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Biology

Determinación de la toxicidad de la radiación UV y los productos químicos en las células epiteliales corneales humanas primarias e inmortalizadas

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62675
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Centre for Ocular Research & Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR)

Summary

Este artículo describe los procedimientos utilizados para evaluar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas químicas en una línea celular primaria e inmortalizada.

Abstract

Este artículo describe los métodos para medir la toxicidad de la radiación ultravioleta (UV) y las toxinas oculares en cultivos primarios (pHCEC) e inmortalizados (iHCEC) de células epiteliales corneales humanas. Las células fueron expuestas a radiación UV y dosis tóxicas de cloruro de benzalconio (BAK), peróxido de hidrógeno (H2O2) y dodecil sulfato de sodio (SDS). La actividad metabólica se midió mediante un ensayo metabólico. La liberación de citoquinas inflamatorias se midió mediante un ensayo de interleucina múltiple (IL)-1β, IL-6, IL-8 y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), y se evaluó la viabilidad de las células utilizando tintes fluorescentes.

Los efectos dañinos de los rayos UV sobre la actividad metabólica celular y la liberación de citoquinas ocurrieron a los 5 min de exposición UV para iHCEC y 20 min para pHCEC. Caídas porcentuales similares en la actividad metabólica de iHCEC y pHCEC ocurrieron después de la exposición a BAK,H2O2 o SDS, y los cambios más significativos en la liberación de citoquinas ocurrieron para IL-6 e IL-8. La microscopía de células expuestas a iHCEC y pHCEC BIC teñidas con fluorescencia mostró muerte celular al 0,005% de exposición a BAK, aunque el grado de tinción de etidio fue mayor en los iHCEC que en los pHCEC. Utilizando múltiples métodos para evaluar los efectos tóxicos utilizando microscopía, evaluaciones de la actividad metabólica y producción de citoquinas, se pudo determinar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas químicas tanto para las líneas celulares primarias como para las inmortalizadas.

Introduction

Los estudios de toxicología in vitro se realizan para predecir los efectos tóxicos de los productos químicos y otros agentes que pueden causar daño a las células. En la evaluación de la toxicidad para la córnea, se han utilizado células epiteliales corneales humanas (HCEC) en modelos para evaluar estos efectos 1,2,3,4. Estos modelos generalmente evalúan los efectos fisiológicos, como los cambios en la actividad metabólica de la célula, la proliferación celular y otras funciones celulares, como la producción y liberación de citoquinas inflamatorias. Para estos estudios toxicológicos, se han seleccionado células de diversas fuentes para evaluar los efectos nocivos de los productos químicos y la radiación UV sobre los HCEC 2,3. Las líneas pHCEC están disponibles en compañías que proporcionan estas células a partir de tejidos de donantes de adultos. Las células primarias pueden tratarse con dispasa y raspar suavemente la córnea para el cultivo5. Luego, las células se analizan para detectar virus y contaminación y luego se envían criopreservadas en dimetilsulfóxido al 10%.

La ventaja de las líneas celulares primarias es que las células son genéticamente idénticas a las células del donante. Esto es ideal, ya que un modelo in vitro debe imitar el tejido in vivo tanto como sea posible. La desventaja de las líneas celulares primarias es que tienen un número limitado de divisiones celulares o pasajes6. El número limitado de células disponibles restringe el número de experimentos que se pueden realizar con un solo cultivo primario, lo que aumenta el costo de los experimentos.

Las líneas celulares inmortalizadas también se han utilizado en modelos de toxicidad por cultivo celular. Sin embargo, a diferencia de la línea celular primaria obtenida del tejido in vivo, la línea celular inmortalizada ha sido alterada genéticamente. Las células inmortalizadas se crean incorporando los genes de un virus en el ADN de las células primarias 6,7,8. Las células con incorporación exitosa de genes virales se seleccionan para la línea celular inmortalizada. La ventaja de la inmortalización es que permite una proliferación rápida indefinida, proporcionando un número ilimitado de células para realizar múltiples experimentos utilizando la misma línea celular. Esto permite la consistencia entre los experimentos y reduce el costo.

