Summary
Denne artikkelen beskriver prosedyrene som brukes til å evaluere toksisiteten av UV-stråling og kjemiske toksiner på en primær og udødeliggjort cellelinje.
Abstract
Denne artikkelen beskriver metodene for å måle toksisiteten av ultrafiolett (UV) stråling og okulære toksiner på primære (pHCEC) og immortaliserte (iHCEC) humane hornhinneepitelcellekulturer. Cellene ble utsatt for UV-stråling og toksiske doser benzalkoniumklorid (BAK), hydrogenperoksid (H2O2) og natriumdodecylsulfat (SDS). Metabolsk aktivitet ble målt ved hjelp av en metabolsk analyse. Frigivelsen av inflammatoriske cytokiner ble målt ved hjelp av en multi-plex interleukin (IL) -1β, IL-6, IL-8 og tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) analyse, og celler ble evaluert for levedyktighet ved bruk av fluorescerende fargestoffer.
De skadelige effektene av UV på cellemetabolsk aktivitet og cytokinfrigjøring oppstod ved 5 minutters UV-eksponering for iHCEC og 20 minutter for pHCEC. Tilsvarende prosentvise fall i metabolsk aktivitet av iHCEC og pHCEC oppstod etter eksponering for BAK,H2O2eller SDS, og de mest signifikante endringene i cytokinfrigjøring skjedde for IL-6 og IL-8. Mikroskopi av fluorescerende fargede iHCEC- og pHCEC BAK-eksponerte celler viste celledød ved 0,005 % BAK-eksponering, selv om graden av ethidiumfarging var større i iHCEC enn pHCEC. Ved å bruke flere metoder for å vurdere toksiske effekter ved hjelp av mikroskopi, vurderinger av metabolsk aktivitet og cytokinproduksjon, kan toksisiteten av UV-stråling og kjemiske toksiner bestemmes for både primære og immortaliserte cellelinjer.
Introduction
In vitro toksikologiske studier utføres for å forutsi toksiske effekter av kjemikalier og andre midler som kan forårsake skade på celler. I vurderingen av toksisitet for hornhinnen har humane hornhinneepitelceller (HCEC) blitt brukt i modeller for å evaluere disse effektene 1,2,3,4. Disse modellene evaluerer vanligvis fysiologiske effekter som endringer i cellens metabolske aktivitet, celleproliferasjon og andre cellefunksjoner som produksjon og frigjøring av inflammatoriske cytokiner. For disse toksikologiske studiene har celler fra forskjellige kilder blitt valgt for å vurdere de skadelige effektene av kjemikalier og UV-stråling på HCECs 2,3. pHCEC-linjer er tilgjengelige fra selskaper som gir disse cellene fra donorvev hos voksne. Primærceller kan behandles med dispase og skrapes forsiktig av hornhinnen for kultur5. Cellene blir deretter testet for virus og forurensning og deretter sendt kryopreservert i 10% dimetylsulfoksid.
Fordelen med primære cellelinjer er at cellene er genetisk identiske med cellene til donoren. Dette er ideelt, da en in vitro-modell skal etterligne in vivo-vevet så mye som mulig. Ulempen med primære cellelinjer er at de har et begrenset antall celledelinger eller passasjer6. Det begrensede antallet tilgjengelige celler begrenser antall eksperimenter som kan utføres med en enkelt primærkultur, noe som øker kostnadene ved forsøkene.
Immortaliserte cellelinjer har også blitt brukt i toksisitetsmodeller for cellekulturer. Imidlertid, i motsetning til den primære cellelinjen oppnådd fra in vivo-vev, har den immortaliserte cellelinjen blitt genetisk endret. Immortaliserte celler opprettes ved å inkorporere genene til et virus i DNA fra primære celler 6,7,8. Celler med vellykket viral geninkorporering er valgt for den immortaliserte cellelinjen. Fordelen med immortalisering er at den tillater ubestemt rask spredning, og gir et ubegrenset antall celler til å utføre flere eksperimenter ved hjelp av samme cellelinje. Dette muliggjør konsistens mellom eksperimenter og reduserer kostnadene.
