Summary
Denne protokollen beskriver en forbedret metode for å øke kouttrykket av PDX1- og NKX6.1-transkripsjonsfaktorer i pankreasprogenitorer avledet fra humane pluripotente stamceller (hPSCer) i plane monolag. Dette oppnås ved å fylle opp den friske matrisen, manipulere celletettheten og dissosiere de endodermale cellene.
Abstract
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) er et utmerket verktøy for å studere tidlig bukspyttkjertelutvikling og undersøke de genetiske bidragsyterne til diabetes. hPSC-avledede insulinutskillende celler kan genereres for celleterapi og sykdomsmodellering, men med begrenset effektivitet og funksjonelle egenskaper. hPSC-avledede pankreasprogenitorer som er forløpere til betaceller og andre endokrine celler, når de uttrykker de to transkripsjonsfaktorene PDX1 og NKX6.1, spesifiserer forfedrene til funksjonelle, insulinutskillende betaceller både in vitro og in vivo. hPSC-avledede pankreasprogenitorer brukes for tiden til celleterapi hos type 1 diabetespasienter som en del av kliniske studier. Nåværende prosedyrer genererer imidlertid ikke en høy andel av NKX6.1 og pankreasprogenitorer, noe som fører til samtidig generering av ikke-funksjonelle endokrine celler og få glukoseresponsive, insulinutskillende celler. Dette arbeidet utviklet dermed en forbedret protokoll for generering av hPSC-avledede pankreasprogenitorer som maksimerer samuttrykket av PDX1 og NKX6.1 i et 2D-monolag. Faktorene som celletetthet, tilgjengelighet av fersk matriks og dissosiasjon av hPSC-avledede endodermale celler moduleres som økte PDX1- og NKX6.1-nivåer i de genererte pankreasprogenitorene og minimerte forpliktelsen til alternativ leveravstamming. Studien fremhever at manipulering av cellens fysiske miljø under in vitro-differensiering kan påvirke avstamningsspesifikasjon og genuttrykk. Derfor letter den nåværende optimaliserte protokollen den skalerbare generasjonen av PDX1 og NKX6.1 som uttrykker forfedre for celleterapi og sykdomsmodellering.
Introduction
Diabetes er en kompleks metabolsk lidelse som påvirker millioner av mennesker globalt. Tilskudd av insulin anses som det eneste behandlingsalternativet for diabetes. Mer avanserte tilfeller behandles med betacelleerstatningsterapi, oppnådd ved transplantasjon av enten hele kadaveriske pankreas eller øyer 1,2. Flere problemer omgir transplantasjonsbehandling, for eksempel begrensning med tilgjengelighet og kvalitet på vevet, invasivitet av transplantasjonsprosedyrer i tillegg til det kontinuerlige behovet for immunosuppressive midler. Dette nødvendiggjør behovet for å oppdage nye og alternative alternativer for betacelleerstatningsterapi 2,3. Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har nylig dukket opp som et lovende verktøy for å forstå human bukspyttkjertelbiologi og som en ikke-uttømmende og potensielt en mer personlig kilde for transplantasjonsbehandling 4,5,6,7. hPSCs, inkludert humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs), har høy selvfornyelseskapasitet og gir opphav til alle vevstyper i menneskekroppen. hESCs er avledet fra embryoets indre cellemasse, og hiPSCs omprogrammeres fra en hvilken som helst somatisk celle 4,8.
Rettet differensiering protokoller er optimalisert for å generere bukspyttkjertelen beta-celler fra hPSCs som sekvensielt direkte hPSCs gjennom bukspyttkjertelen utviklingsstadier invitro. Disse protokollene genererer hPSC-avledede øyorganoider. Mens de har forbedret seg sterkt ved å øke andelen betaceller i bukspyttkjertelen deri, er effektiviteten av protokoller svært variabel. Det øker ikke til mer enn ~40% av NKX6.1+/INSULIN+ eller C-PEPTIDE + celler 5,9,10,11,12,13. Imidlertid er de genererte betacellene ikke helt identiske med de voksne humane betacellene når det gjelder transkripsjonelle og metabolske profiler og deres respons på glukose 4,5,14. De hPSC-avledede betacellene mangler genuttrykk av viktige betacellemarkører som PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 og KCNK3 sammenlignet med voksne mennesker holmer5. I tillegg har de hPSC-avledede betacellene redusert kalsiumsignalering som respons på glukose. De er forurenset med de kogenererte polyhormonale cellene som ikke utskiller passende mengder insulin som svar på økende glukosenivå5. På den annen side kan hPSC-avledede pankreasprogenitorer, som er øyforløpere, genereres mer effektivt in vitro sammenlignet med beta-celler, og når de transplanteres in vivo, kan de modnes til funksjonelle, insulinutskillende betaceller15,16. Kliniske studier er for tiden fokusert på å demonstrere deres sikkerhet og effekt ved transplantasjon hos T1D-personer.