Además de los cambios en los genes que limitaron la proliferación celular, también podrían ocurrir cambios en la expresión de genes de funcionalidad crítica9. Por lo tanto, la desventaja de utilizar células inmortalizadas es que ya no pueden representar las células originales in vivo en términos de su respuesta a diversos estímulos externos10. Las comparaciones han implicado observar los efectos tóxicos de los productos químicos sobre los queratocitos corneales humanos primarios e inmortalizados11, así como sobre los HCEC inmortalizados y las células primarias epiteliales corneales del conejo12. La comparación entre los efectos de las toxinas sobre los queratocitos humanos primarios y los queratocitos inmortalizados no mostró diferencias significativas11. Utilizando los métodos detallados en este artículo, se determinará la efectividad de estos ensayos para evaluar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas oculares en pHCEC e iHCEC.

Se seleccionaron tres toxinas oculares comúnmente utilizadas en ensayos in vitro: BAK,H2O2y SDS. BAK es un conservante catiónico comúnmente utilizado en soluciones oftálmicas 13,14,H2O2se usa comúnmente para desinfectar lentes de contacto 15, y SDS es un tensioactivo aniónico que se encuentra en detergentes y champús 14. Al igual que las toxinas oculares, la radiación UV también puede causar daños significativos a los HCEC3. Además, la sobreexposición a los rayos UV puede causar una condición ocular conocida como fotoqueratitis caracterizada por síntomas de lagrimeo, sensibilidad a la luz y una sensación de arenilla16.

Hay un número ilimitado de cultivos celulares primarios que se pueden utilizar y varias líneas celulares inmortalizadas que se han desarrollado. Por lo tanto, se realizó una investigación para comparar los HCEC primarios con una línea de HCEC inmortalizada para determinar similitudes y diferencias entre los modelos que incorporan este tipo de células.

Esta investigación utilizó microscopía para evaluar las posibles diferencias entre pHCEC e iHCEC en la respuesta fisiológica celular a los rayos UV y las toxinas. También se evaluaron los efectos de la radiación UV y los productos químicos sobre la actividad metabólica celular y la liberación de citoquinas inflamatorias para las dos líneas celulares. La importancia de determinar las diferencias entre las dos líneas celulares es comprender el uso óptimo de estas líneas celulares para evaluar: 1) el efecto de la radiación UV en las células, 2) los efectos de las toxinas en las células y 3) los cambios resultantes en el metabolismo, la viabilidad celular y la liberación de citoquinas celulares para estudios futuros.

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Protocol

1. Cultivo de pHCECs e iHCECs

  1. Cultivar los pHCEC e iHCEC en medio epitelial ocular humano (HOEM) con los siguientes suplementos: 6 mM L-glutamina, 0,002% suplemento de medios celulares O (tabla de materiales), 1,0 μM de epinefrina, 0,4% suplemento de medios celulares P (tabla de materiales), 5 μg/ml de insulina rh, 5 μg/ml de apotransferrina y 100 ng/ml de hemisuccinato de hidrocortisona en matraces de cultivo recubiertos de colágeno-1 (18 ml en un matraz de cultivo de 75 cm2 ).
  2. Cambie el medio en los matraces cada 2-3 días eliminando el medio después de que las células crezcan a ~ 80% de confluencia. Añadir la solución de disociación sin rojo fenol e incubar el matraz a 37 °C hasta que las células estén completamente separadas. Neutralizar la solución de disociación con DMEM/F12 con suero y luego centrifugar las células a 500 × g. Retire el medio sobrenadante y resuspenda las células en medio HEM.

