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Biology

Détermination de la toxicité du rayonnement UV et des produits chimiques sur les cellules épithéliales cornéennes humaines primaires et immortalisées

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62675
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Centre for Ocular Research & Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR)

Summary

Cet article décrit les procédures utilisées pour évaluer la toxicité du rayonnement UV et des toxines chimiques sur une lignée cellulaire primaire et immortalisée.

Abstract

Cet article décrit les méthodes de mesure de la toxicité du rayonnement ultraviolet (UV) et des toxines oculaires sur des cultures de cellules épithéliales cornéennes humaines primaires (CSHCp) et immortalisées (CSHCi). Les cellules ont été exposées au rayonnement UV et à des doses toxiques de chlorure de benzalkonium (BAK), de peroxyde d’hydrogène (H2O2) et de dodécylsulfate de sodium (SDS). L’activité métabolique a été mesurée à l’aide d’un test métabolique. La libération de cytokines inflammatoires a été mesurée à l’aide d’un test multiplex interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-8 et facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), et la viabilité des cellules a été évaluée à l’aide de colorants fluorescents.

Les effets néfastes des UV sur l’activité métabolique cellulaire et la libération de cytokines se sont produits à 5 minutes d’exposition aux UV pour l’HCi et à 20 minutes pour les HCECp. Des pourcentages similaires de baisse de l’activité métabolique de l’iHCEC et du pHCEC se sont produits après l’exposition au BAK, H2O2 ou SDS, et les changements les plus significatifs dans la libération de cytokines se sont produits pour l’IL-6 et l’IL-8. La microscopie des cellules exposées à des CSHCi et aux CSHCp Baka a montré la mort cellulaire à 0,005 % d’exposition au BAK, bien que le degré de coloration à l’éthidium soit plus élevé dans les CSEi que dans les CSHCp. En utilisant de multiples méthodes d’évaluation des effets toxiques à l’aide de la microscopie, des évaluations de l’activité métabolique et de la production de cytokines, la toxicité du rayonnement UV et des toxines chimiques a pu être déterminée pour les lignées cellulaires primaires et immortalisées.

Introduction

Des études toxicologiques in vitro sont effectuées pour prédire les effets toxiques des produits chimiques et d’autres agents qui peuvent causer des dommages aux cellules. Dans l’évaluation de la toxicité pour la cornée, les cellules épithéliales cornéennes humaines (CSHC) ont été utilisées dans des modèles pour évaluer ces effets 1,2,3,4. Ces modèles évaluent généralement les effets physiologiques tels que les changements dans l’activité métabolique de la cellule, la prolifération cellulaire et d’autres fonctions cellulaires telles que la production et la libération de cytokines inflammatoires. Pour ces études toxicologiques, des cellules provenant de diverses sources ont été sélectionnées pour évaluer les effets nocifs des produits chimiques et du rayonnement UV sur les HCEC 2,3. Les lignées de CSHCp sont disponibles auprès des entreprises qui fournissent ces cellules à partir de tissus de donneurs d’adultes. Les cellules primaires peuvent être traitées avec de la dispase et grattées doucement de la cornée pour la culture5. Les cellules sont ensuite testées pour les virus et la contamination, puis expédiées cryoconservées dans 10% de diméthylsulfoxyde.

L’avantage des lignées cellulaires primaires est que les cellules sont génétiquement identiques aux cellules du donneur. C’est idéal, car un modèle in vitro devrait imiter le tissu in vivo autant que possible. L’inconvénient des lignées cellulaires primaires est qu’elles ont un nombre limité de divisions ou de passages cellulaires6. Le nombre limité de cellules disponibles limite le nombre d’expériences qui peuvent être menées avec une seule culture primaire, ce qui augmente le coût des expériences.

