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Developmental Biology

2 डी कल्चर सिस्टम में अग्नाशयी बीटा-सेल अग्रदूतों में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का भेदभाव

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63298
Automatic Translation
1,2, 1,2
1College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation, 2Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF)

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल प्लानर मोनोलेयर में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) से प्राप्त अग्नाशयी पूर्वजों में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 प्रतिलेखन कारकों की सह-अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए एक बढ़ी हुई विधि का वर्णन करता है। यह ताजा मैट्रिक्स को फिर से भरने, सेल घनत्व में हेरफेर करने और एंडोडर्मल कोशिकाओं को अलग करके प्राप्त किया जाता है।

Abstract

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) प्रारंभिक अग्नाशय के विकास का अध्ययन करने और मधुमेह के आनुवंशिक योगदानकर्ताओं की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हैं। एचपीएससी-व्युत्पन्न इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं को सेल थेरेपी और रोग मॉडलिंग के लिए उत्पन्न किया जा सकता है, हालांकि, सीमित दक्षता और कार्यात्मक गुणों के साथ। एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वज जो बीटा कोशिकाओं और अन्य अंतःस्रावी कोशिकाओं के अग्रदूत हैं, जब दो प्रतिलेखन कारकों पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 को सह-व्यक्त करते हैं, तो पूर्वजों को विट्रो और विवो दोनों में कार्यात्मक, इंसुलिन-स्रावित बीटा कोशिकाओं के लिए निर्दिष्ट करते हैं। एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशय पूर्वजों का उपयोग वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों के हिस्से के रूप में टाइप 1 मधुमेह रोगियों में सेल थेरेपी के लिए किया जाता है। हालांकि, वर्तमान प्रक्रियाएं एनकेएक्स 6.1 और अग्नाशयी पूर्वजों का उच्च अनुपात उत्पन्न नहीं करती हैं, जिससे गैर-कार्यात्मक अंतःस्रावी कोशिकाओं और कुछ ग्लूकोज-उत्तरदायी, इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं का सह-उत्पादन होता है। इस प्रकार इस काम ने एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों को उत्पन्न करने के लिए एक बढ़ाया प्रोटोकॉल विकसित किया जो 2 डी मोनोलेयर में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 की सह-अभिव्यक्ति को अधिकतम करता है। सेल घनत्व, ताजा मैट्रिक्स की उपलब्धता, और एचपीएससी-व्युत्पन्न एंडोडर्मल कोशिकाओं के पृथक्करण जैसे कारकों को संशोधित किया जाता है जो उत्पन्न अग्नाशय पूर्वजों में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 स्तर को बढ़ाते हैं और वैकल्पिक यकृत वंश के लिए प्रतिबद्धता को कम करते हैं। अध्ययन में इस बात पर प्रकाश डाला गया है कि इन विट्रो भेदभाव के दौरान सेल के भौतिक वातावरण में हेरफेर करने से वंश विनिर्देश और जीन अभिव्यक्ति प्रभावित हो सकती है। इसलिए, वर्तमान अनुकूलित प्रोटोकॉल सेल थेरेपी और रोग मॉडलिंग के लिए पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 सह-व्यक्त पूर्वजों की स्केलेबल पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है।

Introduction

मधुमेह एक जटिल चयापचय विकार है जो विश्व स्तर पर लाखों लोगों को प्रभावित करता है। इंसुलिन के पूरक को मधुमेह के लिए एकमात्र उपचार विकल्प माना जाता है। बीटा सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी के साथ अधिक उन्नत मामलों का इलाज किया जाता है, जो या तो पूरे कैडवेरिक अग्न्याशय या आइलेट्स 1,2 के प्रत्यारोपण के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। प्रत्यारोपण चिकित्सा को घेरने वाले कई मुद्दे, जैसे ऊतक की उपलब्धता और गुणवत्ता के साथ सीमा, इम्यूनोसप्रेसेन्ट्स की निरंतर आवश्यकता के अलावा प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं की आक्रामकता। यह बीटा सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी 2,3 के लिए नए और वैकल्पिक विकल्पों की खोज की आवश्यकता है। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) हाल ही में मानव अग्न्याशय जीव विज्ञान को समझने के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में उभरे हैं और प्रत्यारोपण चिकित्सा 4,5,6,7 के लिए एक गैर-संपूर्ण और संभावित रूप से अधिक व्यक्तिगत स्रोत के रूप में उभरे हैं। मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) और मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) सहित एचपीएससी में उच्च आत्म-नवीकरण क्षमता होती है और मानव शरीर के किसी भी ऊतक प्रकार को जन्म देती है। एचईएससी भ्रूण के आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से प्राप्त होते हैं, और एचआईपीएससी को किसी भी दैहिक कोशिका 4,8 से पुन: प्रोग्राम किया जाता है।

निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल को एचपीएससी से अग्नाशयी बीटा कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जाता है जो क्रमिक रूप से अग्नाशय के विकास चरणों के माध्यम से एचपीएससी को निर्देशित करते हैं। ये प्रोटोकॉल एचपीएससी-व्युत्पन्न आइलेट ऑर्गेनोइड उत्पन्न करते हैं। हालांकि उन्होंने अग्नाशयी बीटा कोशिकाओं के अनुपात को बढ़ाने में बहुत सुधार किया है, प्रोटोकॉल की दक्षता अत्यधिक परिवर्तनशील है। यह एनकेएक्स 6.1 + / इंसुलिन + या सी-पेप्टाइड + कोशिकाओं 5,9,10,11,12,13 के ~ 40% से अधिक नहीं बढ़ता है। हालांकि, उत्पन्न बीटा कोशिकाएं अपने ट्रांसक्रिप्शनल और चयापचय प्रोफाइल और ग्लूकोज 4,5,14 के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के संदर्भ मेंवयस्क मानव बीटा कोशिकाओं के समान नहीं हैं। एचपीएससी-व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं में वयस्क मानव आइलेट्स5 की तुलना में पीसीएसके 2, पैक्स 6, यूसीएन 3, एमएएफए, जी 6 पीसी 2 और केसीएनके 3 जैसे प्रमुख बीटा सेल मार्करों की जीन अभिव्यक्ति की कमी होती है। इसके अतिरिक्त, एचपीएससी-व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं ने ग्लूकोज के जवाब में कैल्शियम सिग्नलिंग को कम कर दिया है। वे सह-उत्पन्न पॉलीहार्मोनल कोशिकाओं से दूषित होते हैं जो ग्लूकोजके स्तर को बढ़ाने के जवाब में इंसुलिन की उचित मात्रा का स्राव नहीं करते हैं। दूसरी ओर, एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वज, जो आइलेट अग्रदूत हैं, बीटा कोशिकाओं की तुलना में विट्रो में अधिक कुशलता से उत्पन्न हो सकते हैं और, जब विवो में प्रत्यारोपित किया जाता है, तो कार्यात्मक, इंसुलिन-स्रावित बीटा कोशिकाओं15,16 में परिपक्व हो सकता है। नैदानिक परीक्षण वर्तमान में टी 1 डी विषयों में प्रत्यारोपण पर उनकी सुरक्षा और प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने पर केंद्रित हैं।