2. Determinación del tamaño celular mediante microscopía confocal

  1. Sembrar tanto pHCEC como iHCEC en placas de Petri recubiertas de colágeno con cubreobjetos con fondo de vidrio a una concentración de 1 × 105 con 1 ml de HOEM. Cultivar pHCECs e iHCECs, un conjunto de cultivos durante 24 horas y otro conjunto de cultivos durante 48 h, en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2.
  2. Después del período de incubación, teñir las células con 500 μL de solución tampón de tinción de anexina que contenga calceína (4 μM), etidio homodímero-1 (8 μM) y anexina V (5 μL en 500 μL tampón-Alexa Fluor 647 conjugado) durante 20 min a 37 °C. Después de teñir las células, ajuste el microscopio para capturar las longitudes de onda de excitación/emisión de 488/515 nm para calceína-AM, 543/600 nm para el homodímero etidio-1 y 633/665 nm para la anexina V utilizando un microscopio de barrido láser confocal.
  3. Obtenga las imágenes y tome pilas Z para evaluar el tamaño de la celda en tres dimensiones.
    1. Para adquirir las imágenes bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D), encuentre el área a obtener la imagen con un objetivo de agua apocromático 40x/1.2. Con los láseres Argon (488) (primer escaneo), HeNe1 (543) (segundo escaneo) y HeNe2 (633) (tercer escaneo), escanee en tres canales separados utilizando los divisores de haz, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis y NFT 545 LP560, LP505.
    2. Utilice el escaneo secuencial multipista para reducir la diafonía.
      NOTA: LP505 se utiliza para el canal 2 con el láser 488 para capturar la emisión del colorante de calceína. LP560 se utiliza en el canal 3 con el láser 543 para capturar la emisión del homodímero etidio 1. NFT 635 se utiliza con el láser 633 para capturar la emisión de la anexina V. El propósito del HFT es separar la luz de excitación y emisión. NFT divide la luz reflejando la luz < longitud de onda especificada a un canal separado mientras permite que la luz > una longitud de onda específica a través de un segundo canal. Los filtros LP bloquean longitudes de onda más cortas que la longitud de onda especificada y dejan pasar las longitudes de onda más largas.
    3. Para crear una imagen en 3D, establezca la confocal en Z-stack y escanee al menos 20 fotogramas.

3. Exposición de las células a la radiación UV

  1. Sembrar las células a 5 × 104/mL de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno-1 de 24 pocillos e incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 3 h. Después del período de incubación, reducir el volumen del medio en los pocillos a 300 μL. A continuación, exponga las células a la radiación UV (tanto UVA a 6,48 W / m 2 como UVB a 1,82 W / m2, ya que los tubos UVA y UVB se encienden en la incubadora al mismo tiempo) en una incubadora de 37 ° C durante 5 y 20 minutos en experimentos separados.
  2. Después de la radiación UV, añadir 200 μL de HOEM fresco a cada pocillo e incubar durante 20 h a 37 °C con 5% deCO2.
  3. Después de la incubación, recoja el sobrenadante celular en cada pocillo y transfiéralo a tubos estériles de polipropileno de 2 ml. Congelar a -80 °C. Para determinar los niveles de citoquinas liberados por los pHCEC e iHCEC después de la exposición a los rayos UV, utilice un ensayo de citoquinas multiplex y siga las instrucciones del kit para cuantificar las siguientes cuatro citocinas: IL-6, IL-8, IL-1β y TNF-α.
  4. Agregue reactivo de ensayo metabólico a las células en los pocillos.
  5. Preparar un reactivo de ensayo metabólico al 10% en DMEM/F12. Sustituir el medio de cultivo de cada pocillo por 1 ml de la solución de ensayo metabólico al 10% e incubar a 37 °C conCO2 al 5% durante 4 h.
  6. Mida la fluorescencia de cada solución utilizando un lector de placas fluorescentes a longitudes de onda de excitación/emisión de 530/590 nm.

