صور ثلاثية البؤر لمركبات الكربون الهيدروكربونية بعد 48 ساعة من النمو (A) و iHCECs بعد 24 ساعة (B). 40x هدف المياه. الاختصارات: iHCECs = خلدت الخلايا الظهارية القرنية البشرية. pHCECs = الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تأثير الأشعة فوق البنفسجية على HCECs الأولية والخالدة
يتم عرض النشاط الأيضي لكل من HCECs الأولية والخالدة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية في الشكل 3. يوضح الشكل الوسائل الطبيعية من آبار الاختبار (الآبار الرباعية ، تجربتان منفصلتان). بالمقارنة مع الخلايا غير المعرضة للأشعة فوق البنفسجية ، انخفض النشاط الأيضي ل pHCECs المشععة بشكل كبير عند 20 دقيقة من التعرض. بالنسبة ل iHCECs ، انخفض النشاط الأيضي للخلايا المشععة في كل من 5 و 20 دقيقة. لذلك ، استغرق الأمر وقتا أطول للتعرض لتقليل النشاط الأيضي ل pHCECs من iHCECs.
الشكل 3: النشاط الأيضي ل pHCECs و iHCECs بعد التعرض ل 5 و 20 دقيقة من الأشعة فوق البنفسجية. * p < 0.05 من عنصر التحكم غير المعرض للأشعة فوق البنفسجية. التحكم غير المعرض للأشعة فوق البنفسجية عبارة عن خلايا في آبار محتضنة بعينات الاختبار ولكنها غير معرضة للأشعة فوق البنفسجية. المحور Y هو النسبة المئوية للنشاط الأيضي للخلايا غير المعرضة للأشعة فوق البنفسجية. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. الاختصارات: iHCECs = خلدت الخلايا الظهارية القرنية البشرية. pHCECs = الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية ؛ الأشعة فوق البنفسجية = الأشعة فوق البنفسجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يوضح الشكل 4 تأثير التعرض للأشعة فوق البنفسجية على إطلاق السيتوكينات الالتهابية من HCECs. حدث الحد الأقصى لإطلاق السيتوكين في أوقات مختلفة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية ل HCECs الأولية والخالدة. كان الحد الأقصى لإطلاق السيتوكين بواسطة iHCECs عند 5 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية. أطلقت الخلايا مستويات كبيرة (p < 0.05) من IL-1β و IL-6 و IL-8 مقارنة بالخلايا غير المعرضة للأشعة فوق البنفسجية. علاوة على ذلك ، لم يحدث إطلاق كبير للسيتوكين عند 20 دقيقة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية ل iHCECs. ومع ذلك ، حدث الحد الأقصى لإطلاق السيتوكين ل pHCECs عند 20 دقيقة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية. تم إطلاق جميع السيتوكينات الأربعة (IL-1β و IL-6 و IL-8 و TNF-α) بمستويات كبيرة مقارنة بالخلايا غير المعرضة للأشعة فوق البنفسجية. من حيث الكميات الإجمالية للسيتوكينات الالتهابية التي تم إطلاقها (pg / mL) ، أطلقت pHCECs أكثر بكثير من IL-1β و IL-8 و TNF- α من iHCECs ، في حين أن iHCECs أطلقت المزيد من IL-6.
الشكل 4: إطلاق السيتوكين بواسطة pHCECs و iHCECs بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية في pg / mL. السيتوكينات الأربعة المسببة للالتهابات التي تم قياسها كميا هي IL-1β (A) و IL-6 (B) و IL-8 (C) و TNF-α (D). * p < 0.05 من عنصر التحكم غير المعرض للأشعة فوق البنفسجية. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. الاختصارات: iHCECs = خلدت الخلايا الظهارية القرنية البشرية. pHCECs = الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية ؛ الأشعة فوق البنفسجية = الأشعة فوق البنفسجية. IL = إنترلوكين ؛ TNF-α = عامل نخر الورم ألفا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
آثار السموم الكيميائية على HCECs الأولية والخالدة
كانت النسبة المئوية للانخفاض في النشاط الأيضي بعد التعرض لسموم العين الثلاثة متشابهة بين pHCECs و iHCECs ، كما هو موضح في الشكل 5. يوضح الشكل الوسائل الطبيعية من آبار الاختبار (الآبار الرباعية ، تجربتان منفصلتان).