विशेष रूप से, एक ही अग्नाशयी पूर्वज कोशिका के भीतर प्रतिलेखन कारक पीडीएक्स 1 (अग्नाशय और डुओडेनल होमोबॉक्स 1) और एनकेएक्स 6.1 (एनकेएक्स 6 होमोबॉक्स 1) की अभिव्यक्ति बीटा सेल वंश5 के प्रति प्रतिबद्धता के लिए महत्वपूर्ण है। अग्नाशय के पूर्वज जो एनकेएक्स 6.1 को व्यक्त करने में विफल रहते हैं, पॉलीहार्मोनल अंतःस्रावी कोशिकाओं या गैर-कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं को जन्म देते हैं 17,18. इसलिए, अग्नाशय ी पूर्वज चरण में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 की एक उच्च सह-अभिव्यक्ति अंततः बड़ी संख्या में कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। अध्ययनों से पता चला है कि एक भ्रूणीय शरीर या 3 डी संस्कृति अग्नाशयी पूर्वजों में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 को बढ़ाती है जहां विभेदक कोशिकाएं एकत्रित होती हैं, पीडीएक्स 1 + / एनकेएक्स 6.1 + आबादी12,19 के 40% -80% के बीच भिन्न होती हैं। हालांकि, निलंबन संस्कृतियों की तुलना में, 2 डी भेदभाव संस्कृतियां कई सेल लाइनों5 पर आवेदन के लिए अधिक लागत प्रभावी, व्यवहार्य और सुविधाजनक हैं। हमने हाल ही में दिखाया कि मोनोलेयर भेदभाव संस्कृतियां पीडीएक्स 1 + / एनकेएक्स 6.1 + के 90% से अधिक एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों20,21,22 को सह-व्यक्त करती हैं। रिपोर्ट की गई विधि ने उत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों को एक उच्च प्रतिकृति क्षमता प्रदान की और यकृत वंश21 जैसे वैकल्पिक भाग्य विनिर्देशों को रोका। इसलिए, यहां, यह प्रोटोकॉल पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 को सह-व्यक्त करने वाले अग्नाशयी बीटा-सेल अग्रदूतों के लिए एचपीएससी के भेदभाव के लिए एक अत्यधिक कुशल विधि प्रदर्शित करता है। यह विधि एचपीएससी-व्युत्पन्न एंडोडर्म को अलग करने और सेल घनत्व में हेरफेर करने की तकनीक का उपयोग करती है, इसके बाद पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 सह-अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के लिए एक विस्तारित एफजीएफ और रेटिनोइड सिग्नलिंग के साथ-साथ हेजहोग निषेध (चित्रा 1)। यह विधि प्रत्यारोपण चिकित्सा और रोग मॉडलिंग के लिए एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी बीटा-सेल अग्रदूतों की एक स्केलेबल पीढ़ी की सुविधा प्रदान कर सकती है।

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Protocol

अध्ययन को उपयुक्त संस्थागत अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और हेलसिंकी की 1964 की घोषणा और इसके बाद के संशोधनों या तुलनीय नैतिक मानकों में निर्धारित नैतिक मानकों का पालन करते हुए प्रदर्शन किया गया है। प्रोटोकॉल को एचएमसी (संख्या 16260/16) और कतर बायोमेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट (क्यूबीआरआई) (संख्या 2016-003) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। यह काम H1, H9 और HUES8 जैसे HESCs के लिए अनुकूलित है। हमाद मेडिकल कॉरपोरेशन (एचएमसी) अस्पताल से स्वस्थ व्यक्तियों के रक्त के नमूने पूरी सहमति के साथ प्राप्त किए गए थे। आईपीएससी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से नियंत्रण, स्वस्थ व्यक्ति23 से उत्पन्न होते हैं।