I tillegg til endringer i genene som begrenset celleproliferasjonen, kunne detogså forekomme endringer i uttrykket av gener med kritisk funksjonalitet. Derfor er ulempen ved å bruke immortaliserte celler at de kanskje ikke lenger representerer originalen in vivo-celler når det gjelder deres respons på forskjellige eksterne stimuli10. Sammenligninger har involvert å observere toksiske effekter av kjemikalier på primære og udødeliggjorte humane hornhinnekeratocytter11, samt udødeliggjorte HCECer og kaninhornhinneepiteliale primærceller12. Sammenligningen mellom effekten av toksiner på primære humane keratocytter og immortaliserte keratocytter viste ingen signifikante forskjeller11. Ved hjelp av metodene som er beskrevet i denne artikkelen, vil effektiviteten av disse analysene for å vurdere toksisiteten av UV-stråling og okulære toksiner på pHCEC og iHCEC bli bestemt.
Tre okulære toksiner som vanligvis brukes i in vitro-analyser ble valgt: BAK,H2O2og SDS. BAK er et kationisk konserveringsmiddel som vanligvis brukes i oftalmiske løsninger 13,14, H 2 O2brukes ofte til å desinfisere kontaktlinser 15, og SDS er et anionisk overflateaktivt middel som finnes i vaskemidler og sjampo 14. I likhet med okulære toksiner kan UV-stråling også forårsake betydelig skade på HCECs3. I tillegg kan overeksponering for UV forårsake en okulær tilstand kjent som fotokeratitt preget av symptomer på tåre, lysfølsomhet og en følelse av grittiness16.
Det er et ubegrenset antall primære cellekulturer som kan brukes og forskjellige immortaliserte cellelinjer som er utviklet. Derfor ble det gjennomført en undersøkelse for å sammenligne primære HCECer med en udødeliggjort HCEC-linje for å bestemme likheter og forskjeller mellom modeller som inneholder disse typer celler.
Denne undersøkelsen brukte mikroskopi for å vurdere mulige forskjeller mellom pHCEC og iHCEC på cellefysiologisk respons på UV og toksiner. Effektene av UV-stråling og kjemikalier på cellemetabolsk aktivitet og inflammatorisk cytokinfrigjøring for de to cellelinjene ble også evaluert. Betydningen av å bestemme forskjellene mellom de to cellelinjene er å forstå optimal bruk av disse cellelinjene for å evaluere: 1) effekten av UV-stråling på celler, 2) effekten av toksiner på celler, og 3) de resulterende endringene i metabolisme, celle levedyktighet og cellecytokinfrigivelse for fremtidige studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur av pHCEC og iHCEC
- Dyrk pHCECene og iHCECene i humant okulært epitelmedium (HOEM) med følgende kosttilskudd: 6 mM L-glutamin, 0,002% cellemedietilskudd O (materialfortegnelse), 1,0 μM adrenalin, 0,4% cellemedietilskudd P (materialfortegnelse), 5 μg / ml rh insulin, 5 μg / ml apo-transferrin og 100 ng / ml hydrokortisonhemisuccinat i kollagen-1-belagte kulturflasker (18 ml i en 75 cm2 kulturkolbe).
- Bytt medium i kolbene hver 2-3 dag ved å fjerne mediet etter at cellene vokser til ~ 80% samløp. Tilsett dissosiasjonsoppløsning uten fenolrød og inkuber kolben ved 37 °C til cellene er helt løsrevet. Nøytraliser dissosiasjonsløsningen med DMEM / F12 med serum og sentrifuge deretter cellene ved 500 × g. Fjern supernatantmediet og resuspender cellene i HOEM-medium.