الشكل 5: النشاط الأيضي ل pHCECs و iHCECs بعد التعرض لثلاثة سموم عينية لمدة 5 و 15 دقيقة. * p < 0.05 من السيطرة. المكافحة غير المعرضة للسموم هي خلايا في الآبار المحتضنة بعينات الاختبار ولكنها غير معرضة للسموم الكيميائية. المحور الصادي هو النسبة المئوية للنشاط الأيضي للخلايا غير المعرضة للسموم الكيميائية. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. الاختصارات: iHCECs = خلدت الخلايا الظهارية القرنية البشرية. pHCECs = الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية ؛ BAK = كلوريد البنزالكونيوم ؛ H2O2 = بيروكسيد الهيدروجين ؛ SDS = كبريتات دوديسيل الصوديوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كانت كميات السيتوكينات التي تطلقها مركبات الكربون الهيدروكلورية أكبر من الكميات التي تطلقها مركبات الهيدروكربونات اللبنية الهيدروكسية. تأثر إطلاق السيتوكين IL-6 أكثر من خلال التعرض للمواد الكيميائية الثلاث (BAK 0.001٪ ، H 2 O20.01٪ ، SDS 0.0025٪ ، الشكل 6). يوضح الشكل الوسائل (pg / mL) من آبار الاختبار (الآبار الرباعية ، تجربتان منفصلتان). أظهرت كل من pHCECs و iHCECs تغيرا في إطلاق IL-6 بعد التعرض لجميع المواد الكيميائية الثلاث. تسبب BAK في انخفاض في إطلاق IL-6 مقارنة بالتحكم لكل من HCECs الأولية والخالدة ، في حين تسبب H 2 O2 فيزيادة إطلاق IL-6 من iHCECs وانخفاض في الإطلاق من pHCECs.
الشكل 6: إطلاق السيتوكينات. إطلاق السيتوكين بواسطة pHCECs و iHCECs بعد التعرض لثلاثة سموم عينية لمدة 5 و 15 دقيقة في pg / mL. السيتوكينات الأربعة المسببة للالتهابات التي تم قياسها كميا هي IL-1β (A) و IL-6 (B) و IL-8 (C) و TNF-α (D). * p < 0.05 من عنصر التحكم. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. الاختصارات: iHCECs = خلدت الخلايا الظهارية القرنية البشرية. pHCECs = الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية ؛ BAK = كلوريد البنزالكونيوم ؛ H2O2 = بيروكسيد الهيدروجين ؛ SDS = كبريتات دوديسيل الصوديوم ؛ IL = إنترلوكين ؛ TNF-α = عامل نخر الورم ألفا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
آثار تركيزات مختلفة من BAK على صلاحية الخلية
يوضح الشكل 7 تأثيرات تركيزات BAK 0.001٪ و 0.005٪ و 0.01٪ لمدة 5 دقائق على صلاحية iHCEC. أظهر BAK تأثيرا ضئيلا عند 0.001٪ لكل من pHCECs و iHCECs. تضررت كل من pHCECs و iHCECs بشكل كبير عند 0.005٪ و 0.01٪ من BAK. عند 0.005٪ و 0.01٪ من BAK ، كانت درجة تلطيخ الإيثيديوم أكبر في iHCECs من pHCECs. بقع الكالسيين خضراء ، بقع إيثيديوم حمراء وملحق V أزرق (لون ملحق V مضبوط بالكمبيوتر لتصور أفضل للإشارة الفلورية)
الشكل 7: صور مجهرية مضان لمركبات الكربون الهيدروكلورية الفلورية و iHCECs المعرضة لتركيزات مختلفة من BAK لمدة 5 دقائق. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر ؛ هدف 10x. الاختصارات: iHCECs = خلدت الخلايا الظهارية القرنية البشرية. pHCECs = الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية ؛ BAK = كلوريد البنزالكونيوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تقييم الاختلافات المحتملة في استخدام نوعين من HCECs. تم وضع الخلايا في نفس الوسط (HOEM) بتركيزات متطابقة من الخلايا ثم تعرضت لفترات قصيرة وطويلة من الأشعة فوق البنفسجية وثلاثة سموم عينية. تم اختيار جرعات من الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية بناء على آثارها الفسيولوجية ، والتي كانت ضارة بما يكفي للخلايا لإنتاج استجابات وسيطة يمكن مقارنتها. كانت أوقات التعرض من 5 و 20 دقيقة للأشعة فوق البنفسجية و 5 و 15 دقيقة للجرعات المختارة من BAK (0.001٪) و SDS (0.0025٪) و H 2 O2(0.01٪) أوقات تعرض وتركيزات مثالية أظهرت استجابات مختلفة بشكل كبير بين الخلايا والضوابط غير المعالجة.