4. Exposición de las células a toxinas químicas

  1. Sembrar células a 5 × 104/mL de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno-1 de 24 pocillos e incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 3 h. Después del período de incubación, retire el medio y exponga las células a 1 ml de toxinas químicas (BAK 0.001%,H2O2 0.01% y SDS 0.0025% en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) durante 5 y 15 min.
  2. Después de la exposición a las toxinas químicas, retire las toxinas de los pozos, enjuague con 1 ml de PBS y agregue 1 ml de HOEM a cada pozo. Después de 20 h de incubación, realizar un ensayo metabólico reemplazando el medio con 1 ml de una solución de ensayo metabólico al 10% e incubando a 37 °C con 5% deCO2 durante 4 h. Mida la fluorescencia utilizando un lector de placas de fluorescencia de pocillos múltiples a longitudes de onda de excitación/emisión de 530/590 nm.
  3. Transfiera los sobrenadantes celulares de los pocillos después de la incubación de 20 h a tubos de polipropileno estériles separados de 2 ml y congele a -80 °C. Cuantificar las citoquinas liberadas por los pHCEC e iHCEC después de la exposición a los productos químicos. Utilice la misma plataforma multiplex utilizada para evaluar las citoquinas de las células tratadas con UV. Use un ensayo de citoquinas multiplex siguiendo las instrucciones del kit para cuantificar las siguientes cuatro citocinas: IL-6, IL-8, IL-1β y TNF-α.

5. Examen de células expuestas a diversas concentraciones de BAK

  1. Sembrar células a 1 × 10 5/mL de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno-1 de 24 pocillos e incubar a 37 °C con5% deCO2 durante 24 h. Después del período de incubación, retire el medio y exponga las células a 1 ml de toxinas químicas (BAK 0.001%, BAK 0.005% y BAK 0.01% en PBS) durante 5 min.
  2. Después de la exposición, elimine las toxinas químicas, enjuague los pocillos con 1 ml de PBS y agregue 1 ml de HOEM a cada pocillo. Después de 20 h de incubación, teñir las células con 500 μL de solución tampón de tinción de anexina que contenga calceína (4 μM), etidio homodímero-1 (8 μM) y anexina V (5 μL en 500 μL tampón-Alexa Fluor 647 conjugado) durante 20 min a 37 °C. Ajuste el microscopio para medir las intensidades de la tinción de anexina V, calceína AM y etidio-1 en longitudes de onda de excitación/emisión de 630/675 nm, 495/515 nm y 528/617 nm, respectivamente. Obtener imágenes de las células con el microscopio de fluorescencia

6. Análisis de datos

  1. Realice una prueba de normalidad y una prueba de varianzas iguales antes de realizar un análisis de varianza (ANOVA), ANOVA de Welch o prueba de Kruskal-Wallis. Utilice la prueba post-hoc adecuada para comparar cada grupo probado. Establezca p < 0.05.

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Representative Results

Tamaño de la celda
Los HCEC primarios e inmortalizados se visualizaron con tres colorantes fluorescentes, que reflejan tres etapas diferentes de viabilidad celular. Las células vivas son verdes (calceína-AM), las células muertas son rojas (ethidium homodimer-1) y las células apoptóticas son amarillas (anexina V-color ajustado por computadora para una mejor visualización de la señal de fluorescencia). Las células vivas contienen esterasas en el citoplasma celular y convierten la calceína-AM en calceína. Las células muertas tienen membranas celulares que son permeables al homodímero-1 del etidio. Las células apoptóticas tienen tinción en la membrana celular ya que la fosfatidilserina se transloca a la membrana externa.

Se realizó una comparación del tamaño celular para los dos tipos de HCEC después de 24 y 48 h de crecimiento mediante microscopía confocal, como se muestra en la Figura 1. Los iHCEC (Figura 1A) son células más pequeñas que varían de 10 μm a 20 μm, y los pHCEC (Figura 1B) varían en tamaño de 20 μm a 50 μm después de 24 h de crecimiento. Se observaron diferencias similares en el rango de tamaño para iHCEC (Figura 1C) y pHCEC (Figura 1D) después de 48 h de crecimiento. Las imágenes 3D de los dos tipos de HCEC se realizaron utilizando microscopía confocal (la Figura 2A muestra pHCEC; La figura 2B muestra iHCECs).