2. Bestemmelse av cellestørrelse ved bruk av konfokalmikroskopi
- Frø både pHCECs og iHCECs på kollagenbelagte petriskåler med glassbunnsdeksler i en konsentrasjon på 1 × 105 med 1 ml HOEM. Dyrk pHCEC og iHCEC, ett sett med kulturer i 24 timer og et annet sett med kulturer i 48 timer, i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Etter inkubasjonsperioden, farg cellene med 500 μL annexinfargebufferløsning inneholdende kalcein (4 μM), ethidiumhomodimer-1 (8 μM) og anneksin V (5 μL i 500 μL buffer-Alexa Fluor 647 konjugat) i 20 minutter ved 37 °C. Etter farging av cellene, juster mikroskopet for å fange eksitasjon / emisjonsbølgelengder på 488/515 nm for kalcein-AM, 543/600 nm for ethidiumhomodimer-1 og 633/665 nm for vedlegg V ved hjelp av et konfokal laserskanningsmikroskop.
- Hent bildene og ta Z-stakker for å vurdere cellestørrelsen i tre dimensjoner.
- For å skaffe de todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) bildene, finn området til bildet med et apokromatisk 40x/1.2 vannmål. Med Argon (488) (første skanning), HeNe1 (543) (andre skanning og HeNe2 (633) (tredje skanning) lasere, skann i tre separate kanaler ved hjelp av strålesplitterne, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis og NFT 545 LP560, LP505.
- Bruk sekvensiell skanning med flere spor for å redusere krysstale.
MERK: LP505 brukes til kanal 2 med 488 laser for å fange utslipp av kalceinfargestoff. LP560 brukes i kanal 3 med 543-laseren for å fange opp emisjonen av ethidiumhomodimeren 1. NFT 635 brukes med 633-laseren for å fange opp utslippet fra vedlegget V. Formålet med HFT er å skille eksitasjons- og utslippslyset. NFT deler lys ved å reflektere lys < spesifisert bølgelengde til en egen kanal mens lyset slipper > en spesifisert bølgelengde gjennom til en annen kanal. LP-filtre blokkerer kortere bølgelengder enn den angitte bølgelengden og slipper de lengre bølgelengdene gjennom. - For å avbilde i 3D, sett konfokalen til Z-stack og skann minst 20 bilder.
3. Eksponering av celler for UV-stråling
- Frø cellene ved 5 × 104 / ml HOEM i hver brønn av en 24-brønns kollagen-1-belagt kulturplate og inkuber ved 37 ° C med 5% CO2 i 3 timer. Etter inkubasjonsperioden, reduser volumet av mediet i brønnene til 300 μL. Deretter utsettes cellene for UV-stråling (både UVA ved 6,48 W / m 2 og UVB ved 1,82 W / m2 da både UVA- og UVB-rør slås på i inkubatoren samtidig) i en 37 ° C inkubator i 5 og 20 minutter i separate eksperimenter.
- Etter UV-strålingen, tilsett 200 μL fersk HOEM til hver brønn og inkuber i 20 timer ved 37 °C med 5% CO2.
- Etter inkubering, samle cellesupernatanten i hver brønn og overfør den til sterile 2 ml polypropylenrør. Frys ved -80 °C. For å bestemme cytokinnivåene som frigjøres av pHCECs og iHCECs etter UV-eksponering, bruk en multiplex cytokinanalyse og følg settets instruksjoner for å kvantifisere følgende fire cytokiner: IL-6, IL-8, IL-1β og TNF-α.
- Tilsett metabolsk analysereagens til cellene i brønnene.
- Forbered 10% metabolsk analysereagens i DMEM / F12. Erstatt dyrkningsmediet i hver brønn med 1 ml av den 10 % metabolske analyseløsningen og inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 i 4 timer.
- Mål fluorescensen til hver løsning ved hjelp av en fluorescerende plateleser ved 530/590 nm eksitasjon / emisjonsbølgelengder.