Des lignées cellulaires immortalisées ont également été utilisées dans des modèles de toxicité de culture cellulaire. Cependant, contrairement à la lignée cellulaire primaire obtenue à partir de tissus in vivo, la lignée cellulaire immortalisée a été génétiquement modifiée. Les cellules immortalisées sont créées en incorporant les gènes d’un virus dans l’ADN des cellules primaires 6,7,8. Les cellules avec une incorporation réussie de gènes viraux sont sélectionnées pour la lignée cellulaire immortalisée. L’avantage de l’immortalisation est qu’elle permet une prolifération rapide indéfinie, fournissant un nombre illimité de cellules pour effectuer plusieurs expériences en utilisant la même lignée cellulaire. Cela permet une cohérence entre les expériences et réduit les coûts.

En plus des changements dans les gènes qui limitaient la prolifération cellulaire, des changements dans l’expression des gènes de fonctionnalité critique pourraient également se produire9. Par conséquent, l’inconvénient de l’utilisation de cellules immortalisées est qu’elles peuvent ne plus représenter les cellules in vivo d’origine en termes de réponse à divers stimuli externes10. Les comparaisons ont consisté à observer les effets toxiques des produits chimiques sur les kératocytes cornéens humains primaires et immortalisés11, ainsi que sur les HCEC immortalisés et les cellules primaires épithéliales cornéennes de lapin12. La comparaison entre les effets des toxines sur les kératocytes humains primaires et les kératocytes immortalisés n’a montré aucune différence significative11. À l’aide des méthodes décrites dans cet article, l’efficacité de ces essais pour évaluer la toxicité du rayonnement UV et des toxines oculaires sur les HCECs et les CSCEi sera déterminée.

Trois toxines oculaires couramment utilisées dans les essais in vitro ont été sélectionnées : BAK,H2O2et SDS. BAK est un conservateur cationique couramment utilisé dans les solutions ophtalmiques 13,14,H2O2est couramment utilisé pour désinfecter les lentilles de contact 15, et SDS est un tensioactif anionique présent dans les détergents et shampooings 14. À l’instar des toxines oculaires, les rayons UV peuvent également causer des dommages importants aux HCEC3. De plus, une surexposition aux UV peut provoquer une affection oculaire connue sous le nom de photokératite caractérisée par des symptômes de larmoiement, une sensibilité à la lumière et une sensation de granularité16.

Il existe un nombre illimité de cultures cellulaires primaires qui peuvent être utilisées et diverses lignées cellulaires immortalisées qui ont été développées. Par conséquent, une étude a été entreprise pour comparer les HCEC primaires à une lignée de HCEC immortalisée afin de déterminer les similitudes et les différences entre les modèles qui incorporent ces types de cellules.

Cette étude a utilisé la microscopie pour évaluer les différences possibles entre les CSEp et les CSEi sur la réponse physiologique des cellules aux UV et aux toxines. Les effets du rayonnement UV et des produits chimiques sur l’activité métabolique cellulaire et la libération de cytokines inflammatoires pour les deux lignées cellulaires ont également été évalués. L’importance de déterminer les différences entre les deux lignées cellulaires est de comprendre l’utilisation optimale de ces lignées cellulaires pour évaluer: 1) l’effet du rayonnement UV sur les cellules, 2) les effets des toxines sur les cellules et 3) les changements qui en résultent sur le métabolisme, la viabilité cellulaire et la libération de cytokines cellulaires pour les études futures.

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Protocol

1. Culture des HCECs et des iHCEC

  1. Cultiver les CSECs et les CSEi dans un milieu épithélial oculaire humain (HOEM) avec les suppléments suivants : 6 mM de L-glutamine, 0,002 % de supplément de milieu cellulaire O (table des matières), 1,0 μM d’épinéphrine, 0,4 % de supplément de milieu cellulaire P (tableau des matériaux), 5 μg/mL d’insuline rh, 5 μg/mL d’apotransférrine et 100 ng/mL d’hémisuccinate d’hydrocortisone dans des flacons de culture enrobés de collagène-1 (18 mL dans une fiole de culture de 75 cm2).
  2. Changez le milieu dans les flacons tous les 2-3 jours en retirant le milieu après que les cellules se développent à ~80% de confluence. Ajouter la solution de dissociation sans rouge de phénol et incuber la fiole à 37 °C jusqu’à ce que les cellules soient complètement détachées. Neutraliser la solution de dissociation avec DMEM/F12 avec du sérum puis centrifuger les cellules à 500 × g. Retirer le milieu surnageant et remettre les cellules en suspension dans le milieu HOEM.