1. संस्कृति मीडिया की तैयारी

  1. मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) संस्कृति मीडिया तैयार करें
    1. पेनिसिलिन की 100 इकाइयों / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 यूजी / एमएल को पूरक करके मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखने और विस्तारित करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माध्यम से एचपीएससी संस्कृति मीडिया तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एलिकोट करें और लंबे समय तक -20 डिग्री सेल्सियस या तत्काल उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण मीडिया स्टोर करें।
  2. स्टेज 1 भेदभाव मीडिया तैयार करें (निश्चित एंडोडर्म (डीई) के लिए)।
    1. फैटी एसिड मुक्त बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (एफएफए-बीएसए), सोडियम बाइकार्बोनेट (एनएएचसीओ 3) के 1.5 ग्राम / एल, ग्लूकोज के 10 एमएम, पेनिसिलिन के 100 यूनिट / एमएल, और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / mL के साथ पूरक करके एमसीडीबी131 मीडिया से बेसल मीडिया तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। तैयार मीडिया को 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें और 4 °C पर स्टोर करें।
    2. बेसल मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके बेसल मीडिया (चरण 1.2.1 में तैयार) से चिर99021 युक्त चरण 1 मीडिया तैयार करें और फिर सीएचआईआर 99021 के 2 μM, एक्टिविन A के 100 ng / mL, रॉक अवरोधक (Y-27632) के 10 μM और विटामिन C के 0.25 mM के साथ पूरक करें ( सामग्री की तालिका देखें)। पूरक मीडिया को अच्छी तरह से मिलाएं और इसे प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।
      नोट: इस मीडिया का उपयोग केवल भेदभाव के पहले दिन किया जाएगा।
    3. बेसल मीडिया से CHIR99021 के बिना स्टेज 1 मीडिया तैयार करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके और इसे एक्टिविन ए के 100 एनजी / एमएल और विटामिन सी के 0.25 एमएम के साथ पूरक करें और अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: मूल FGF या FGF2 के 5 ng / mL को वैकल्पिक रूप से इस मीडिया में जोड़ा जा सकता है। इस मीडिया का उपयोग चरण 1 के शेष दिनों के लिए किया जाएगा।
  3. स्टेज 2 भेदभाव मीडिया तैयार करें (आदिम आंत ट्यूब के लिए; पीजीटी)।
    1. स्टेज 2 विभेदन मीडिया तैयार करें जिसमें बेसल मीडिया से रॉक अवरोधक होता है, जिसे 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके और एफजीएफ 10 के 50 एनजी / एमएल, एनओजीजीआईएन के 50 एनजी / एमएल, सीएचआईआर 99021 के 0.25 μM, वाई -27632 (रॉक अवरोधक) के 10 μM और विटामिन सी के 0.25 mM के साथ पूरक किया जाता है।
      नोट: इस मीडिया का उपयोग एंडोडर्मल कोशिकाओं के पृथक्करण के दिन किया जाता है।
    2. रॉक अवरोधक को छोड़कर चरण 1.3.1 में तैयार मीडिया के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करते हुए रॉक अवरोधक के बिना चरण 2 भेदभाव मीडिया तैयार करें।
      नोट: इस मीडिया का उपयोग चरण 2 के दूसरे दिन किया जाता है।
  4. स्टेज 3 भेदभाव मीडिया तैयार करें (पश्चवर्ती फोरगट के लिए)।
    1. 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज युक्त डीएमईएम मीडिया तैयार करें, फिर पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 1% और ग्लूटामैक्स के 2 एमएम के साथ पूरक करें और चरण 3 और 4 के लिए बेसल मीडिया के रूप में उपयोग करें।
    2. डीएमईएम मीडिया को गर्म करें (चरण 1.4.1 में तैयार) और रेटिनोइक एसिड के 2 μM, SANT-1 के 0.25 μM, FGF10 के 50 ng/mL, NOGGIN के 50 ng/mL, विटामिन C के 0.25 mM, और विटामिन A के बिना 1% B27 पूरक के साथ पूरक करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: इस मीडिया का उपयोग पी 2-डी (प्रोटोकॉल 2, अनुकूलित, अलग) के लिए स्टेज 3 के 4 दिनों और पी 1-एनडी (प्रोटोकॉल 1, गैर-अनुकूलित, गैर-अलग) के लिए स्टेज 3 के 2 दिनों के लिए किया जाता है।
  5. स्टेज 4 भेदभाव मीडिया तैयार करें (अग्नाशयी पूर्वजों के लिए)।
    1. 100 एनजी /एमएल ईजीएफ के साथ 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज, निकोटिनामाइड के 10 एमएम, एनओजीजीआईएन के 50 एनजी / एमएल, विटामिन सी के 0.25 एमएम, और विटामिन ए के बिना बी 27 पूरक का 1% युक्त डीएमईएम जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। चरण 4 के सभी दिनों के लिए इस मीडिया का उपयोग करें।
      नोट: उचित तापमान पर सभी अभिकर्मकों को बनाए रखें, और सभी साइटोकिन और संवेदनशील अभिकर्मकों को अलग करने की आवश्यकता होती है। विभेदन मीडिया को बदलने के समय एलिकोटेड अभिकर्मकों को पिघलाएं और बेसल मीडिया में जोड़ें। विभिन्न विभेदन मीडिया की रचनाएँ तालिका 1 में प्रदान की गई हैं।

2. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित व्यंजन तैयार करना

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बेसमेंट मैट्रिक्स ( सामग्री की तालिका देखें) और बर्फ पर एलिकोट पिघलना; -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट फ्रीज करें।
  2. टिशू कल्चर व्यंजनों को लेपित करने से पहले, बर्फ पर जमे हुए एलिकोट को पिघलाएं। वांछित पतला एकाग्रता प्राप्त करने और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ठंडा केओ-डीएमईएम / एफ -12 मीडिया (नॉकआउट डीएमईएम / एफ -12) ( सामग्री की तालिका देखें) में झिल्ली मैट्रिक्स समाधान की उचित मात्रा जोड़ें। तत्काल उपयोग के लिए पतला मैट्रिक्स समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेटों की सतह को पतला झिल्ली मैट्रिक्स समाधान के साथ कवर करें ( सामग्री की तालिका देखें) और कोशिकाओं को चढ़ाने से पहले प्लेटों को कम से कम 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। अग्नाशय विभेदन प्रयोग के लिए प्लेटिंग कोशिकाओं के लिए केओ-डीएमईएम / एफ -12 में झिल्ली मैट्रिक्स समाधान के 1: 50 और अविभाजित एचपीएससी के विस्तार के लिए 1: 80 के कमजोर पड़ने का उपयोग करें।

3. अविभाजित एचपीएससी की संस्कृति

  1. जब कॉलोनियां 70% -80% तक पहुंच जाती हैं, तो एचपीएससी को पारित करें।
  2. मार्ग के लिए, एचपीएससी को गर्म पीबीएस के साथ एक बार धो लें, ऊतक संस्कृति हुड के अंदर एक पोर्टेबल वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके एस्पिरेटेड करें, और कॉलोनी की सतह को कवर करने के लिए पीबीएस में 0.5 एमएम ईडीटीए समाधान जोड़ें। 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें या जब तक कॉलोनियों की सीमाएं प्लेट की सतह से अलग न हो जाएं।
  3. ईडीटीए समाधान को हटा दें और पी 1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एचपीएससी संस्कृति माध्यम के साथ डिटेचिंग कॉलोनियों को इकट्ठा करें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 128 x g पर एकत्रित कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें और एचपीएससी कल्चर मीडिया के साथ कोशिकाओं को पूरक करें जिसमें वाई -27632 (रॉक इनहिबिटर) 23,24 का 10 μM होता है।
    नोट: 1: 80 झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित व्यंजनों पर कम से कम 1: 3 अनुपात में एचपीएससी को पारित करें। हालांकि, भेदभाव प्रयोगों के लिए, 1:50 लेपित व्यंजनों पर एचपीएससी को प्लेट करें।