HOEM هو وسيط خال من المصل تم تحسينه لثقافة HCECs. يدعم HOEM نمو كل من الخلايا الأولية والخالدة. تم تخليد خط الخلية الخالد المستخدم في هذا التحقيق باستخدام SV408. تعبر الخلايا الخالدة SV40 عن بروتينات مسرطنة يمكنها تعزيز تقدم دورة الخلية عن طريق التدخل في Rb و p53 و pp2a17. يرتبط الورم الأرومي الشبكي (Rb) بعوامل النسخ E2F ويمنعها ، والتي ، عندما لا يتم تثبيطها ، تسمح للخلية بالتقدم في دورة الخلية وتقسيم18. يرتبط الجزيء p53 أيضا بعوامل النسخ للتحكم في تقدم دورة الخلية19. تثبيط جزيء ثالث ، pp2a 20,21 ، يعزز أيضا الانتشار الخلوي22. قد يساهم التعبير عن بروتينات الجين الورمي SV40 التي تثبط Rb و p53 و pp2a17 في الاختلافات في استجابة iHCECs مقابل pHCECs. كانت أحجام الخلايا لنوعي HCECs مختلفة أيضا ، والتي قد تكون بسبب هذه البروتينات المثبطة للجينات المسرطنة لأن الخلايا الخالدة تضطر إلى الانقسام بواسطة هذه الجزيئات قبل أن تحقق الخلايا الحجم الكبير للخلايا الأولية.
يمكن أن يتسبب تعرض القرنية للأشعة فوق البنفسجية في تلف شديد للخلايا الظهارية للقرنية. يمكن للأشعة فوق البنفسجية إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلية ، وإتلاف جزيئات الحمض النووي والخلية ، وتعطيل عمليات الإنزيم23,24. تتسبب الأشعة فوق البنفسجية ب في إتلاف الحمض النووي بشكل مباشر ، وتتسبب الأشعة فوق البنفسجية في إتلاف الحمض النووي والجزيئات الخلوية الأخرى عن طريق إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلية والتي يمكن أن تتفاعل بعد ذلك مع الجزيئات الحيوية الأخرى25,26. يمكن أن يسبب هذا الضرر للأشعة فوق البنفسجية السمية الخلوية والالتهاب بسبب إطلاق السيتوكينات الالتهابية من الخلايا المكشوفة 3,27. في هذه الدراسة ، كانت الخلايا الخالدة أكثر حساسية لتأثيرات الأشعة فوق البنفسجية على النشاط الأيضي للخلية ، حيث كان هناك انخفاض في النشاط الأيضي للخلايا الخالدة ولكن ليس في خط الخلية الأساسي بعد 5 دقائق. حدثت اختلافات في إطلاق السيتوكينات الالتهابية أيضا بين pHCECs و iHCECs. أطلقت pHCECs المزيد من IL-1β و IL-8 و TNF-α من iHCECs بعد 20 دقيقة من الأشعة فوق البنفسجية. يمكن أن تكون هذه الاختلافات في إطلاق السيتوكين مرتبطة بالاختلافات بين حجم الخلية في مزارع الخلايا الأولية والخالدة. وقد لوحظت التأثيرات التفاضلية في إطلاق السيتوكين بين الخلايا الأولية والخالدة في دراسة أخرى فحصت آثار دخان السجائر على خطوط الخلايا الأولية والخالدة28.
لنمذجة إمكانات السموم الكيميائية للتسبب في تهيج العين ، تم تطوير نماذج مختلفة لزراعة الخلايا لتقييم السمية الخلوية لهذه المواد الكيميائية. أظهرت هذه الدراسة أن السموم العينية التي لها تأثيرات وسيطة على HCECs لها نفس النسبة المئوية تقريبا من الانخفاض في النشاط الأيضي لكل من HCECs الأولية والخالدة. لم تسبب السموم العينية الثلاثة إطلاقا كبيرا لمعظم السيتوكينات الالتهابية مقارنة بالسيطرة غير المعالجة. ومع ذلك ، يوضح هذا البحث حساسية هذه الطريقة في الكشف عن مستويات السيتوكين الأساسية. تم تقييم طريقة أخرى للكشف عن السيتوكينات من خطوط الخلايا الخالدة ووجد أنها غير قادرة على اكتشاف مستويات السيتوكين الأساسية29. أظهرت الصور المجهرية للمزارع المعرضة ل PAK سمية في كل من pHCECs و iHCECs بتركيزات 0.005٪ و 0.01٪ بعد التعرض لمدة 5 دقائق واستعادة 20 ساعة.