Spesielt er ekspresjon av transkripsjonsfaktorene PDX1 (Pancreas and Duodenal Homeobox 1) og NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) innenfor samme pankreasprogenitorcelle avgjørende for forpliktelse mot en betacellelinje5. Pankreasprogenitorer som ikke uttrykker NKX6.1 gir polyhormonale endokrine celler eller ikke-funksjonelle betaceller17,18. Derfor er et høyt kouttrykk av PDX1 og NKX6.1 i bukspyttkjertelen stamcellestadiet avgjørende for til slutt å generere et stort antall funksjonelle betaceller. Studier har vist at en embryoid kropp eller 3D-kultur forbedrer PDX1 og NKX6.1 i bukspyttkjertelen forfedre hvor differensierende celler er aggregert, varierende mellom 40% -80% av PDX1 + / NKX6.1 + befolkningen12,19. Imidlertid, sammenlignet med suspensjonskulturer, er 2D-differensieringskulturer mer kostnadseffektive, gjennomførbare og praktiske for bruk på flere cellelinjer5. Vi viste nylig at monolagdifferensieringskulturer gir mer enn 90% av PDX1+/NKX6.1+ meduttrykkende hPSC-avledede pankreasprogenitorer20,21,22. Den rapporterte metoden ga en høy replikeringskapasitet til de genererte pankreasprogenitorene og forhindret alternative skjebnespesifikasjoner som leverlinje21. Derfor demonstrerer denne protokollen en svært effektiv metode for differensiering av hPSCs til pankreas beta-celleforløpere som uttrykker PDX1 og NKX6.1. Denne metoden benytter teknikken for å dissosiere hPSC-avledet endoderm og manipulere celletettheten, etterfulgt av en utvidet FGF- og Retinoid-signalering samt Hedgehog-hemming for å fremme PDX1 og NKX6.1-samuttrykk (figur 1). Denne metoden kan legge til rette for en skalerbar generering av hPSC-avledede betacelleforløpere i bukspyttkjertelen for transplantasjonsbehandling og sykdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien er godkjent av den aktuelle institusjonelle forskningsetiske komité og utført i henhold til de etiske standarder som er fastsatt i Helsinkideklarasjonen fra 1964 og senere endringer eller sammenlignbare etiske standarder. Protokollen ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) i HMC (nr. 16260/16) og Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (nr. 2016-003). Dette arbeidet er optimalisert for hESC-er som H1, H9 og HUES8. Blodprøver ble innhentet fra friske personer fra Hamad Medical Corporation (HMC) sykehus med fullt informert samtykke. IPSC-ene genereres fra mononukleære celler i perifert blod (PBMC) av kontroll, sunt individ23.
1. Utarbeidelse av kulturmediene
- Forbered humane pluripotente stamceller (hPSC) kulturmedier
- Forbered hPSC-kulturmedier fra det kommersielt tilgjengelige mediet for å opprettholde og utvide humane embryonale stamceller ved å supplere 100 enheter / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (se materialtabell). Aliquot og oppbevar hele mediet ved -20 °C på lang sikt eller 4 °C for umiddelbar bruk.
- Forbered trinn 1 differensieringsmedier (for definitiv endoderm (DE)).
- Forbered basalmedier fra MCDB 131-medier ved å supplere med 0,5% fettsyrefritt bovint serumalbumin (FFA-BSA), 1,5 g / l natriumbikarbonat (NaHCO3), 10 mM glukose, 2 mM glutamax, 100 enheter / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin (se materialtabell). Filtrer det klargjorte mediet med et 0,2 μm filter og oppbevar ved 4 °C.