2. Détermination de la taille des cellules par microscopie confocale

  1. Ensemencer les HCECs et les iHCEC sur des boîtes de Petri enrobées de collagène avec des lamelles de couverture à fond de verre à une concentration de 1 × 105 avec 1 mL de HOEM. Cultiver des CSEp et des CSHCi, un ensemble de cultures pendant 24 heures et un autre ensemble de cultures pendant 48 h, dans un incubateur à 37 °C contenant 5 % de CO2.
  2. Après la période d’incubation, colorer les cellules avec 500 μL de solution tampon de coloration à l’annexine contenant de la calcéine (4 μM), de l’homodimère-1 d’éthidium (8 μM) et de l’annexine V (5 μL dans un tampon de 500 μL-conjugué Alexa Fluor 647) pendant 20 minutes à 37 °C. Après coloration des cellules, ajuster le microscope pour capturer les longueurs d’onde d’excitation/émission de 488/515 nm pour la calcéine-AM, 543/600 nm pour l’homodimère-1 d’éthidium et 633/665 nm pour l’annexine V à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.
  3. Obtenez les images et prenez des piles Z pour évaluer la taille des cellules en trois dimensions.
    1. Pour acquérir les images bidimensionnelles (2D) et tridimensionnelles (3D), trouvez la zone à imager avec un objectif d’eau apochromatique 40x/1.2. Avec les lasers Argon (488) (premier balayage), HeNe1 (543) (deuxième balayage) et HeNe2 (633) (troisième balayage), balayez dans trois canaux distincts en utilisant les séparateurs de faisceau, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis et NFT 545 LP560, LP505.
    2. Utilisez l’analyse séquentielle multipiste pour réduire la diaphonie.
      REMARQUE: LP505 est utilisé pour le canal 2 avec le laser 488 pour capturer l’émission du colorant calcéine. Le LP560 est utilisé dans le canal 3 avec le laser 543 pour capturer l’émission de l’homodimère d’éthidium 1. NFT 635 est utilisé avec le laser 633 pour capturer l’émission de l’annexine V. Le but du HFT est de séparer la lumière d’excitation et d’émission. NFT divise la lumière en réfléchissant la lumière < longueur d’onde spécifiée vers un canal séparé tout en laissant la lumière > une longueur d’onde spécifiée à travers un deuxième canal. Les filtres LP bloquent les longueurs d’onde plus courtes que la longueur d’onde spécifiée et laissent passer les longueurs d’onde les plus longues.
    3. Pour imager en 3D, réglez la confocale sur Z-stack et numérisez au moins 20 images.

3. Exposition des cellules aux rayons UV

  1. Ensemencer les cellules à 5 × 104/mL de HOEM dans chaque puits d’une plaque de culture enrobée de collagène-1 à 24 puits et incuber à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 3 h. Après la période d’incubation, réduire le volume du milieu dans les puits à 300 μL. Ensuite, exposez les cellules aux rayons UV (UVA à 6,48 W/m 2 et UVB à 1,82 W/m2 car les tubes UVA et UVB sont allumés dans l’incubateur en même temps) dans un incubateur à 37 °C pendant 5 et 20 minutes dans des expériences séparées.
  2. Après le rayonnement UV, ajouter 200 μL de HOEM frais dans chaque puits et incuber pendant 20 h à 37 °C avec 5% de CO2.
  3. Après l’incubation, recueillir le surnageant cellulaire dans chaque puits et le transférer dans des tubes stériles en polypropylène de 2 mL. Congeler à -80 °C. Pour déterminer les niveaux de cytokines libérés par les CSEp et les CSEi après une exposition aux UV, utilisez un test de cytokines multiplex et suivez les instructions du kit pour quantifier les quatre cytokines suivantes : IL-6, IL-8, IL-1β et TNF-α.
  4. Ajouter le réactif de dosage métabolique aux cellules dans les puits.
  5. Préparer le réactif métabolique à 10% dans le DMEM/F12. Remplacer le milieu de culture dans chaque puits par 1 mL de la solution de dosage métabolique à 10 % et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 4 h.
  6. Mesurer la fluorescence de chaque solution à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes à des longueurs d’onde d’excitation/émission de 530/590 nm.