4. Eksponering av celler for kjemiske toksiner
- Frøceller ved 5 × 104 / ml HOEM i hver brønn av en 24-brønns kollagen-1-belagt kulturplate og inkuberer ved 37 ° C med 5% CO2 i 3 timer. Etter inkubasjonsperioden, fjern mediet og utsett cellene for 1 ml kjemiske toksiner (BAK 0,001%, H2O2 0,01% og SDS 0,0025% i fosfatbufret saltvann (PBS)) i 5 og 15 minutter.
- Etter eksponering for kjemiske giftstoffer, fjern giftstoffer fra brønnene, skyll med 1 ml PBS og tilsett 1 ml HOEM til hver brønn. Etter 20 timers inkubasjon, utfør en metabolsk analyse ved å erstatte mediet med 1 ml av en 10% metabolsk analyseløsning og inkubere ved 37 ° C med 5% CO2 i 4 timer. Mål fluorescensen ved hjelp av en fluorescens flerbrønnsplateleser ved 530/590 nm eksitasjon / emisjonsbølgelengder.
- Overfør cellesupernatantene fra brønnene etter 20 timers inkubasjon til separate sterile 2 ml polypropylenrør og frys ved -80 °C. Kvantifisere cytokiner frigjort av pHCECs og iHCECs etter eksponering for kjemikaliene. Bruk den samme multipleksplattformen som brukes til å vurdere cytokinene fra UV-behandlede celler. Bruk en multiplex cytokinanalyse ved å følge instruksjonene i settet for å kvantifisere følgende fire cytokiner: IL-6, IL-8, IL-1β og TNF-α.
5. Undersøkelse av celler utsatt for ulike konsentrasjoner av BAK
- Frøceller ved 1 × 10 5 / ml HOEM i hver brønn av en 24-brønns kollagen-1-belagt kulturplate og inkuberer ved 37 ° C med5% CO2 i 24 timer. Etter inkubasjonsperioden, fjern mediet og utsett cellene for 1 ml kjemiske toksiner (BAK 0,001%, BAK 0,005% og BAK 0,01% i PBS) i 5 minutter.
- Etter eksponering, fjern kjemiske giftstoffer, skyll brønnene med 1 ml PBS, og tilsett 1 ml HOEM til hver brønn. Etter 20 timers inkubasjon, farg cellene med 500 μL annexinfargebufferløsning inneholdende kalcein (4 μM), ethidiumhomodimer-1 (8 μM) og anneksin V (5 μL i 500 μL buffer-Alexa Fluor 647 konjugat) i 20 minutter ved 37 °C. Juster mikroskopet for å måle intensiteten av anneksin V, kalcein AM og ethidium-1-farging ved eksitasjon / emisjonsbølgelengder på henholdsvis 630/675 nm, 495/515 nm og 528/617 nm. Bilde cellene ved hjelp av fluorescensmikroskopet
6. Dataanalyse
- Utfør en normalitetstest og en test for like varianser før du utfører en variansanalyse (ANOVA), Welch ANOVA eller Kruskal-Wallis-test. Bruk riktig post-hoc-test for å sammenligne hver gruppe som ble testet. Sett p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celle størrelse
De primære og immortaliserte HCECene ble visualisert med tre fluorescerende fargestoffer, som gjenspeiler tre forskjellige stadier av celle levedyktighet. Levende celler er grønne (calcein-AM), døde celler er røde (ethidium homodimer-1), og apoptotiske celler er gule (vedlegg V-datamaskinjustert farge for bedre visualisering av fluorescenssignalet). Levende celler inneholder esteraser i cellecytoplasma og konverterer calcein-AM til kalcein. Døde celler har cellemembraner som er gjennomtrengelige for ethidium homodimer-1. Apoptotiske celler har farging på cellemembranen som fosfatidylserin er translokalisert til den ytre membranen.