كانت الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي اختيار جرعات الأشعة فوق البنفسجية وجرعات سموم العين التي أدت إلى سمية وسيطة للخلايا والتأكد من أن كل نوع من أنواع HCECs ينمو في نفس الوسط. سمح ذلك بإجراء مقارنات بين آثار كل علاج على pHCECs و iHCECs. يمكن إجراء تعديلات على هذه الطريقة في وقت التعرض للعوامل السامة. ومع ذلك ، يوصى بالحفاظ على وقت التعرض قريبا من الأوقات التي تم اختبارها في هذا البروتوكول لأن النقاط الزمنية الأقصر قد لا تظهر سمية على الخلايا. في المقابل ، قد يتسبب التعرض الطويل جدا في الكثير من الضرر بحيث لا يمكن مقارنة الاختلافات الطفيفة في سمية سموم العين بالآثار الضارة لعوامل الاختبار الموصوفة في هذا البروتوكول.
تتمثل إحدى مزايا HCECs الخالدة على HCECs الأولية في أن الخلايا الخالدة لديها انحرافات معيارية أقل من الخلايا الأولية للنشاط الأيضي وإطلاق السيتوكين بعد التعرض لسموم العين. وبالتالي ، لتقييم النشاط الأيضي وإطلاق السيتوكين بعد التعرض ، من المرجح أن تكتشف الخلايا الخالدة السمية الفسيولوجية أكثر من الخلايا الأولية. اكتشفت كل من الخلايا الأولية وخط الخلية الخالد تأثيرات كبيرة على النشاط الأيضي وإطلاق السيتوكين بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، واكتشف كلاهما سمية BAK بعد تلطيخ الخلايا بأصباغ مضانة.
بالإضافة إلى نقاط نهاية السمية المذكورة في هذا التحقيق ، يمكن اختبار نقاط النهاية الأخرى ، بما في ذلك التأثيرات على الوصلات الضيقة ، وتكاثر الخلايا ، وهجرة الخلايا ، وإطلاق سيتوكينات إضافية. قام هذا البروتوكول بتقييم آثار العوامل السامة على إطلاق أربعة سيتوكينات التهابية ، والنشاط الأيضي ، وصلاحية الخلية باستخدام قياسات نفاذية الخلية ، ونشاط الإستراز ، وموت الخلايا المبرمج. بالإضافة إلى ذلك ، في اختبارات vivo ، مثل اختبار تهيج العين للأرانب ، يجب تضمينها في بطارية اختبار السمية ، حيث أن اختبارات السمية فيالمختبر مناسبة لتقييم آلية عمل السمية ل HCECs. هناك حاجة إلى اختبارات في الجسم الحي في الحيوانات لتحديد ما إذا كانت هناك آليات مناعية وسمية أخرى لا يمكن نمذجتها في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تلقى المؤلف ، ليندون دبليو جونز ، على مدى السنوات ال 3 الماضية ، من خلال CORE ، دعما بحثيا أو محاضرا فخريا من الشركات التالية: Alcon و Allergan و Allied Innovations و Aurinia Pharma و BHVI و CooperVision و GL Chemtec و i-Med Pharma و J &J Vision و Lubris و Menicon و Nature's Way و Novartis و Ophtecs و Ote Pharma و PS Therapy و Santen و Shire و SightGlass SightSage و Visioneering. ليندون جونز هو أيضا مستشار و / أو يعمل في مجلس استشاري لشركة Alcon و CooperVision و J&J Vision و Novartis و Ophtecs. المؤلفون الآخرون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
لم يتلق المؤلفون أي تمويل لهذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
- Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
- Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
- Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
- Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
- Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
- Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
- Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
- Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
- Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
- Muller, P. A., Vousden, K. H.
- Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
- Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
- Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
- Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
- Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
- Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
- Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
- Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
- Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
- Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).