- Forbered trinn 1-medier som inneholder CHIR99021 fra basalmediet (fremstilt i trinn 1.2.1) ved å varme opp basalmediet ved 37 °C og deretter supplere med 2 μM CHIR99021, 100 ng / ml Activin A, 10 μM berginhibitor (Y-27632) og 0,25 mM vitamin C (se materialtabell). Bland det supplerte mediet godt og dekk det med aluminiumsfolie for å beskytte det mot lys.
MERK: Dette mediet vil bare bli brukt på den første dagen av differensiering. - Forbered trinn 1-medier uten CHIR99021 fra basalmediet ved å varme det opp ved 37 °C og supplere det med 100 ng/ml Activin A og 0,25 mM vitamin C og bland godt.
MERK: 5 ng / ml av grunnleggende FGF eller FGF2 kan eventuelt legges til dette mediet. Dette mediet vil bli brukt for de resterende dagene av trinn 1.
- Forbered trinn 2 differensieringsmedier (for primitivt tarmrør; PGT).
- Forbered trinn 2 differensieringsmedier som inneholder berginhibitor fra basalmediet ved å varme det opp ved 37 ° C og supplere med 50 ng / ml FGF10, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (Rockinhibitor) og 0,25 mM vitamin C.
MERK: Dette mediet brukes på dagen for dissosiasjon av endodermale celler. - Forbered trinn 2-differensieringsmedier uten steininhibitor etter samme prosedyre for media fremstilt i trinn 1.3.1, unntatt berginhibitoren.
MERK: Dette mediet brukes på den andre dagen i trinn 2.
- Forbered trinn 2 differensieringsmedier som inneholder berginhibitor fra basalmediet ved å varme det opp ved 37 ° C og supplere med 50 ng / ml FGF10, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (Rockinhibitor) og 0,25 mM vitamin C.
- Forbered trinn 3 differensieringsmedier (for Posterior Foregut).
- Forbered DMEM-medier som inneholder 4,5 g / l glukose, suppler deretter med 1% penicillin-streptomycin og 2 mM glutamax og bruk som basalmedium for trinn 3 og 4.
- Varm DMEM-mediet (tilberedt i trinn 1.4.1) og suppler med 2 μM retinsyre, 0,25 μM SANT-1, 50 ng / ml FGF10, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 mM vitamin C og 1% B27 supplement uten vitamin A (se materialtabell).
MERK: Dette mediet brukes i 4 dager med trinn 3 for P2-D (protokoll 2, optimalisert, dissosiert) og 2 dager med trinn 3 for P1-ND (protokoll 1, ikke-optimalisert, ikke-dissosiert).
- Forbered trinn 4 differensieringsmedier (for bukspyttkjertelforfederer).
- Tilsett DMEM som inneholder 4,5 g / l glukose med 100 ng / ml EGF, 10 mM nikotinamid, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 mM vitamin C og 1% B27 supplement uten vitamin A (se tabell over materialer). Bruk dette mediet for alle dager i trinn 4.
MERK: Oppbevar alle reagenser ved passende temperaturer, og alle cytokiner og følsomme reagenser må aliquoteres. Tine de alisiterte reagensene og legge til basalmediet på tidspunktet for endring av differensieringsmediet. Sammensetningene av de ulike differensieringsmediene er gitt i tabell 1.
- Tilsett DMEM som inneholder 4,5 g / l glukose med 100 ng / ml EGF, 10 mM nikotinamid, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 mM vitamin C og 1% B27 supplement uten vitamin A (se tabell over materialer). Bruk dette mediet for alle dager i trinn 4.
2. Tilberedning av kjellermembranmatrisebelagte retter
- Tine kommersielt tilgjengelig kjellermatrise (se Materialtabell) og aliquot på is; frys aliquotene ved -20 °C.
- Før du belegger vevskulturrettene, tiner du de frosne aliquotene på is. Tilsett passende volum av membranmatriksløsningen til det kjølte KO-DMEM/F-12-mediet (KnockOut DMEM/F-12) (se Materialfortegnelse) for å oppnå ønsket fortynnet konsentrasjon og bland godt. Oppbevar den fortynnede matriksoppløsningen ved 4 °C til umiddelbar bruk.