En sammenligning av cellestørrelse for de to typene HCEC etter 24 og 48 timers vekst ble gjort ved hjelp av konfokalmikroskopi, som vist i figur 1. iHCECene (figur 1A) er mindre celler som varierer fra 10 μm til 20 μm, og pHCECene (figur 1B) varierer i størrelse fra 20 μm til 50 μm etter 24 timers vekst. Lignende forskjeller i størrelsesområde ble observert for iHCEC (figur 1C) og pHCEC (figur 1D) etter 48 timers vekst. 3D-bilder av de to typene HCEC ble laget ved hjelp av konfokalmikroskopi (figur 2A viser pHCECs; Figur 2B viser iHCEC).
Figur 1: En sammenligning av cellestørrelse ved hjelp av konfokalmikroskopi . iHCEC etter 24 (A) og 48 (C) h vekst med celler som varierer i størrelse fra 10 til 20 μm. pHCEC etter 24 (B) og 48 (D) h vekst med celler som varierer i størrelse fra 20 til 50 μm. 40x vannmål. Skalastenger = 10 og 20 μm (A); 25 og 50 μm (B); 10 og 20 μm (C); 50 μm (D). Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhinneepitelceller; pHCECs = primære humane hornhinneepitelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: 3D-konfokale bilder. 3D-konfokale bilder av pHCEC etter 48 timers vekst (A) og iHCEC etter 24 timer (B). 40x vannmål. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhinneepitelceller; pHCECs = primære humane hornhinneepitelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Effekt av UV på primære og immortaliserte HCECs
Den metabolske aktiviteten til både primære og immortaliserte HCECs etter eksponering for UV er vist i figur 3. Figuren viser normaliserte gjennomsnitt fra testbrønner (firedoble brønner, to separate eksperimenter). Sammenlignet med ikke-UV-eksponerte celler, ble den metabolske aktiviteten til bestrålte pHCEC signifikant redusert ved 20 minutters eksponering. For iHCEC ble den metabolske aktiviteten redusert for celler bestrålt etter både 5 og 20 minutter. Derfor tok det lengre eksponeringstid å redusere den metabolske aktiviteten til pHCECene enn iHCEC-ene.
Figur 3: Den metabolske aktiviteten til pHCEC og iHCEC etter eksponering for 5 og 20 minutter UV-stråling . *p < 0,05 av den ikke-UV-eksponerte kontrollen. Den ikke-UV-eksponerte kontrollen er celler i brønner som inkuberes med testprøvene, men ikke utsettes for UV. Y-aksen er prosent i forhold til den metabolske aktiviteten til cellene som ikke er utsatt for UV. Feilfelt angir standardavvik. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhinneepitelceller; pHCECs = primære humane hornhinneepitelceller; UV = ultrafiolett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Effekten av UV-eksponering på frigjøring av inflammatoriske cytokiner fra HCECene er vist i figur 4. Maksimal cytokinfrigjøring skjedde på forskjellige tidspunkter av UV-eksponering for de primære og immortaliserte HCEC-ene. Maksimal cytokinfrigjøring fra iHCEC var ved 5 minutters UV-eksponering. Cellene frigjorde signifikante nivåer (p < 0,05) av IL-1β, IL-6 og IL-8 sammenlignet med de ikke-UV-eksponerte cellene. Videre var det ingen signifikant cytokinfrigjøring ved 20 minutters UV-eksponering for iHCEC. Imidlertid oppstod maksimal cytokinfrigjøring for pHCEC ved 20 minutters UV-eksponering. Alle fire cytokiner (IL-1β, IL-6, IL-8 og TNF-α) ble frigjort i signifikante nivåer sammenlignet med de ikke-UV-eksponerte cellene. Når det gjelder totale mengder inflammatoriske cytokiner frigjort (pg / ml), frigjorde pHCECene vesentlig mer IL-1β, IL-8 og TNF-α enn iHCEC, mens iHCECene frigjorde mer IL-6.