4. Exposition des cellules aux toxines chimiques

  1. Cellules de semence à 5 × 104/mL de HOEM dans chaque puits d’une plaque de culture enrobée de collagène-1 à 24 puits et incuber à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 3 h. Après la période d’incubation, retirer le milieu et exposer les cellules à 1 mL de toxines chimiques (BAK 0,001%, H2 O2 0,01% et SDS 0,0025% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) pendant 5 et 15 min.
  2. Après l’exposition aux toxines chimiques, retirez les toxines des puits, rincez avec 1 mL de PBS et ajoutez 1 mL de HOEM à chaque puits. Après 20 h d’incubation, effectuer un dosage métabolique en remplaçant le milieu par 1 mL d’une solution de dosage métabolique à 10 % et en incubant à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 4 h. Mesurer la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques multipuits à fluorescence à des longueurs d’onde d’excitation/émission de 530/590 nm.
  3. Transfère les surnageants cellulaires des puits après l’incubation de 20 h dans des tubes de polypropylène stériles séparés de 2 ml et les congèle à -80 °C. Quantifier les cytokines libérées par les HCECs et les HCECs après exposition aux produits chimiques. Utilisez la même plateforme multiplex utilisée pour évaluer les cytokines des cellules traitées aux UV. Utilisez un test de cytokines multiplex en suivant les instructions du kit pour quantifier les quatre cytokines suivantes: IL-6, IL-8, IL-1β et TNF-α.

5. Examen des cellules exposées à diverses concentrations de BAK

  1. Cellules semencières à 1 × 10 5/mL de HOEM dans chaque puits d’une plaque de culture enrobée de collagène-1 à 24 puits et incuber à 37 °C avec5% de CO2 pendant 24 h. Après la période d’incubation, retirer le milieu et exposer les cellules à 1 mL de toxines chimiques (BAK 0,001%, BAK 0,005% et BAK 0,01% dans PBS) pendant 5 min.
  2. Après l’exposition, enlever les toxines chimiques, rincer les puits avec 1 mL de PBS et ajouter 1 mL de HOEM à chaque puits. Après 20 h d’incubation, colorer les cellules avec 500 μL de solution tampon de coloration à l’annexine contenant de la calcéine (4 μM), de l’homodimère-1 d’éthidium (8 μM) et de l’annexine V (5 μL dans un tampon de 500 μL-conjugué Alexa Fluor 647) pendant 20 min à 37 °C. Ajustez le microscope pour mesurer les intensités de coloration à l’annexine V, à la calcéine AM et à l’éthidium-1 à des longueurs d’onde d’excitation/émission de 630/675 nm, 495/515 nm et 528/617 nm, respectivement. Imager les cellules à l’aide du microscope à fluorescence

6. Analyse des données

  1. Effectuer un test de normalité et un test de variances égales avant d’effectuer une analyse de variance (ANOVA), une ANOVA de Welch ou un test de Kruskal-Wallis. Utilisez le test post-hoc approprié pour comparer chaque groupe testé. Définissez p < 0,05.

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Representative Results

Taille de la cellule
Les HCEC primaires et immortalisés ont été visualisés avec trois colorants fluorescents, qui reflètent trois stades différents de viabilité cellulaire. Les cellules vivantes sont vertes (calcéine-AM), les cellules mortes sont rouges (homodimère-1 d’éthidium) et les cellules apoptotiques sont jaunes (couleur ajustée par ordinateur V-annexine pour une meilleure visualisation du signal de fluorescence). Les cellules vivantes contiennent des estérases dans le cytoplasme cellulaire et convertissent la calcéine-AM en calcéine. Les cellules mortes ont des membranes cellulaires perméables à l’homodimère d’éthidium-1. Les cellules apoptotiques ont une coloration au niveau de la membrane cellulaire lorsque la phosphatidylsérine est transférée à la membrane externe.