4. एचपीएससी में निश्चित एंडोडर्म (डीई) भेदभाव का प्रेरण (चरण 1)

  1. जब एचपीएससी कॉलोनियां 70% -80% की स्थिरता तक पहुंच जाती हैं, तो चरण 1 भेदभाव शुरू करने के लिए ऊतक संस्कृति हुड के अंदर एक पोर्टेबल वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके उन्हें गर्म पीबीएस और एस्पिरेट के साथ दो बार धोएं।
  2. कालोनियों में 2 एमएल प्रति 6-वेल प्लेट में सीएचआईआर 99021 (चरण 1.2.2 से) युक्त चरण 1 भेदभाव माध्यम जोड़ें, और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. अगले दिन, खर्च किए गए मीडिया को CHIR99021 (चरण 1.2.3) के बिना चरण 1 भेदभाव माध्यम के साथ बदलें।
  4. हर 24 घंटे में, टिशू कल्चर हुड के अंदर एक पोर्टेबल वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके खर्च किए गए मीडिया को एस्पिरेट करें और इसे CHIR99021 के बिना एक नए स्टेज 1 भेदभाव माध्यम के साथ बदलें।
    नोट: चरण 1 को 4 दिनों तक बढ़ाया जा सकता है। स्टेज 1 की लंबाई एचपीएससी लाइन का उपयोग करने पर निर्भर है और तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।

5. एचपीएससी-व्युत्पन्न डीई का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण (चरण 1)

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, कुओं से ऊतक संवर्धन हुड के अंदर एक पोर्टेबल वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके खर्च किए गए मीडिया को एस्पिरेट करें और गर्म पीबीएस के साथ दो बार धोएं। किसी भी सेल मलबे से छुटकारा पाने के लिए प्लेट को घुमाएं।
  2. डीई कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ कुओं की सतह को कवर करें; उदाहरण के लिए, 24-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 250 यूएल पीएफए जोड़ें। प्लेट को 20 मिनट के लिए 20 x g पर 2D शेकर पर रखें।
  3. निर्धारण के बाद, डीई कोशिकाओं को ट्राइस-बफर्ड खारा के साथ 0.5% ट्वीन (टीबीएसटी) के साथ धोएं ( सामग्री की तालिका देखें) और प्लेट को 10 मिनट के लिए 20 x ग्राम पर शेकर पर रखें। इस चरण को एक बार फिर दोहराएं।
  4. ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएसटी) के 0.5% के साथ फॉस्फेट-बफर्ड खारा की उदार मात्रा जोड़कर निश्चित कोशिकाओं को स्थिर करें; उदाहरण के लिए, 24-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 1 एमएल पीबीएसटी जोड़ें और प्लेट को 20 मिनट के लिए 20 x g पर शेकर पर वापस रखें।
  5. बफर को अवरुद्ध करने के रूप में पीबीएसटी में बीएसए के 5% -6% को ताजा तैयार करें और इसे परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं में जोड़ें। शेकर पर ब्लॉकिंग समाधान में कम से कम 1 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  6. PBST समाधान में 2% -3% बीएसए में SOX17 और FOXA2 के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी को एक साथ पतला करें ( सामग्री की तालिका देखें)। अवरुद्ध कोशिकाओं में संयुक्त एंटीबॉडी जोड़ें और प्लेट को सौम्य झटकों के साथ कम गति से रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर शेकर पर रखें।
    नोट: SOX17 और FOXA2 अच्छी तरह से स्थापित DE मार्कर25,26 हैं।
  7. अगले दिन, पोर्टेबल वैक्यूम फिल्टर का उपयोग करके प्राथमिक एंटीबॉडी को एस्पिरेट करें और टीबीएसटी के साथ कुओं को तीन बार धोएं, प्रत्येक शेकर पर 10 मिनट के लिए धोएं।
  8. एलेक्सा फ्लोर 488- और 568- संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) के 1:500 कमजोर पड़ने की तैयारी करें, उन प्रजातियों के खिलाफ जिनमें प्राथमिक एंटीबॉडी उठाए गए थे।
  9. दाग वाले कुएं में द्वितीयक एंटीबॉडी संयोजन जोड़ें और प्रकाश से बचाने के लिए प्लेट को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें। प्लेट को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए शेकर पर रखें।
  10. पोर्टेबल वैक्यूम फिल्टर का उपयोग करके द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें और प्लेट को पन्नी से कवर करते हुए, शेकर पर टीबीएसटी के साथ दाग वाले कुओं को 10 मिनट के लिए धोएं। वॉश स्टेप को कुल तीन बार दोहराएं।
  11. नाभिक को दागने के लिए पीबीएस में होचस्ट 33342 तनुकरण का 1 μg / mL तैयार करें। कुओं में होचस्ट घोल जोड़ें और प्लेट को शेकर पर 2-3 मिनट के लिए रखें।
  12. पोर्टेबल वैक्यूम फिल्टर का उपयोग करके होचस्ट समाधान को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ कुओं को दो बार कुल्ला करें।
  13. अंत में, दाग वाली कोशिकाओं में पीबीएस जोड़ें और अंधेरे में उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके उन्हें छवि दें। फ्लोरोफोरे ब्लीचिंग को कम करने के लिए इमेजिंग न करते समय प्लेट को पन्नी से ढककर रखें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, प्रवाह-साइटोमेट्री का उपयोग चरण 9.2 में वर्णित डीई दक्षता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

6. एचपीएससी से आदिम आंत ट्यूब (पीजीटी) का उत्पादन (चरण 2)

नोट: यदि चरण 5.13 में इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण 80% और उससे अधिक की एसओएक्स 17-फॉक्सए 2 सह-अभिव्यक्ति के रूप में निर्धारित किया जाता है, तो प्रयोग चरण 2 में आगे बढ़ता है। यदि दक्षता <80% है, तो चरण 1 की अवधि को 4 दिनों तक बढ़ाएं।