Figur 4: Cytokinfrigjøring fra pHCEC og iHCEC etter eksponering for UV-stråling i pg/ml. De fire proinflammatoriske cytokinene kvantifisert er IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) og TNF-α (D). *p < 0,05 av den ikke-UV-eksponerte kontrollen. Feilfelt angir standardavvik. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhinneepitelceller; pHCECs = primære humane hornhinneepitelceller; UV = ultrafiolett; IL = interleukin; TNF-α = tumornekrosefaktor alfa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Effekter av kjemiske toksiner på primære og udødeliggjorte HCECer
Den prosentvise reduksjonen i metabolsk aktivitet etter eksponering for de tre okulære toksinene var lik mellom pHCEC og iHCEC, som vist i figur 5. Figuren viser normaliserte gjennomsnitt fra testbrønner (firedoble brønner, to separate eksperimenter).
Figur 5: Den metabolske aktiviteten til pHCEC og iHCEC etter eksponering for tre okulære toksiner i 5 og 15 minutter. *p < 0,05 av kontrollgruppen. Den ikke-toksineksponerte kontrollen er celler i brønner inkubert med testprøvene, men ikke utsatt for kjemiske toksiner. Y-aksen er prosent i forhold til den metabolske aktiviteten til cellene som ikke er utsatt for kjemiske toksiner. Feilfelt angir standardavvik. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhinneepitelceller; pHCECs = primære humane hornhinneepitelceller; BAK = benzalkoniumklorid; H2O2= hydrogenperoksid; SDS = natriumdodecylsulfat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Mengdene cytokiner frigjort av pHCECene var større enn mengdene frigjort av iHCECene. Frigivelsen av cytokin IL-6 ble mest påvirket av eksponering for de tre kjemikaliene (BAK 0,001 %,H2O2 0,01 %, SDS 0,0025 %, figur 6). Figuren viser gjennomsnitt (pg/ml) fra testbrønner (firedoble brønner, to separate eksperimenter). Både pHCEC og iHCEC viste en endring i frigjøringen av IL-6 etter eksponering for alle tre kjemikaliene. BAK forårsaket en reduksjon i frigjøringen av IL-6 sammenlignet med kontrollen for både primære og immortaliserte HCECer, mens H 2 O2 forårsaketen økning i frigjøringen av IL-6 fra iHCEC og en reduksjon i frigjøringen fra pHCECs.
Figur 6: Cytokinfrigjøring. Cytokinfrigjøring av pHCEC og iHCEC etter eksponering for tre okulære toksiner i 5 og 15 minutter i pg / ml. De fire proinflammatoriske cytokinene kvantifisert er IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) og TNF-α (D). *p < 0,05 av kontrollen. Feilfelt angir standardavvik. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhinneepitelceller; pHCECs = primære humane hornhinneepitelceller; BAK = benzalkoniumklorid; H2O2= hydrogenperoksid; SDS = natriumdodecylsulfat; IL = interleukin; TNF-α = tumornekrosefaktor alfa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Effekter av ulike konsentrasjoner av BAK på cellens levedyktighet
Effektene av BAK-konsentrasjonene 0,001 %, 0,005 % og 0,01 % i 5 minutter på iHCECs levedyktighet er vist i figur 7. BAK viste liten effekt ved 0,001 % for både pHCEC og iHCEC. Både pHCEC og iHCEC ble betydelig skadet ved 0,005 % og 0,01 % av BAK. Ved 0,005 % og 0,01 % av BAK var graden av ethidiumfarging større i iHCEC enn i pHCEC. Calcein flekker grønn, ethidium flekker rød og anneksin V blå (vedlegg V-farge datamaskinjustert farge for bedre visualisering av fluorescenssignalet)
Figur 7: Fluorescensmikroskopiske bilder av pHCEC og iHCEC utsatt for ulike konsentrasjoner av BAK i 5 minutter. Skala barer = 200 μm; 10x mål. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhinneepitelceller; pHCECs = primære humane hornhinneepitelceller; BAK = benzalkoniumklorid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Potensielle forskjeller i bruk av to typer HCEC ble vurdert. Celler ble plassert i samme medium (HOEM) ved identiske konsentrasjoner av celler og deretter utsatt for korte og lange perioder med UV-stråling og tre okulære toksiner. Doser av UV-stråling og kjemikalier ble valgt basert på deres fysiologiske effekter, som var skadelige nok for cellene til å produsere mellomliggende responser som kunne sammenlignes. Eksponeringstider på 5 og 20 minutter for UV-stråling og 5 og 15 minutter for de valgte dosene av BAK (0,001 %), SDS (0,0025 %) ogH2O2(0,01 %) var ideelle eksponeringstider og konsentrasjoner som viste signifikant forskjellig respons mellom cellene og de ubehandlede kontrollene.