- Dekk overflaten på de vevskulturbehandlede platene (se Materialfortegnelse) med fortynnet membranmatriksløsning og plasser platene ved 37 °C i minst 60 minutter før cellene pletter. Bruk en fortynning av 1:50 av membranmatriseløsningen i KO-DMEM / F-12 for plating av celler for bukspyttkjerteldifferensieringseksperiment og 1:80 for utvidelse av utifferentierte hPSCer.
3. Kultur av udifferensierte hPSCs
- Passasje hPSC-ene når koloniene når en 70% -80% sammenløp.
- For å passere, vask hPSC-ene en gang med varm PBS, aspirer ved hjelp av en bærbar vakuumaspirator inne i vevskulturhetten, og tilsett 0,5 mM EDTA-løsning i PBS for å dekke kolonioverflaten. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 1 minutt eller til kolonienes grenser løsner fra plateoverflaten.
- Fjern EDTA-løsningen og samle løsrivelseskoloniene med hPSC-kulturmedium ved hjelp av en P1000 mikropipette. Sentrifuge de oppsamlede cellene ved 128 x g i 4 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og suppler cellene med hPSC-kulturmedier som inneholder 10 μM Y-27632 (berginhibitor)23,24.
MERK: Pass hPSC-ene i minst 1:3-forhold på 1:80 membranmatrisebelagte retter. Men for differensieringseksperimenter, tallerken hPSCs på 1:50 belagte retter.
4. Induksjon av definitiv endoderm (DE) differensiering i hPSCs (trinn 1)
- Når hPSC-koloniene når en sammenheng på 70% -80%, vask dem to ganger med varm PBS og aspirer ved hjelp av en bærbar vakuumaspirator inne i vevskulturhetten for å starte trinn 1-differensiering.
- Tilsett trinn 1-differensieringsmedium som inneholder CHIR99021 (fra trinn 1.2.2) til koloniene, 2 ml per 6-brønnsplate, og inkuber ved 37 °C i 24 timer.
- Neste dag erstatter du brukte medier med trinn 1-differensieringsmedium uten CHIR99021 (trinn 1.2.3).
- Hver 24. time aspirerer du det brukte mediet ved hjelp av en bærbar vakuumaspirator inne i avtrekkskulturhetten og erstatter det med et friskt trinn 1-differensieringsmedium uten CHIR99021.
MERK: Trinn 1 kan forlenges opptil 4 dager. Lengden på trinn 1 er avhengig av hPSC-linjen som brukes, og bør optimaliseres tilsvarende.
5. Immunfluorescensanalyse av hPSC-avledet DE (trinn 1)
- For immunfluorescens, aspirer det brukte mediet ved hjelp av en bærbar vakuumaspirator inne i vevskulturhetten fra brønnene og vask to ganger med varm PBS. Virvle platen for å kvitte seg med celleavfall.
- Dekk overflaten av brønnene med 4% paraformaldehyd (PFA) for å fikse DE-cellene; Legg for eksempel til 250 uL PFA per brønn på en 24-brønnsplate. Legg platen på en 2D-shaker ved 20 x g i 20 minutter.
- Etter fiksering, vask DE-cellene med tris-bufret saltvann med 0,5% Tween (TBST) (se Materialfortegnelse) og legg platen på shakeren ved 20 x g i 10 minutter. Gjenta dette trinnet en gang til.
- Permeabiliser de faste cellene ved å tilsette et sjenerøst volum fosfatbufret saltvann med 0,5% Triton X-100 (PBST); Legg for eksempel til 1 ml PBST per brønn på en 24-brønns plate og legg platen tilbake på shakeren ved 20 x g i 20 minutter.
- Tilbered nylig 5% -6% av BSA i PBST som blokkeringsbuffer og legg den til de permeabiliserte cellene. Inkuber platen i minst 1 time i blokkeringsløsningen på shakeren.
- Fortynn de primære antistoffene mot SOX17 og FOXA2 sammen (se materialfortegnelse) i 2%-3% BSA i PBST-oppløsning. Tilsett de kombinerte antistoffene i blokkerte celler og legg platen på shakeren ved 4 °C over natten i lav hastighet med forsiktig risting.