  1. चरण 2 के दिन 1 पर, अनुकूलित पी 2-डी प्रोटोकॉल के लिए ट्रिपले या एक्यूटेस ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एचपीएससी-व्युत्पन्न एंडोडर्मल कोशिकाओं को अलग करें। गर्म पीबीएस के साथ अनुयायी कोशिकाओं को धोएं और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 3-5 मिनट के लिए 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में गर्म 1 एमएल ट्रिपले या एक्यूटेज घोल जोड़ें, या जब तक कोशिकाएं एक दूसरे से अलग होना शुरू न हों।
  2. कुओं में कोशिकाओं की अलग चादरों या मोनोलेयर को अलग करें और फिर उन्हें बेसल स्टेज 1/2 मीडिया का उपयोग करके 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में एक साथ इकट्ठा करें, जिसमें भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) या नॉकआउट सीरम (केओएसआर) का कम से कम 0.5% होता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. कोशिकाओं को 800 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। बाँझ पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और गोली को एकल कोशिकाओं में पुन: निलंबित करें।
  4. कक्ष स्लाइड में कोशिकाओं की अनुशंसित मात्रा लोड करके एक स्वचालित काउंटर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। पुन: निलंबित कोशिकाओं को 800 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  5. 2.5-3.5 x10 5 कोशिकाओं /सेमी 2 के घनत्व पर रॉक अवरोधक युक्त चरण2 विभेदन माध्यम की उचित मात्रा में गोली को पुन: निलंबित करें।
    नोट: यह गिनती प्रसार दर पर निर्भर अधिकांश सेल लाइनों के लिए 1: 2 विभाजन अनुपात तक नीचे आ सकती है। कुल मात्रा 6-वेल प्लेट के 1 कुएं में पुन: निलंबित कोशिकाओं के साथ मीडिया का 2 एमएल होगा।
  6. पुन: निलंबित कोशिकाओं को 1:50 झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों (चरण 2 में तैयार) पर प्लेट करें और उन्हें इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  7. 24 घंटे बाद, मीडिया को रॉक अवरोधक के बिना स्टेज 2 भेदभाव माध्यम के साथ बदलें (चरण 1.3.2 में तैयार)।

7. एचपीएससी से पश्चवर्ती अग्रभाग का उत्पादन (चरण 3)

  1. टिशू कल्चर हुड के अंदर एक पोर्टेबल वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके बिताए गए स्टेज 2 मीडिया को एस्पिरेट करें और गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  2. चरण 1.4 से कोशिकाओं में चरण 3 भेदभाव मीडिया जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  3. 24 घंटे के बाद, खर्च किए गए मीडिया को ताजा तैयार स्टेज 3 भेदभाव मीडिया के साथ बदलें। पी 2-डी प्रोटोकॉल (अनुकूलित) के लिए कुल 4 दिनों के लिए इसे दोहराएं और गैर-विघटित पी 1-एनडी के लिए केवल 2 दिन।

8. एचपीएससी से अग्नाशयी पूर्वजों की पीढ़ी (चरण 4)

  1. स्टेज 3 उपचार के 4 दिनों के बाद, कोशिकाओं को गर्म पीबीएस के साथ धोएं, धीरे से प्लेट को घुमाएं, और पोर्टेबल वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके एस्पिरेटेड करें। फिर, चरण 1.5 से कोशिकाओं में चरण 4 भेदभाव मीडिया जोड़ें।
  2. 24 घंटे के बाद, खर्च किए गए मीडिया को ताजा तैयार स्टेज 4 मीडिया के साथ बदलें। इसे कुल 4 दिनों तक दोहराएं।

9. एचपीएससी से अग्नाशयी पूर्वजों को उत्पन्न करने की विभेदन दक्षता का आकलन

  1. पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 की अभिव्यक्ति के लिए एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशय पूर्वजों (चरण 4) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण करें।
    नोट: पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 अच्छी तरह से स्थापित अग्नाशय पूर्वज मार्कर17,18 हैं।
    1. चरण 5 के अनुसार निर्धारण, परमेबिलाइजेशन, ब्लॉकिंग और एंटीबॉडी इनक्यूबेशन और धोने का प्रदर्शन करें।
    2. पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) के संयोजन के साथ एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशय पूर्वजों को पीबीएसटी में 2% -3% बीएसए में पतला दाग दें।
    3. उपयुक्त एलेक्सा फ्लोर 488- और 568- संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के 1: 500 कमजोर पड़ने का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 की अभिव्यक्ति के लिए एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों का प्रवाह-साइटोमेट्री विश्लेषण करें।
    नोट: उत्पन्न एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों में अग्नाशय मार्करों का फ्लो-साइटोमेट्री विश्लेषण पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 सह-व्यक्त कोशिकाओं को निर्धारित करने का एक तरीका प्रदान करता है।
    1. चरण 4 के अंत में, कोशिकाओं को गर्म पीबीएस के साथ दो बार धोएं और कुओं की सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त ट्रिपले या एक्यूटेस जोड़ें, उदाहरण के लिए, 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 1 एमएल ट्रिपले या एक्यूटेस। प्लेट को इनक्यूबेटर में 5-7 मिनट के लिए रखें या जब तक कोशिकाएं सतह से अलग न हो जाएं।
    2. 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में एकत्र करने से पहले पी 1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके कुएं के भीतर कोशिकाओं की अनुयायी चादरों को अलग करें।
    3. एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों में कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x g पर घुमाएं, फिर सुपरनैटेंट को छोड़ दें। कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में अलग करके पीबीएस के साथ धोएं। एक स्वचालित काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें) और प्रति एमएल कोशिकाओं की संख्या में एकाग्रता को नोट करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x g पर घुमाएं, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। पेलेट में 200 μL ठंडा पीबीएस जोड़ें और अलग हो जाएं।
    5. कम-मध्यम गति (कमरे के तापमान पर 400 x ग्राम ) पर भंवर पर ट्यूब के साथ 2 एमएल ठंडा 80% इथेनॉल ड्रॉपवाइज जोड़ें। कैप्स को कसकर बंद करें और ट्यूबों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर शेकर पर थोड़ा झुकाएं।
    6. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x g पर घुमाएं, और निश्चित कोशिकाओं के किसी भी झुरमुट को अलग करने के लिए पीबीएस के साथ धो लें।
    7. कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए पीबीएसटी में 5% -6% बीएसए समाधान के साथ निश्चित कोशिकाओं को ब्लॉक करें या शेकर पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस।
    8. नीचे दिए गए चरणों के बाद अग्नाशयी पूर्वज मार्करों के लिए दाग।
      1. प्रति स्थिति 2,00,000 कोशिकाओं को वितरित करें, जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों के आईजीजी उपवर्ग पर निर्भर उचित आइसोटाइप नियंत्रण शामिल हैं, 96-वेल वी बॉटम प्लेट या 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बिना दाग वाले और द्वितीयक एंटीबॉडी नियंत्रण।
      2. प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x g पर घुमाएं और छर्रों को खोए बिना सतह पर तैरने वाले को छोड़ने के लिए प्लेट को तेज गति से पलटें। 3% बीएसए समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की तैयारी करें (सामग्री की तालिका देखें)।
        नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता 1: 50 से 1: 200 के बीच हो सकती है।
      3. दाग वाली कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर कम से कम 2 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कम गति से कोमल झटकों के साथ एक शेकर पर इनक्यूबेट करें।
      4. दाग वाली कोशिकाओं को टीबीएसटी से तीन बार धोएं और कुओं में कोशिकाओं को ऊपर और नीचे करके धोएं। चरण 9.2.8.2 में सुपरनैटेंट को स्पिन करें और छोड़ दें।
      5. पीबीएस में तैयार द्वितीयक एंटीबॉडी (एलेक्सा फ्लोर 488- और 647-संयुग्मित एंटीबॉडी) के 1:500 कमजोर पड़ने जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      6. दाग वाली कोशिकाओं को टीबीएसटी के साथ कम से कम दो बार धोएं और कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पाइप करके। प्लेट को स्पिन करें और चरण 9.2.8.2 में सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
      7. पीबीएस के कम से कम 100 μL में दाग वाली कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें प्रकाश-संरक्षित FACS ट्यूबों में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक प्रवाह-साइटोमेट्री मशीन पर नमूने चलाएँ।