Une comparaison de la taille des cellules pour les deux types de HCEC après 24 et 48 h de croissance a été effectuée par microscopie confocale, comme le montre la figure 1. Les HCECHi (figure 1A) sont des cellules plus petites dont la taille varie de 10 μm à 20 μm, et celle des HCECs (figure 1B) varie de 20 μm à 50 μm après 24 h de croissance. Des différences similaires dans la gamme de taille ont été observées pour les CSEi (figure 1C) et les CSEp (figure 1D) après 48 heures de croissance. Les images 3D des deux types de HCEC ont été réalisées par microscopie confocale (la figure 2A montre les HCEC; La figure 2B montre les CSHCi).

Figure 1
Figure 1 : Comparaison de la taille des cellules par microscopie confocale. CSEi après 24 (A) et 48 (C) h de croissance avec des cellules dont la taille varie de 10 à 20 μm. pHCEC après 24 (B) et 48 (D) h de croissance avec des cellules dont la taille varie de 20 à 50 μm. 40x objectif d’eau. Barres d’échelle = 10 et 20 μm (A); 25 et 50 μm (B); 10 et 20 μm (C); 50 μm (D). Abréviations : iHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées; pHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines primaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Images confocales 3D. Images confocales 3D des HCECs après 48 h de croissance (A) et des HCECHi après 24 h (B). Objectif d’eau 40x. Abréviations : iHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées; pHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines primaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Effet des UV sur les HCEC primaires et immortalisés
L’activité métabolique des HCEC primaires et immortalisés après exposition aux UV est illustrée à la figure 3. La figure montre les moyennes normalisées des puits d’essai (puits quadrupliques, deux expériences distinctes). Par rapport aux cellules non exposées aux UV, l’activité métabolique des HCEC irradiés a été considérablement réduite après 20 minutes d’exposition. Pour les CSHCi, l’activité métabolique a diminué pour les cellules irradiées à la fois à 5 et 20 min. Par conséquent, il a fallu un temps d’exposition plus long pour réduire l’activité métabolique des HCEC que des HCECi.

Figure 3
Figure 3 : Activité métabolique des HCECs et des CSEi après exposition à 5 et 20 min de rayonnement UV. *p < 0,05 du témoin non exposé aux UV. Les témoins non exposés aux UV sont des cellules dans des puits incubées avec les échantillons d’essai mais non exposées aux UV. L’axe des Y est le pourcentage par rapport à l’activité métabolique des cellules non exposées aux UV. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. Abréviations : iHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées; pHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines primaires; UV = ultraviolet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’effet de l’exposition aux UV sur la libération de cytokines inflammatoires par les HCEC est illustré à la figure 4. La libération maximale de cytokines s’est produite à différents moments de l’exposition aux UV pour les CSEH primaires et immortalisés. La libération maximale de cytokines par les HCEC a été de 5 minutes d’exposition aux UV. Les cellules ont libéré des niveaux significatifs (p < 0,05) d’IL-1β, IL-6 et IL-8 par rapport aux cellules non exposées aux UV. De plus, aucune libération significative de cytokines ne s’est produite après 20 minutes d’exposition aux UV pour les HCECi. Cependant, la libération maximale de cytokines pour les HCECs s’est produite à 20 minutes d’exposition aux UV. Les quatre cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8 et TNF-α) ont été libérées à des niveaux significatifs par rapport aux cellules non exposées aux UV. En termes de quantités totales de cytokines inflammatoires libérées (pg/mL), les HCECs ont libéré beaucoup plus d’IL-1β, d’IL-8 et de TNF-α que les HCECi, tandis que les HCEC ont libéré plus d’IL-6.