HOEM er et serumfritt medium som er optimalisert for HCEC-kulturen. HOEM støtter veksten av både primære og immortaliserte celler. Den udødeliggjorte cellelinjen som ble brukt i denne undersøkelsen ble udødeliggjort ved hjelp av SV408. SV40-immortaliserte celler uttrykker onkogenproteiner som kan fremme cellesyklusprogresjon ved å forstyrre Rb, p53 og pp2a17. Retinoblastom (Rb) binder seg til og hemmer E2F-transkripsjonsfaktorer, som, når de ikke hemmes, tillater en celle å utvikle seg i cellesyklusen og deleseg 18. Molekylet p53 binder seg også til transkripsjonsfaktorer for å kontrollere utviklingen av cellesyklusen19. Inhiberingen av et tredje molekyl, pp2a 20,21, fremmer også cellulær proliferasjon22. Ekspresjonen av SV40 onkogenproteiner som hemmer Rb, p53 og pp2a17 kan bidra til forskjellene i responsen til iHCECs vs. pHCECs. Cellestørrelsene til de to typene HCEC var også forskjellige, noe som kan skyldes disse onkogenhemmende proteinene fordi de utødeliggjorte cellene blir tvunget til å dele seg av disse molekylene før cellene oppnår den store størrelsen på primærcellene.
Hornhinneeksponering for UV-stråling kan forårsake alvorlig skade på hornhinneepitelceller. UV-stråling kan produsere reaktive oksygenarter i cellen, skade DNA og cellemolekyler, og forstyrre enzymprosesser23,24. UVB skader DNA direkte, og UVA skader DNA og andre cellulære molekyler via produksjon av reaktive oksygenarter i cellen som deretter kan reagere med andre biomolekyler25,26. Denne UV-skaden kan forårsake cytotoksisitet og betennelse på grunn av frigjøring av inflammatoriske cytokiner fra de eksponerte cellene 3,27. I denne studien var immortaliserte celler mer følsomme for UV-strålingseffekter på cellemetabolsk aktivitet, da det var et fall i den metabolske aktiviteten til de immortaliserte cellene, men ikke i den primære cellelinjen etter 5 minutter. Forskjeller i frigjøring av inflammatoriske cytokiner forekom også mellom pHCECs og iHCECs. pHCEC frigjorde flere IL-1β, IL-8 og TNF-α enn iHCEC etter 20 minutter med UV-stråling. Disse forskjellene i cytokinfrigivelse kan være relatert til forskjellene mellom cellestørrelsen til primære og immortaliserte cellekulturer. Differensielle effekter i cytokinfrigjøring mellom primære og immortaliserte celler har blitt notert i en annen studie som undersøkte effekten av sigarettrøyk på primære og immortaliserte cellelinjer28.