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Representative Results

परिणाम बताते हैं कि अनुकूलित प्रोटोकॉल पी 2-डी (आंकड़े 1 ए) ने पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 सह-अभिव्यक्ति (चित्रा 2 ए, बी और चित्रा 3 ए) को विनियमित करके अग्नाशयी पूर्वज भेदभाव दक्षता को बढ़ाया। विशेष रूप से, परिणामों से पता चला है कि एंडोडर्मल कोशिकाओं के पृथक्करण और स्टेज 3 की लंबी अवधि के साथ-साथ ताजा झिल्ली मैट्रिक्स पर उनके रिप्लेटिंग ने एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों (अनुकूलित प्रोटोकॉल, पी 2-डी) (चित्रा 2 और चित्रा 3 ए) में एनकेएक्स 6.1 अभिव्यक्ति को बढ़ाया, गैर-अलग प्रोटोकॉल (पी 1-एनडी) की तुलना में, जिसे पहले प्रकाशित अध्ययन27 से संशोधित किया गया था। . वर्तमान संवर्धित प्रोटोकॉल ने "पी 1-डी" (प्रोटोकॉल 1, एस 3 = 2 दिन, अलग) और "पी 2-एनडी" (प्रोटोकॉल 2, एस 3 = 4 दिन, गैर-अलग) की तुलना में पीडीएक्स 1 + / एनकेएक्स6.1 + पूर्वजों का उच्चतम अनुपात भी उत्पन्न किया, और विस्तृत परिणाम पहले प्रकाशित किए गए हैं। पी 2-डी का उपयोग करके उत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों में गैर-विघटित पी 1-एनडी (चित्रा 3 बी) की तुलना में एसओएक्स 9 + कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई है। अनुकूलित विधि ने प्रोलिफेरेटिव एनकेएक्स 6.1 + कोशिकाओं का एक उच्च अनुपात भी उत्पन्न किया जो प्रसार मार्कर Ki67 (चित्रा 3 सी) को सह-व्यक्त करते हैं।

यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम नियंत्रण, स्वस्थ व्यक्ति के परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से उत्पन्न आईपीएससी से हैं। हालांकि, हमने कई एचपीएससी लाइनों जैसे एच 1-एचईएससी, एच 9-एचईएससी, एचयूईएस 8-एचईएससी, और कई अन्य नियंत्रण आईपीएससी लाइनों पर वर्तमान उन्नत प्रोटोकॉल को लागू किया है ताकि ~ 90% पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 अग्नाशयीपूर्वजों को सह-व्यक्त किया जा सके।

एचपीएससी में डीई प्रेरण के बाद, कोशिका मृत्यु के हल्के स्तर की उम्मीद है। हालांकि, अगर एक उच्च कोशिका मृत्यु दर देखी गई थी, तो प्रयोग को रोक दिया गया था और कोशिकाओं के एक नए बैच के साथ फिर से शुरू किया गया था। डीई प्रेरण की दक्षता संस्कृति में डीई कोशिकाओं के उच्च अनुपात को सुनिश्चित करने के लिए 70% -80% से अधिक होनी चाहिए जो अग्नाशयी पूर्वज प्रेरण (चित्रा 1 सी) के लिए एक आदर्श प्रारंभिक स्रोत के रूप में काम करेगी।