Figure 1
Figura 1: Comparación del tamaño celular mediante microscopía confocal . iHCECs después de 24 (A) y 48 (C) h de crecimiento con células que varían en tamaño de 10 a 20 μm. pHCECs después de 24 (B) y 48 (D) h de crecimiento con células que varían en tamaño de 20 a 50 μm. Objetivo de agua 40x. Barras de escala = 10 y 20 μm (A); 25 y 50 μm (B); 10 y 20 μm (C); 50 μm (D). Abreviaturas: iHCECs = células epiteliales corneales humanas inmortalizadas; pHCECs = células epiteliales corneales humanas primarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes confocales 3D. Imágenes confocales 3D de pHCEC después de 48 h de crecimiento (A) e iHCEC después de 24 h (B). Objetivo de agua 40x. Abreviaturas: iHCECs = células epiteliales corneales humanas inmortalizadas; pHCECs = células epiteliales corneales humanas primarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Efecto de los rayos UV en HCEC primarios e inmortalizados
La actividad metabólica de los HCEC primarios e inmortalizados después de la exposición a los rayos UV se muestra en la Figura 3. La figura muestra las medias normalizadas de los pozos de prueba (pozos cuadruplicados, dos experimentos separados). En comparación con las células no expuestas a los rayos UV, la actividad metabólica de los pHCEC irradiados se redujo significativamente a los 20 minutos de exposición. Para los iHCEC, la actividad metabólica disminuyó para las células irradiadas a los 5 y 20 minutos. Por lo tanto, se necesitó un tiempo de exposición más largo para reducir la actividad metabólica de los pHCEC que de los iHCEC.

Figure 3
Figura 3: La actividad metabólica de pHCECs e iHCECs después de la exposición a 5 y 20 min de radiación UV. *p < 0,05 del control no expuesto a los rayos UV. El control no expuesto a los rayos UV son células en pozos incubados con las muestras de prueba pero no expuestas a los rayos UV. El eje Y es el porcentaje relativo a la actividad metabólica de las células no expuestas a los rayos UV. Las barras de error indican la desviación estándar. Abreviaturas: iHCECs = células epiteliales corneales humanas inmortalizadas; pHCECs = células epiteliales corneales humanas primarias; UV = ultravioleta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El efecto de la exposición a los rayos UV en la liberación de citoquinas inflamatorias de los HCEC se muestra en la Figura 4. La liberación máxima de citoquinas ocurrió en diferentes momentos de exposición UV para los HCEC primarios e inmortalizados. La liberación máxima de citoquinas por los iHCEC fue a los 5 min de exposición UV. Las células liberaron niveles significativos (p < 0.05) de IL-1β, IL-6 e IL-8 en comparación con las células no expuestas a los rayos UV. Además, no se produjo una liberación significativa de citoquinas a los 20 min de exposición UV para los iHCEC. Sin embargo, la liberación máxima de citoquinas para los pHCEC ocurrió a los 20 min de exposición a los rayos UV. Las cuatro citoquinas (IL-1β, IL-6, IL-8 y TNF-α) se liberaron a niveles significativos en comparación con las células no expuestas a los rayos UV. En términos de cantidades totales de citoquinas inflamatorias liberadas (pg/mL), las pHCEC liberaron sustancialmente más IL-1β, IL-8 y TNF- α que las iHCEC, mientras que las iHCEC liberaron más IL-6.