For å modellere potensialet for kjemiske toksiner for å forårsake okulær irritasjon, har ulike cellekulturmodeller blitt utviklet for å vurdere cytotoksisiteten til disse kjemikaliene. Denne studien viste at okulære toksiner som har mellomliggende effekter på HCECs, har omtrent samme prosentvise reduksjon i metabolsk aktivitet for både primære og immortaliserte HCECs. De tre okulære toksinene forårsaket ikke en vesentlig frigjøring av de fleste inflammatoriske cytokinene sammenlignet med den ubehandlede kontrollen. Denne artikkelen viser imidlertid sensitiviteten til denne metoden ved påvisning av cytokinnivåer ved baseline. En annen metode for påvisning av cytokiner fra immortaliserte cellelinjer har blitt evaluert og ble funnet ute av stand til å oppdage baseline cytokinnivåer29. De mikroskopiske bildene av BAK-eksponerte kulturer viste toksisitet i både pHCEC og iHCEC ved 0,005 % og 0,01 % konsentrasjoner etter 5 minutters eksponering og 20 timers restitusjon.
De kritiske trinnene i denne protokollen var å velge UV-doser og okulære toksindoser som resulterte i mellomliggende toksisitet for cellene og sikre at hver type HCEC vokste i samme medium. Dette gjorde det mulig å sammenligne effekten av hver behandling på pHCEC og iHCEC. Modifikasjoner av denne metoden kan gjøres i tidspunktet for eksponering for giftige stoffer. Det anbefales imidlertid å opprettholde eksponeringstiden nær tidene som er testet i denne protokollen, da kortere tidsperioder kanskje ikke viser toksisitet på cellene. I motsetning til dette kan for lang eksponering forårsake for mye skade, slik at mindre forskjeller i toksisiteten til okulære toksiner ikke kunne sammenlignes med de skadelige effektene av testmidlene beskrevet i denne protokollen.
En av fordelene med de udødeliggjorte HCECene over de primære HCECene er at de immortaliserte cellene hadde lavere standardavvik enn de primære cellene for metabolsk aktivitet og cytokinfrigjøring etter eksponering for okulære toksiner. For å vurdere metabolsk aktivitet og cytokinfrigjøring etter eksponering, er de immortaliserte cellene mer sannsynlig å oppdage fysiologisk toksisitet enn primære celler. Både primærcellene og den immortaliserte cellelinjen påviste signifikante effekter på metabolsk aktivitet og cytokinfrigjøring etter UV-eksponering, og begge påviste toksisiteten til BAK etter å ha farget cellene med fluorescensfargestoffer.
I tillegg til toksisitetsendepunktene nevnt i denne undersøkelsen, kunne andre endepunkter testes, inkludert effekter på tette veikryss, celleproliferasjon, cellemigrasjon og frigjøring av ytterligere cytokiner. Denne protokollen evaluerte effekten av toksiske stoffer på frigjøring av fire inflammatoriske cytokiner, metabolsk aktivitet og celle levedyktighet ved hjelp av målinger for cellepermeabilitet, esteraseaktivitet og apoptose. I tillegg bør in vivo-tester, for eksempel testing av øyeirritasjon hos kaniner, inkluderes i et toksisitetstestbatteri, da in vitro-toksisitetstester er egnet for å vurdere virkningsmekanismen for toksisitet for HCEC. In vivo-tester på dyr er nødvendig for å avgjøre om det finnes andre immun- og toksisitetsmekanismer som ikke kan modelleres in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren, Lyndon W. Jones, har de siste 3 årene, gjennom CORE, mottatt forskningsstøtte eller foredragshonorar fra følgende selskaper: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J &J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage og Visioneering. Lyndon Jones er også konsulent og/eller sitter i et rådgivende styre for Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis og Ophtecs. De andre forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne fikk ingen støtte til dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
- Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
- Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
- Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
- Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
- Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
- Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
- Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
- Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
- Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
- Muller, P. A., Vousden, K. H.
- Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
- Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
- Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
- Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
- Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
- Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
- Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
- Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
- Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
- Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).