पृथक्करण के बाद एंडोडर्मल कोशिकाओं के घनत्व को उस विशेष सेल की वृद्धि दर के आधार पर हेरफेर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, धीमी गति से बढ़ने वाली कोशिकाओं को अनुशंसित से अधिक घनत्व पर पुन: स्थापित किया जा सकता है। यह चरण 4 में अप्रासंगिक अग्नाशयी आबादी प्राप्त करने की संभावना को कम करेगा। पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 की एक उच्च सह-अभिव्यक्ति चरण 1 के बाद पृथक्करण और आधे घनत्व (चित्रा 1 ए, चित्रा 2 ए, बी, और चित्रा 3 ए) पर पुनरावृत्ति के बाद प्राप्त की जा सकती है। यदि पीडीएक्स 1 की उच्च अभिव्यक्ति देखी जाती है, लेकिन एनकेएक्स 6.1 की केवल एक मध्यम अभिव्यक्ति देखी जाती है, तो पीडीएक्स 1-व्यक्त कोशिकाओं में एनकेएक्स 6.1 अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए चरण 4 को 2 दिनों तक बढ़ाया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: अग्नाशय ी पूर्वज विभेदन के दौरान साइटोकिन्स और विकास कारकों को जोड़ने के लिए समयरेखा। (ए) एचपीएससी से पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 के उत्पादन के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल (पी 1-डी) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एचपीएससी-व्युत्पन्न निश्चित एंडोडर्म (डीई) को आधे घनत्व पर अलग और पुन: पेश किया जाता है और फिर क्रमिक रूप से अग्नाशयी पूर्वज भाग्य की ओर निर्देशित किया जाता है। (बी) दिन 0 पर भेदभाव शुरू करने से पहले उज्ज्वल क्षेत्र में एचपीएससी की छवियां। (सी) एचपीएससी-व्युत्पन्न एंडोडर्म (चरण 1) कोशिकाओं में एंडोडर्मल मार्कर एसओएक्स 17 और फॉक्सए 2 की अभिव्यक्ति के लिए इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण। एसओएक्स 17, हरा; FOXA2, लाल। स्केल पट्टियाँ = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों की पीढ़ी, पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 को सह-व्यक्त करना। उन्नत प्रोटोकॉल (पी 2-डी) (ए) और एक गैर-अनुकूलित, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल (पी 1-एनडी) (बी) का उपयोग करके एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 अभिव्यक्ति की तुलना के लिए इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण। उन्नत प्रोटोकॉल ने पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 की उच्चतम सह-अभिव्यक्ति हासिल की। पीडीएक्स 1, हरा; एनकेएक्स 6.1, लाल। प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए दूसरे पैनल में आवर्धित छवियां प्रदान की जाती हैं। स्केल पट्टियाँ = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बढ़े हुए प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों में अग्नाशय मार्करों का परिमाणीकरण। एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों में फ्लो-साइटोमेट्री विश्लेषण ने गैर-विघटित पी 1-एनडी की तुलना में पी 2-डी का उपयोग करके उत्पादन किया। (ए) पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 अभिव्यक्ति और डबल-पॉजिटिव धुंधला ग्राफ के लिए हिस्टोग्राम। (बी) एसओएक्स 9 अभिव्यक्ति के लिए हिस्टोग्राम और (सी) प्रसार मार्कर Ki67 के साथ एनकेएक्स 6.1 की सह-अभिव्यक्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मंच मीडिया साइटोकिन्स दिन
1 एमसीडीबी 131 मीडिया + 0.5% फैटी एसिड मुक्त गोजातीय सीरम एल्बुमिन (एफएफए-बीएसए), 1.5 ग्राम / एल सोडियम बाइकार्बोनेट (एनएएचसीओ3), ग्लूकोज का 10 एमएम दिन 1: 2 μM CHIR99021, 100 ng / mL Activin A, 10 μM रॉक इनहिबिटर (Y-27632), 0.25 mM विटामिन C. दिन 2 से: 100 ng/ mL Activin A, 0.25 mM विटामिन C 3 या 4
2 एमसीडीबी 131 मीडिया + 0.5% फैटी एसिड मुक्त गोजातीय सीरम एल्बुमिन (एफएफए-बीएसए), 1.5 ग्राम / एल सोडियम बाइकार्बोनेट (एनएएचसीओ3), 10 एमएम ग्लूकोज दिन 1 (पृथक्करण): 50 एनजी / एमएल एफजीएफ 10, 50 एनजी / एमएल एनओजीगिन, 0.25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (रॉक अवरोधक), 0.25 mM विटामिन C. दिन 2: 50 ng / mL FGF10, 50 ng / mL NOGGIN, 0.25 μM CHIR99021, 0.25 mM विटामिन C। 2
3 DMEM + 4.5 ग्राम / 2 μM रेटिनोइक एसिड, 0.25 μM SANT-1, 50 ng / mL FGF10, 50 ng / mL NOGGIN, 0.25 mM विटामिन C, विटामिन A के बिना 1% B27 पूरक 4
4 DMEM + 4.5 ग्राम / 100 एनजी / एमएल ईजीएफ, 10 एमएम निकोटिनामाइड, 50 एनजी / एमएल एनओजीजीआईएन, 0.25 एमएम विटामिन सी, विटामिन ए के बिना 1% बी 27 पूरक। 4

तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न भेदभाव मीडिया की रचनाएं।

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Discussion

यह काम पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 की उच्च सह-अभिव्यक्ति के साथ एचपीएससी से अग्नाशयी पूर्वजों को उत्पन्न करने के लिए एक उन्नत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। ताजा मैट्रिक्स पर आधे घनत्व पर एचपीएससी-व्युत्पन्न एंडोडर्म के पृथक्करण और पुनरावृत्ति के परिणामस्वरूप एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशय पूर्वजों में उच्च पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 हुआ।

यद्यपि प्रत्येक चरण के लिए विकास कारक कॉकटेल पी 1-एनडी27 के समान है, यह दिखाया गया है कि एफजीएफ और रेटिनोइड सिग्नलिंग और बीएमपी और हेजहोग निषेध सहित अधिक विस्तारित चरण 3 उपचार एनकेएक्स 6.1 अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जो नोस्ट्रो एट अल केनिष्कर्षों 27 के विपरीत है। जबकि भ्रूण के विकास के दौरान अग्न्याशय में पीडीएक्स 1 अभिव्यक्ति को एफजीएफ और रेटिनोइड सिग्नलिंग और बीएमपी और हेजहोग निषेध 27,29,30 द्वारा सकारात्मक रूप से विनियमित किया जाता है, वर्तमान परिणामों ने इस सिग्नलिंग कॉकटेल के विस्तार को भी एनकेएक्स 6.1 को नियंत्रित किया है। फिर भी, एक विस्तारित चरण 3 उपचार के प्रभाव को एंडोडर्मल कोशिकाओं के पृथक्करण और पुनरावृत्ति द्वारा सहायता मिली, जिससे पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई। इसके अलावा, इस विधि (पी 2-डी) ने प्रसार मार्कर Ki67 को सह-व्यक्त करने वाले प्रोलिफेरेटिव एनकेएक्स 6.1 + कोशिकाओं के अनुपात के अलावा, एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों में एसओएक्स 9-व्यक्त कोशिकाओं में भी वृद्धि की।