MERK: SOX17 og FOXA2 er veletablerte DE-markører25,26. - Neste dag, aspirer de primære antistoffene ved hjelp av et bærbart vakuumfilter og vask brønnene med TBST tre ganger, hver vask i 10 minutter på shakeren.
- Forbered 1:500 fortynning av Alexa fluor 488- og 568- konjugerte sekundære antistoffer (se materialtabell) mot arten de primære antistoffene ble oppdratt i.
- Tilsett den sekundære antistoffkombinasjonen til den flekkete brønnen og dekk platen med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys. Plasser platen på shakeren i 1 time ved romtemperatur.
- Aspirer den sekundære antistoffløsningen ved hjelp av et bærbart vakuumfilter og vask de flekkete brønnene med TBST på shakeren i 10 minutter, og dekk platen med folie. Gjenta vasketrinnet totalt tre ganger.
- Forbered en 1 μg / ml Hoechst 33342 fortynning i PBS for å flekke kjernene. Tilsett Hoechst-løsningen i brønnene og legg platen på shakeren i 2-3 minutter.
- Aspirer Hoechst-løsningen med et bærbart vakuumfilter og skyll brønnene med PBS to ganger.
- Til slutt legger du PBS til de fargede cellene og avbilder dem ved hjelp av et omvendt fluorescensmikroskop (se Materialtabell) i mørket. Hold platen dekket med folie når du ikke avbilder for å minimere fluoroforblekingen.
MERK: Alternativt kan flowcytometri brukes til å vurdere DE-effektivitet som beskrevet i trinn 9.2.
6. Generering av det primitive tarmrøret (PGT) fra hPSCs (trinn 2)
MERK: Hvis immunfluorescensanalysen i trinn 5.13 er fastslått å være et SOX17-FOXA2-kouttrykk på 80% og over, fortsetter eksperimentet til trinn 2. Hvis effektiviteten er <80%, forleng varigheten av trinn 1 til 4 dager.
- På dag 1 av trinn 2 dissosierer du de hPSC-avledede endodermale cellene ved hjelp av TrypLE eller Accutase (se Materialtabell) for den optimaliserte P2-D-protokollen. Vask de tilhørende cellene med varm PBS og tilsett varm 1 ml TrypLE- eller Accutase-løsning per brønn av en 6-brønnsplate i 3-5 minutter ved 37 °C, 5% CO2, eller til cellene begynner å løsne seg fra hverandre.
- Distanser de frittliggende arkene eller monolaget av celler i brønnene og samle dem deretter sammen i et 15 ml polypropylenrør ved hjelp av basale trinn 1/2-medier uten cytokiner som inneholder minst 0,5% av enten føtalt bovint serum (FBS) eller KnockOut serum (KOSR) (se materialtabell).
- Spinn ned cellene ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten. Tilsett 1 ml steril PBS og resuspender pelleten i enkeltceller.
- Tell cellene ved hjelp av en automatisert teller (se Materialfortegnelse) ved å laste inn det anbefalte volumet av celler i kammersklien. Spinn de resuspenderte cellene ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i riktig volum av trinn 2 differensieringsmedium som inneholder Rock inhibitor med en tetthet på 2,5-3,5 x 105 celler / cm2.
MERK: Denne tellingen kan komme ned til et 1: 2-delingsforhold for de fleste cellelinjer, avhengig av spredningshastigheten. Det totale volumet vil være 2 ml media med resuspenderte celler i 1 en brønn med 6-brønnplate. - Plate de resuspenderte cellene på 1:50 membranmatrisebelagte plater (fremstilt i trinn 2) og inkuber dem ved 37 °C, 5% CO2 i inkubatoren.
- 24 timer senere, erstatt mediet med trinn 2 differensieringsmedium uten steininhibitor (fremstilt i trinn 1.3.2).
7. Generering av bakre foregut fra hPSCs (trinn 3)
- Aspirer de brukte trinn 2-mediene ved hjelp av en bærbar vakuumaspirator inne i vevskulturhetten og vask cellene med varm PBS.
- Legg til trinn 3-differensieringsmedier fra trinn 1.4 til cellene og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
- Etter 24 timer erstatter du de brukte mediene med nylagde trinn 3-differensieringsmedier. Gjenta dette i totalt 4 dager for P2-D-protokollen (optimalisert) og bare 2 dager for den ikke-dissosierte P1-ND.