Figure 4
Figure 4 : Libération de cytokines par les CSEp et les CSEi après exposition au rayonnement UV en pg/mL. Les quatre cytokines pro-inflammatoires quantifiées sont IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) et TNF-α (D). *p < 0,05 du témoin non exposé aux UV. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. Abréviations : iHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées; pHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines primaires; UV = ultraviolet; IL = interleukine; TNF-α = facteur de nécrose tumorale alpha. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Effets des toxines chimiques sur les HCEC primaires et immortalisés
Le pourcentage de réduction de l’activité métabolique après l’exposition aux trois toxines oculaires était similaire entre les HCECs et les CSHCi, comme le montre la figure 5. La figure montre les moyennes normalisées des puits d’essai (puits quadrupliques, deux expériences distinctes).

Figure 5
Figure 5 : Activité métabolique des HCECs et des HCECs après exposition à trois toxines oculaires pendant 5 et 15 min. *p < 0,05 du témoin. Les témoins non exposés aux toxines sont des cellules dans des puits incubées avec les échantillons d’essai, mais non exposées à des toxines chimiques. L’axe des Y est le pourcentage par rapport à l’activité métabolique des cellules non exposées aux toxines chimiques. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. Abréviations : iHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées; pHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines primaires; BAK = chlorure de benzalkonium; H2O2= peroxyde d’hydrogène; SDS = dodécylsulfate de sodium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les quantités de cytokines libérées par les HCECs étaient supérieures aux quantités libérées par les CSHCi. La libération de cytokine IL-6 a été la plus affectée par l’exposition aux trois produits chimiques (BAK 0,001%,H 2 O2 0,01%, SDS 0,0025%, Figure 6). La figure montre les moyennes (pg/mL) des puits d’essai (puits quadrupliqués, deux expériences distinctes). Les HCECs et les HCECs ont montré un changement dans la libération d’IL-6 après exposition aux trois produits chimiques. BAK a entraîné une diminution des rejets d’IL-6 par rapport au témoin pour les HCEC primaires et immortalisés, tandis queH2O2 a entraîné une augmentation de la libération d’IL-6 par les HCEC et une diminution des rejets de HCEC.

Figure 6
Figure 6 : Libération de cytokines. Libération de cytokines par les HCECs et les CSEi après exposition à trois toxines oculaires pendant 5 et 15 minutes en pg/mL. Les quatre cytokines pro-inflammatoires quantifiées sont IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) et TNF-α (D). *p < 0,05 du contrôle. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. Abréviations : iHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées; pHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines primaires; BAK = chlorure de benzalkonium; H2O2= peroxyde d’hydrogène; FDS = dodécylsulfate de sodium; IL = interleukine; TNF-α = facteur de nécrose tumorale alpha. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Effets de diverses concentrations de BAK sur la viabilité cellulaire
Les effets des concentrations BAK de 0,001 %, 0,005 % et 0,01 % pendant 5 min sur la viabilité des HCEC sont illustrés à la figure 7. BAK a montré peu d’effet à 0,001% pour les CSEp et les CSEHi. Les HCECs et les iHCEC ont été significativement endommagés à 0,005 % et 0,01 % des BAK. À 0,005 % et 0,01 % des CSTEC, le degré de coloration à l’éthidium était plus élevé dans les CSEi que dans les CSTECp. Calcéine colore en vert, éthidium colore en rouge et annexine V en bleu (couleur ajustée par ordinateur de l’annexine V pour une meilleure visualisation du signal de fluorescence)

Figure 7
Figure 7 : Images microscopiques à fluorescence de CSEp et de HCECs i exposés à différentes concentrations de BAK pendant 5 min. Barres d’échelle = 200 μm; Objectif 10x. Abréviations : iHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées; pHCEC = cellules épithéliales cornéennes humaines primaires; BAK = chlorure de benzalkonium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les différences potentielles dans l’utilisation de deux types de HCEC ont été évaluées. Les cellules ont été placées dans le même milieu (HOEM) à des concentrations identiques de cellules, puis exposées à de courtes et longues périodes de rayonnement UV et à trois toxines oculaires. Les doses de rayonnement UV et de produits chimiques ont été sélectionnées en fonction de leurs effets physiologiques, qui étaient suffisamment dommageables pour les cellules pour produire des réponses intermédiaires pouvant être comparées. Des temps d’exposition de 5 et 20 minutes pour le rayonnement UV et de 5 et 15 minutes pour les doses sélectionnées de BAK (0,001 %), de SDS (0,0025 %) et deH2O2(0,01 %) étaient des temps d’exposition idéaux et des concentrations qui ont montré des réponses significativement différentes entre les cellules et les témoins non traités.