Figure 4
Figura 4: Liberación de citoquinas por los pHCECs e iHCECs después de la exposición a la radiación UV en pg/mL. Las cuatro citoquinas proinflamatorias cuantificadas son IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) y TNF-α (D). *p < 0,05 del control no expuesto a los rayos UV. Las barras de error indican la desviación estándar. Abreviaturas: iHCECs = células epiteliales corneales humanas inmortalizadas; pHCECs = células epiteliales corneales humanas primarias; UV = ultravioleta; IL = interleucina; TNF-α = factor de necrosis tumoral alfa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Efectos de las toxinas químicas en HCEC primarios e inmortalizados
El porcentaje de reducción en la actividad metabólica después de la exposición a las tres toxinas oculares fue similar entre los pHCEC e iHCEC, como se muestra en la Figura 5. La figura muestra las medias normalizadas de los pozos de prueba (pozos cuadruplicados, dos experimentos separados).

Figure 5
Figura 5: Actividad metabólica de pHCECs e iHCECs después de la exposición a tres toxinas oculares durante 5 y 15 min. *p < 0,05 del control. Los controles no expuestos a toxinas son células en pozos incubados con las muestras de prueba pero no expuestas a toxinas químicas. El eje Y es el porcentaje relativo a la actividad metabólica de las células no expuestas a toxinas químicas. Las barras de error indican la desviación estándar. Abreviaturas: iHCECs = células epiteliales corneales humanas inmortalizadas; pHCECs = células epiteliales corneales humanas primarias; BAK = cloruro de benzalconio; H2O2= peróxido de hidrógeno; SDS = dodecil sulfato de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las cantidades de citoquinas liberadas por los pHCEC fueron mayores que las cantidades liberadas por los iHCEC. La liberación de citoquinas IL-6 fue la más afectada por la exposición a los tres productos químicos (BAK 0.001%,H2O2 0.01%, SDS 0.0025%, Figura 6). La figura muestra las medias (pg/mL) de los pozos de prueba (pozos cuadruplicados, dos experimentos separados). Tanto los pHCEC como los iHCEC mostraron un cambio en la liberación de IL-6 después de la exposición a los tres productos químicos. BAK causó una disminución en la liberación de IL-6 en comparación con el control para HCEC primarios e inmortalizados, mientras queH2O2 causó un aumento en la liberación de IL-6 de iHCEC y una disminución en la liberación de pHCEC.

Figure 6
Figura 6: Liberación de citoquinas. Liberación de citoquinas por los pHCECs e iHCECs después de la exposición a tres toxinas oculares durante 5 y 15 min en pg/mL. Las cuatro citoquinas proinflamatorias cuantificadas son IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) y TNF-α (D). *p < 0,05 del control. Las barras de error indican la desviación estándar. Abreviaturas: iHCECs = células epiteliales corneales humanas inmortalizadas; pHCECs = células epiteliales corneales humanas primarias; BAK = cloruro de benzalconio; H2O2= peróxido de hidrógeno; SDS = dodecil sulfato de sodio; IL = interleucina; TNF-α = factor de necrosis tumoral alfa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Efectos de diversas concentraciones de BAK sobre la viabilidad celular
Los efectos de las concentraciones de BAK 0.001%, 0.005% y 0.01% durante 5 min sobre la viabilidad de iHCEC se muestran en la Figura 7. BAK mostró poco efecto en 0.001% tanto para pHCEC como para iHCEC. Tanto los pHCEC como los iHCEC se dañaron significativamente al 0,005% y al 0,01% del BAK. Con 0,005% y 0,01% de BAK, el grado de tinción de etidio fue mayor en iHCEC que en pHCEC. La calceína se tiñe de verde, el etidio se tiñe de rojo y la anexina V de azul (color de anexina V ajustado por computadora para una mejor visualización de la señal de fluorescencia)