8. Generering av bukspyttkjertelprogenitorer fra hPSCs (trinn 4)
- Etter 4 dager med trinn 3-behandling, vask cellene med varm PBS, virvle platen forsiktig og aspirer ved hjelp av en bærbar vakuumaspirator. Deretter legger du til trinn 4-differensieringsmedier fra trinn 1.5 til cellene.
- Etter 24 timer erstatter du de brukte mediene med nylagde trinn 4-medier. Gjenta dette i totalt 4 dager.
9. Vurdering av differensieringseffektivitet ved generering av bukspyttkjertelprogenitorer fra hPSCs
- Utføre immunfluorescensanalysen av de hPSC-avledede pankreasprogenitorene (trinn 4) for ekspresjon av PDX1 og NKX6.1.
MERK: PDX1 og NKX6.1 er veletablerte pankreasprogenitormarkører17,18.- Utfør fiksering, permeabilisering, blokkering og antistoffinkubasjon og vasker i henhold til trinn 5.
- Flekk de hPSC-avledede pankreasprogenitorene med en kombinasjon av PDX1- og NKX6.1-antistoffer (se materialtabell) fortynnet i 2%-3% BSA i PBST.
- Bruk 1:500 fortynninger av passende Alexa fluor 488- og 568- konjugerte sekundære antistoffer (se materialfortegnelse).
- Utføre flow-cytometri analyse av hPSC-avledede pankreasprogenitorer for ekspresjon av PDX1 og NKX6.1.
MERK: Flow-cytometri analyse av bukspyttkjertel markører i de genererte hPSC-avledede bukspyttkjertelen forfedre gir en måte å kvantifisere PDX1 og NKX6.1 co-uttrykke celler.- På slutten av trinn 4, vask cellene to ganger med varm PBS og tilsett nok TrypLE eller Accutase til å dekke overflaten av brønnene, for eksempel 1 ml TrypLE eller Accutase per brønn på 6-brønns plate. Plasser platen i inkubatoren i 5-7 minutter eller til cellene løsner fra overflaten.
- Kast de tilhørende arkene av celler i brønnen ved hjelp av en P1000 mikropipette før du samler dem i et 15 ml polypropylenrør.
- Spinn ned cellene i hPSC-avledede pankreasprogenitorer ved 800 x g i 5 minutter ved 4 ° C, og kast deretter supernatanten. Vask cellene med PBS ved å dissosiere dem i enkeltceller. Tell cellene ved hjelp av en automatisert teller (se Materialfortegnelse) og noter konsentrasjonen i antall celler per ml.
- Spinn ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kast supernatanten. Tilsett 200 μL kjølt PBS i pelleten og dissocier.
- Tilsett 2 ml kjølt 80% etanol dråpevis, med røret på en virvel ved lav middels hastighet (400 x g ved romtemperatur). Lukk hettene tett og legg rørene litt vippet på shakeren ved 4 °C over natten.
- Spinn ned cellene ved 800 x g i 5 minutter ved 4 ° C, og vask med PBS for å dissosiere eventuelle klumper av faste celler.
- Blokker de faste cellene med 5% -6% BSA-løsning i PBST i minst 1 time ved romtemperatur eller 4 ° C over natten på shakeren.
- Flekk for bukspyttkjertelen stamcellemarkører ved å følge trinnene nedenfor.
- Distribuer 2 00 000 celler per tilstand, inkludert passende isotypekontroller avhengig av IgG-underklassen av vertsarten til det primære antistoffet, ufargede og sekundære antistoffkontroller i en 96-brønns V-bunnplate eller 1,5 ml sentrifugerør.
- Spinn ned platen ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C og snu platen med en rask bevegelse for å kaste supernatanten uten å miste pellets. Klargjør primære antistofffortynninger i 3 % BSA-oppløsning (se materialfortegnelse).
MERK: Konsentrasjonen av primære antistoffer kan være mellom 1:50 og 1:200. - Inkuber de fargede cellene i minst 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C på en shaker med forsiktig risting ved lav hastighet.