भेदभाव की दक्षता को प्रभावित करने वाला एक और महत्वपूर्ण कारक विघटित कोशिकाओं के लिए ताजा झिल्ली मैट्रिक्स की उपलब्धता थी। बाह्य मैट्रिक्स घटकों को पहले स्टेम सेल भाग्य विनिर्देश31,32 को विनियमित करने के लिए प्रदर्शित किया गया है। कुल मिलाकर, अग्नाशय के विकास पर बाह्य मैट्रिक्स घटकों के अनुकूल प्रभाव 33,34,35 दर्ज किए गए हैं, विशेष रूप से झिल्ली मैट्रिक्स के लिए, जो लैमिनिन के साथ,अग्नाशयी वंश कोशिकाओं पर एक समर्थक अंतःस्रावी प्रभाव दिखाया गया था। इसलिए, ताजा झिल्ली मैट्रिक्स पर एंडोडर्मल कोशिकाओं को पुन: प्रस्तुत करने से एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों में एनकेएक्स 6.1 अभिव्यक्ति बढ़ सकती है।

विभेदित कोशिकाओं का कोशिका घनत्व भी जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। कई अध्ययनों ने अग्नाशय के विकास को विनियमित करने में सेल-सेल संपर्क के महत्व का प्रदर्शनकिया है 37,38,39. सेलुलर एकत्रीकरण या भ्रूण शरीर के गठन को 2 डी संस्कृतियों की तुलना में उच्च अग्नाशयी अंतःस्रावी जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए दिखाया गयाहै। हालांकि, परिणाम बताते हैं कि उच्च अग्नाशयी अभिव्यक्ति, विशेष रूप से एनकेएक्स 6.1, हमारे अनुकूलितप्रोटोकॉल 21 का उपयोग करके एंडोडर्मल घनत्व के आधे पर 2 डी मोनोलेयर में कोशिकाओं की खेती करके प्राप्त की जा सकती है। दिलचस्प बात यह है कि इस विधि ने यकृत कोशिका भाग्य (एचपीएससी-व्युत्पन्न डीई का वैकल्पिक भाग्य) को भी रोक दिया, जैसा कि यकृत जीन एएफपी (अल्फा-फेटोप्रोटीन) और एएलबी (एल्बुमिन) 21 की कम अभिव्यक्ति द्वारा देखा गया है, यह दर्शाता है कि भौतिक कारक एचपीएससी के वंश विनिर्देश में भूमिका निभाते हैं।

कुल मिलाकर, परिणाम दर्शाते हैं कि विभेदक कोशिकाओं के भौतिक वातावरण को संशोधित करने से अग्नाशय जीन अभिव्यक्ति21 को बढ़ाया जा सकता है। विशेष रूप से, एचपीएससी-व्युत्पन्न एंडोडर्म का पृथक्करण और लंबे एफजीएफ और रेटिनोइड सिग्नलिंग और हेजहोग और बीएमपी निषेध के साथ ताजा झिल्ली मैट्रिक्स पर रिप्लेटिंग एचपीएससी-व्युत्पन्न अग्नाशयी पूर्वजों में पीडीएक्स 1 और एनकेएक्स 6.1 सह-अभिव्यक्ति को बढ़ा सकती है। हालांकि, अनुकूलित प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में कम से कम 2 दिन लंबा है। इसके अलावा, स्टेज 4 की लंबाई को न्यूनतम अनुशंसित से परे बढ़ाया जा सकता है, यानी, उपयोग की जा रही सेल लाइन के आधार पर 4 दिन। अनुकूलित प्रोटोकॉल में कई पुनः संयोजक मानव विकास कारकों को नियोजित किया जाता है जिन्हें उनके कम खर्चीले, छोटे अणु यौगिकों द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है जो एक ही क्रिया करते हैं। फिर भी, यह अनुकूलित प्रोटोकॉल सेल थेरेपी और रोग मॉडलिंग के लिए एचपीएससी से अग्नाशयी पूर्वजों की स्केलेबल पीढ़ी की सुविधा प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को कतर नेशनल रिसर्च फंड (क्यूएनआरएफ) (अनुदान संख्या 2011) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एनपीआरपी 10-1221-160041)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL, conical, centrifuge tubes Thermo Scientific 339651
20X TBS Tween 20 Thermo Scientific 28360
24-well culture plates, flat bottom with lid Costar 3524
50 mL, conical, centrifuge tubes Thermo Scientific 339652
6- well culture plates, multidish Thermo Scientific 140685
Accutase Stem Cell Technologies 0-7920
Activin A R&D 338-AC Reconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal DSHB F55A12-C Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal Abcam ab47308 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit A ThermoFisher 12587010
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free Sigma A7030
CHIR 99021 Tocris 4423 Reconstituted in DMSO
DMEM, high glucose ThermoFisher 41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Invitrogen A10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 A-21206
DPBS 1X ThermoFisher 14190144
EGF ThermoFisher PHG0313 Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10 R&D 345-FG Reconstituted in PBS
Glucose Sigma Aldrich G8644
Hoechst 33258 Sigma 23491-45-4
Inverted microscope Olympus IX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X) Gibco 12660-012
KnockOut SR serum replacement Gibco 10828-028
L-Ascorbic acid (vitamin C) Sigma A92902 Reconstituted in distilled water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 354230 Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131 ThermoFisher 10372019
Mouse anti-SOX17 ORIGENE CF500096 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 85850 Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PES ThermoFisher 566-0020
Nicotinamide Sigma 72340 Reconstituted in distilled water
NOGGIN R&D 6057-NG Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz sc-281692
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140122
Portable vacuum aspirator
Rabbit anti-FOXA2 Cell signaling technology 3143 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic Acid Sigma Aldrich R2625 Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632) ReproCell 04-0012-02 Reconstituted in DMSO
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE Stellar Scientific FSC-9010
SANT-1 Sigma Aldrich S4572 Reconstituted in DMSO
Sodium bicarbonate Sigma S5761-500G
StemFlex ThermoFisher A3349401 Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis Slide Invitrogen T10794
Tali image-based cytometer automated cell counter Invitrogen T10796
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
TrypLE 100 mL ThermoFisher 12563011
Tween 20 Sigma P2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575-038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 178
2 डी कल्चर सिस्टम में अग्नाशयी बीटा-सेल अग्रदूतों में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का भेदभाव
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Memon, B., Abdelalim, E. M.… More

Memon, B., Abdelalim, E. M. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System. J. Vis. Exp. (178), e63298, doi:10.3791/63298 (2021).

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