HOEM est un milieu sans sérum optimisé pour la culture des HCEC. HOEM soutient la croissance des cellules primaires et immortalisées. La lignée cellulaire immortalisée utilisée dans cette étude a été immortalisée à l’aide de SV408. Les cellules immortalisées SV40 expriment des protéines oncogènes qui peuvent favoriser la progression du cycle cellulaire en interférant avec Rb, p53 et pp2a17. Le rétinoblastome (Rb) se lie et inhibe les facteurs de transcription E2F, qui, lorsqu’ils ne sont pas inhibés, permettent à une cellule de progresser dans le cycle cellulaire et de se diviser18. La molécule p53 se lie également à des facteurs de transcription pour contrôler la progression du cycle cellulaire19. L’inhibition d’une troisième molécule, pp2a20,21, favorise également la proliférationcellulaire22. L’expression des protéines oncogènes SV40 qui inhibent Rb, p53 et pp2a17 peut contribuer aux différences de réponse des HCEC par rapport aux HCECp. La taille des cellules des deux types de HCEC était également différente, ce qui peut être dû à ces protéines inhibitrices d’oncogènes, car les cellules immortalisées sont forcées de se diviser par ces molécules avant que les cellules n’atteignent la grande taille des cellules primaires.

L’exposition cornéenne aux rayons UV peut causer de graves dommages aux cellules épithéliales cornéennes. Le rayonnement UV peut produire des espèces réactives de l’oxygène dans la cellule, endommager l’ADN et les molécules cellulaires et perturber les processus enzymatiques23,24. Les UVB endommagent directement l’ADN, et les UVA endommagent l’ADN et d’autres molécules cellulaires via la production d’espèces réactives de l’oxygène dans la cellule qui peuvent ensuite réagir avec d’autres biomolécules25,26. Ces dommages causés par les UV peuvent provoquer une cytotoxicité et une inflammation dues à la libération de cytokines inflammatoires à partir des cellules exposées 3,27. Dans cette étude, les cellules immortalisées étaient plus sensibles aux effets du rayonnement UV sur l’activité métabolique cellulaire, car il y avait une baisse de l’activité métabolique des cellules immortalisées, mais pas dans la lignée cellulaire primaire après 5 minutes. Des différences dans la libération de cytokines inflammatoires se sont également produites entre les HCEC et les CSHCi. Les HCECs ont libéré plus d’IL-1β, d’IL-8 et de TNF-α que les HCECs après 20 min de rayonnement UV. Ces différences dans la libération de cytokines pourraient être liées aux différences entre la taille cellulaire des cultures cellulaires primaires et immortalisées. Des effets différentiels dans la libération de cytokines entre les cellules primaires et immortalisées ont été notés dans une autre étude qui a examiné les effets de la fumée de cigarette sur les lignées cellulaires primaires et immortalisées28.

Pour modéliser le potentiel des toxines chimiques à provoquer une irritation oculaire, divers modèles de culture cellulaire ont été développés pour évaluer la cytotoxicité de ces produits chimiques. Cette étude a montré que les toxines oculaires qui ont des effets intermédiaires sur les HCEC ont approximativement le même pourcentage de diminution de l’activité métabolique pour les HCEC primaires et immortalisés. Les trois toxines oculaires n’ont pas provoqué une libération substantielle de la plupart des cytokines inflammatoires par rapport au témoin non traité. Cependant, cet article montre la sensibilité de cette méthode dans la détection des niveaux de cytokines de base. Une autre méthode de détection des cytokines à partir de lignées cellulaires immortalisées a été évaluée et s’est révélée incapable de détecter les niveaux de cytokines de base29. Les images microscopiques des cultures exposées à l’ABK ont montré une toxicité dans les HCECs et les CSEi aux concentrations de 0,005 % et 0,01 % après 5 minutes d’exposition et 20 h de récupération.