- Vask de fargede cellene med TBST tre ganger ved å pipettere cellene opp og ned i brønnene. Spinn og kast supernatanten som i trinn 9.2.8.2.
- Tilsett 1:500 fortynning av sekundære antistoffer (Alexa fluor 488- og 647-konjugerte antistoffer) fremstilt i PBS (se tabell over materialer). Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask de fargede cellene med TBST minst to ganger ved å pipettere cellene opp og ned. Snurr platen og kast supernatanten som i trinn 9.2.8.2.
- Samle de fargede cellene i minst 100 μL PBS og overfør dem til lysbeskyttede FACS-rør (se materialtabell). Kjør prøvene på en flow-cytometri maskin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene viser at optimalisert protokoll P2-D (figur 1A) forbedret pankreasprogenitordifferensieringseffektivitet ved å oppregulere PDX1 og NKX6.1 samuttrykk (figur 2A, B og figur 3A). Spesielt viste resultatene at dissosiasjon av endodermale celler og deres replating på fersk membranmatrise sammen med en lengre varighet av trinn 3 forbedret NKX6.1-uttrykk i hPSC-avledede pankreasprogenitorer (optimalisert protokoll, P2-D) (figur 2 og figur 3A), sammenlignet med den ikke-dissosierte protokollen (P1-ND) som ble modifisert fra en tidligere publisert studie27 . Den nåværende forbedrede protokollen genererte også den høyeste andelen PDX1+/NKX6.1+ forfedre sammenlignet med "P1-D" (protokoll 1, S3 = 2 dager, dissosiert) og "P2-ND" (protokoll 2, S3 = 4 dager, ikke-dissosiert), og de detaljerte resultatene er tidligere publisert21. Pankreasprogenitorer generert ved bruk av P2-D har også økt antall SOX9+-celler sammenlignet med den ikke-dissosierte P1-ND (figur 3B). Den optimaliserte metoden genererte også en høyere andel proliferative NKX6.1+-celler som uttrykker proliferasjonsmarkøren Ki67 (figur 3C).
De representative resultatene som presenteres her er fra iPSCs generert fra perifert blod mononukleære celler (PBMCs) av kontroll, sunt individ. Imidlertid har vi reproduserbart brukt den nåværende forbedrede protokollen på flere hPSC-linjer som H1-hESCs, H9-hESCs, HUES8-hESCs og flere andre kontroll iPSC-linjer for å gi ~ 90% PDX1 og NKX6.1 co-expressing pankreas forfedre20,21,28.
Etter DE-induksjon i hPSC forventes milde nivåer av celledød. Men hvis en høy celledødsrate ble observert, ble forsøket stoppet og startet igjen med en ny gruppe celler. Effektiviteten av DE-induksjon bør være høyere enn 70% -80% for å sikre en høy andel DE-celler i kulturen som vil tjene som en ideell startkilde for pankreasprogenitorinduksjon (figur 1C).
Tettheten av replating endodermale celler etter dissosiasjon kan manipuleres basert på vekstraten til den aktuelle cellen. For eksempel kan sakte voksende celler bli replated med høyere tetthet enn anbefalt. Dette vil minimere sjansene for å oppnå irrelevante bukspyttkjertelpopulasjoner i trinn 4. Et høyt co-uttrykk av PDX1 og NKX6.1 kan oppnås etter dissosiasjon etter trinn 1 og replating ved halv tetthet (figur 1A, figur 2A, B og figur 3A). Hvis et høyt uttrykk for PDX1 observeres, men bare et moderat uttrykk for NKX6.1, kan trinn 4 forlenges med 2 dager for å forbedre NKX6.1-uttrykket i PDX1-uttrykkende celler.