Figure 7
Figura 7: Imágenes microscópicas de fluorescencia de pHCECs e iHCECs expuestas a diferentes concentraciones de BAK durante 5 min. Barras de escala = 200 μm; Objetivo 10x. Abreviaturas: iHCECs = células epiteliales corneales humanas inmortalizadas; pHCECs = células epiteliales corneales humanas primarias; BAK = cloruro de benzalconio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se evaluaron las diferencias potenciales en el uso de dos tipos de HCEC. Las células se colocaron en el mismo medio (HOEM) en concentraciones idénticas de células y luego se expusieron a períodos cortos y largos de radiación UV y tres toxinas oculares. Las dosis de radiación UV y productos químicos se seleccionaron en función de sus efectos fisiológicos, que eran lo suficientemente dañinos para las células como para producir respuestas intermedias que pudieran compararse. Los tiempos de exposición de 5 y 20 min para la radiación UV y 5 y 15 min para las dosis seleccionadas de BAK (0,001%), SDS (0,0025%) yH2O2(0,01%) fueron tiempos de exposición y concentraciones ideales que mostraron respuestas significativamente diferentes entre las células y los controles no tratados.

HOEM es un medio libre de suero optimizado para el cultivo de HCEC. HOEM apoya el crecimiento de células primarias e inmortalizadas. La línea celular inmortalizada utilizada en esta investigación fue inmortalizada usando SV408. Las células inmortalizadas con SV40 expresan proteínas oncogénicas que pueden promover la progresión del ciclo celular al interferir con Rb, p53 y pp2a17. El retinoblastoma (Rb) se une e inhibe los factores de transcripción E2F, que, cuando no se inhiben, permiten que una célula progrese en el ciclo celular y se divida18. La molécula p53 también se une a factores de transcripción para controlar la progresión del ciclo celular19. La inhibición de una tercera molécula, pp2a20,21, también promueve la proliferación celular 22. La expresión de proteínas oncogénicas SV40 que inhiben Rb, p53 y pp2a17 puede contribuir a las diferencias en la respuesta de iHCECs vs. pHCECs. Los tamaños celulares de los dos tipos de HCEC también fueron diferentes, lo que puede deberse a estas proteínas inhibidoras de oncogenes porque las células inmortalizadas se ven obligadas a dividirse por estas moléculas antes de que las células alcancen el gran tamaño de las células primarias.

La exposición corneal a la radiación UV puede causar daño severo a las células epiteliales corneales. La radiación UV puede producir especies reactivas de oxígeno en la célula, dañar el ADN y las moléculas celulares, e interrumpir los procesos enzimáticos23,24. UVB daña directamente el ADN, y UVA daña el ADN y otras moléculas celulares a través de la producción de especies reactivas de oxígeno dentro de la célula que luego pueden reaccionar con otras biomoléculas25,26. Este daño UV puede causar citotoxicidad e inflamación debido a la liberación de citoquinas inflamatorias de las células expuestas 3,27. En este estudio, las células inmortalizadas fueron más sensibles a los efectos de la radiación UV sobre la actividad metabólica celular, ya que hubo una caída en la actividad metabólica de las células inmortalizadas pero no en la línea celular primaria después de 5 minutos. También se produjeron diferencias en la liberación de citoquinas inflamatorias entre los pHCEC y los iHCEC. Los pHCEC liberaron más IL-1β, IL-8 y TNF-α que los iHCEC después de 20 minutos de radiación UV. Estas diferencias en la liberación de citoquinas podrían estar relacionadas con las diferencias entre el tamaño celular de los cultivos celulares primarios e inmortalizados. Los efectos diferenciales en la liberación de citoquinas entre las células primarias e inmortalizadas han sido observados en otro estudio que examinó los efectos del humo del cigarrillo en las líneas celulares primarias e inmortalizadas28.

Para modelar el potencial de las toxinas químicas para causar irritación ocular, se han desarrollado varios modelos de cultivo celular para evaluar la citotoxicidad de estos productos químicos. Este estudio mostró que las toxinas oculares que tienen efectos intermedios sobre los HCEC tienen aproximadamente el mismo porcentaje de disminución en la actividad metabólica tanto para los HCEC primarios como para los inmortalizados. Las tres toxinas oculares no causaron una liberación sustancial de la mayoría de las citoquinas inflamatorias en comparación con el control no tratado. Sin embargo, este documento muestra la sensibilidad de este método en la detección de los niveles basales de citoquinas. Otro método para detectar citoquinas de líneas celulares inmortalizadas ha sido evaluado y se encontró incapaz de detectar los niveles basales de citoquinas29. Las imágenes microscópicas de cultivos expuestos a BAK mostraron toxicidad tanto en pHCEC como en iHCEC a las concentraciones de 0,005% y 0,01% después de 5 min de exposición y 20 h de recuperación.