Les étapes critiques de ce protocole consistaient à sélectionner des doses d’UV et des doses de toxines oculaires qui entraînaient une toxicité intermédiaire pour les cellules et à s’assurer que chaque type de HCEC se développait dans le même milieu. Cela a permis d’établir des comparaisons entre les effets de chaque traitement sur les CSEp et les CSHCE. Des modifications de cette méthode peuvent être apportées au moment de l’exposition aux agents toxiques. Cependant, il est recommandé de maintenir le temps d’exposition proche des temps testés dans ce protocole, car des points de temps plus courts peuvent ne pas montrer de toxicité sur les cellules. En revanche, une exposition trop longue peut causer trop de dommages, de sorte que des différences mineures dans la toxicité des toxines oculaires ne pourraient pas être comparées aux effets nocifs des agents d’essai décrits dans ce protocole.

L’un des avantages des HCEC immortalisés par rapport aux HCEC primaires est que les cellules immortalisées présentaient des écarts-types inférieurs à ceux des cellules primaires pour l’activité métabolique et la libération de cytokines après exposition à des toxines oculaires. Ainsi, pour évaluer l’activité métabolique et la libération de cytokines après exposition, les cellules immortalisées sont plus susceptibles de détecter une toxicité physiologique que les cellules primaires. Les cellules primaires et la lignée cellulaire immortalisée ont détecté des effets significatifs sur l’activité métabolique et la libération de cytokines après une exposition aux UV, et les deux ont détecté la toxicité du BAK après coloration des cellules avec des colorants fluorescence.

En plus des paramètres de toxicité mentionnés dans cette étude, d’autres paramètres pourraient être testés, y compris les effets sur les jonctions serrées, la prolifération cellulaire, la migration cellulaire et la libération de cytokines supplémentaires. Ce protocole a évalué les effets des agents toxiques sur la libération de quatre cytokines inflammatoires, l’activité métabolique et la viabilité cellulaire en utilisant des mesures de perméabilité cellulaire, d’activité estérase et d’apoptose. En outre, des essais in viv o, tels que des essais d’irritation oculaire chez le lapin, devraient être inclus dans une batterie d’essais de toxicité, car les essais de toxicité invitro conviennent pour évaluer le mécanisme d’action de la toxicité pour les CSHC. Des essais in vivo chez l’animal sont nécessaires pour déterminer s’il existe d’autres mécanismes immunitaires et de toxicité qui ne peuvent pas être modélisés in vitro.

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Disclosures

L’auteur, Lyndon W. Jones, au cours des 3 dernières années, par l’intermédiaire de CORE, a reçu un soutien à la recherche ou des honoraires de conférencier des sociétés suivantes: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J & J Vision, Lubris, Menicon, Nature’s Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage et Visioneering. Lyndon Jones est également consultant et/ou siège à un conseil consultatif pour Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis et Ophtecs. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs n’ont reçu aucun financement pour ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Vented Flask Corning 354485 This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate costar 3370
alamarBlue Fisher Scientific dal 1025
Annexin Staining buffer solution Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates Corning 354505 This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5 BioTek CYT5MPV Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum Hycone SH30396.03
glass bottom coverslips MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells University of Ottawa N/A SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: Millipore, Billerica, MA, USA SCMC001 Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells Millipore, Billerica, MA, USA SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution) Fisher Scientific 12605036

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Détermination de la toxicité du rayonnement UV et des produits chimiques sur les cellules épithéliales cornéennes humaines primaires et immortalisées
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Chang, J. M. L., Seo, J., Kwan, M. M. Y., Oh, S., McCanna, D. J., Subbaraman, L., Jones, L. Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (173), e62675, doi:10.3791/62675 (2021).

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