Los pasos críticos en este protocolo fueron seleccionar dosis de UV y dosis de toxina ocular que resultaron en toxicidad intermedia para las células y asegurar que cada tipo de HCEC creciera en el mismo medio. Esto permitió realizar comparaciones entre los efectos de cada tratamiento sobre los pHCEC y los iHCEC. Las modificaciones de este método se pueden hacer en el tiempo de exposición a los agentes tóxicos. Sin embargo, se recomienda mantener el tiempo de exposición cerca de los tiempos probados en este protocolo, ya que los puntos de tiempo más cortos pueden no mostrar toxicidad en las células. Por el contrario, una exposición demasiado prolongada puede causar demasiado daño, de modo que las diferencias menores en la toxicidad de las toxinas oculares no podrían compararse con los efectos dañinos de los agentes de prueba descritos en este protocolo.

Una de las ventajas de los HCEC inmortalizados sobre los HCEC primarios es que las células inmortalizadas tenían desviaciones estándar más bajas que las células primarias para la actividad metabólica y la liberación de citoquinas después de la exposición a toxinas oculares. Por lo tanto, para evaluar la actividad metabólica y la liberación de citoquinas después de la exposición, las células inmortalizadas tienen más probabilidades de detectar toxicidad fisiológica que las células primarias. Tanto las células primarias como la línea celular inmortalizada detectaron efectos significativos sobre la actividad metabólica y la liberación de citoquinas después de la exposición a los rayos UV, y ambas detectaron la toxicidad de BAK después de teñir las células con colorantes fluorescentes.

Además de los criterios de valoración de toxicidad mencionados en esta investigación, podrían probarse otros criterios de valoración, incluidos los efectos sobre las uniones estrechas, la proliferación celular, la migración celular y la liberación de citoquinas adicionales. Este protocolo evaluó los efectos de los agentes tóxicos en la liberación de cuatro citoquinas inflamatorias, la actividad metabólica y la viabilidad celular utilizando mediciones de permeabilidad celular, actividad de esterasa y apoptosis. Además, los ensayos in vivo, como los ensayos de irritación ocular en conejos, deben incluirse en una batería de ensayos de toxicidad, ya que los ensayos de toxicidad invitro son adecuados para evaluar el mecanismo de acción de la toxicidad para los HCEC. Se necesitan pruebas in vivo en animales para determinar si existen otros mecanismos inmunes y de toxicidad que no puedan modelarse in vitro.

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Disclosures

El autor, Lyndon W. Jones, durante los últimos 3 años, a través de CORE, ha recibido apoyo de investigación o honorarios de conferencias de las siguientes compañías: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage y Visioneering. Lyndon Jones también es consultor y/o miembro de un consejo asesor de Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis y Ophtecs. Los otros autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores no recibieron fondos para este trabajo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Vented Flask Corning 354485 This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate costar 3370
alamarBlue Fisher Scientific dal 1025
Annexin Staining buffer solution Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates Corning 354505 This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5 BioTek CYT5MPV Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum Hycone SH30396.03
glass bottom coverslips MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells University of Ottawa N/A SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: Millipore, Billerica, MA, USA SCMC001 Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells Millipore, Billerica, MA, USA SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution) Fisher Scientific 12605036

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Determinación de la toxicidad de la radiación UV y los productos químicos en las células epiteliales corneales humanas primarias e inmortalizadas
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Chang, J. M. L., Seo, J., Kwan, M.… More

Chang, J. M. L., Seo, J., Kwan, M. M. Y., Oh, S., McCanna, D. J., Subbaraman, L., Jones, L. Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (173), e62675, doi:10.3791/62675 (2021).

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