Figur 1: Tidslinje for tilsetning av cytokiner og vekstfaktorer under pankreasprogenitordifferensiering. (A) Skjematisk fremstilling av den optimaliserte protokollen (P1-D) for generering av PDX1 og NKX6.1 fra hPSCer. hPSC-avledet definitiv endoderm (DE) dissosieres og replates ved halv tetthet og deretter sekvensielt rettet mot en bukspyttkjertelprogenitorskjebne. (B) Bilder av hPSC-er i brightfield før differensiering starter på dag 0. (C) Immunostaining-analyse for ekspresjon av endodermale markører SOX17 og FOXA2 i hPSC-avledede endodermceller (trinn 1). SOX17, grønn; FOXA2, rød. Skala barer = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Generering av hPSC-avledede pankreasprogenitorer, som uttrykker PDX1 og NKX6.1. Immunostaining-analyse for sammenligning av PDX1- og NKX6.1-uttrykk i hPSC-avledede pankreasprogenitorer ved bruk av forbedret protokoll (P2-D) (A) og en ikke-optimalisert, tidligere publisert protokoll (P1-ND) (B). Den forbedrede protokollen oppnådde det høyeste samuttrykket til PDX1 og NKX6.1. PDX1, grønn; NKX6.1, rød. Forstørrede bilder er gitt i det andre panelet for hver protokoll. Skala barer = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av bukspyttkjertelmarkører i pankreasprogenitorer generert ved hjelp av den forbedrede protokollen. Flowcytometrianalyse i hPSC-avledede pankreasprogenitorer ga P2-D sammenlignet med den ikke-dissosierte P1-ND. (A) Histogrammer for PDX1- og NKX6.1-uttrykk og dobbeltpositive fargegrafer. (B) histogrammene for SOX9-uttrykk og (C) samuttrykk av NKX6.1 med spredningsmarkøren Ki67. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stadium | Media | Cytokiner | Dager | ||||||
| 1 | MCDB 131 media + 0,5 % fettsyrefritt bovint serumalbumin (FFA-BSA), 1,5 g/l natriumbikarbonat (NaHCO3), 10 mM glukose | Dag 1: 2 μM CHIR99021, 100 ng/ml Activin A, 10 μM Gynhemmer (Y-27632), 0,25 mM C-vitamin. Dag 2 og utover: 100 ng/ml Activin A, 0,25 mM C-vitamin | 3 eller 4 | ||||||
| 2 | MCDB 131 media + 0,5 % fettsyrefritt bovint serumalbumin (FFA-BSA), 1,5 g/l natriumbikarbonat (NaHCO3), 10 mM glukose | Dag 1 (Dissosiasjon): 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (steininhibitor) , 0,25 mM C-vitamin Dag 2: 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 0,25 mM C-vitamin. | 2 | ||||||
| 3 | DMEM + 4,5 g/l glukose | 2 μM Retinsyre, 0,25 μM SANT-1, 50 ng / ml FGF10, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 mM Vitamin C, 1% B27 supplement uten vitamin A | 4 | ||||||
| 4 | DMEM + 4,5 g/l glukose | 100 ng / ml EGF, 10 mM nikotinamid, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 mM vitamin C, 1% B27 supplement uten vitamin A. | 4 | ||||||
Tabell 1: Sammensetningene av de ulike differensieringsmediene som ble brukt i studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet beskriver en forbedret protokoll for generering av bukspyttkjertelprogenitorer fra hPSC-er med høyt samuttrykk av PDX1 og NKX6.1. Dissosiasjon og replating av den hPSC-avledede endodermen ved halv tetthet på fersk matriks resulterte i høyere PDX1 og NKX6.1 i hPSC-avledede pankreasprogenitorer.
Selv om vekstfaktorcocktailen for hvert trinn er svært lik P1-ND 27, har det vist seg at en mer utvidet trinn 3-behandling inkludert FGF og retinoidsignalering og BMP- og pinnsvinhemming øker NKX6.1-uttrykket, noe som er i motsetning til Nostro et al.s funn27. Mens PDX1-uttrykk i bukspyttkjertelen under embryonal utvikling er positivt regulert av FGF og retinoidsignalering og BMP- og pinnsvinhemming27,29,30, viste de foreliggende resultatene at utvidelsen av denne signalcocktailen også oppregulerer NKX6.1. Likevel ble effekten av en utvidet stadium 3-behandling hjulpet av dissosiasjon og replating av endodermale celler som førte til økt PDX1- og NKX6.1-uttrykk. Videre økte denne metoden (P2-D) også SOX9-uttrykkende celler i hPSC-avledede pankreasprogenitorer, i tillegg til andelen proliferative NKX6.1+-celler som uttrykker proliferasjonsmarkøren Ki67.
En annen avgjørende faktor som påvirker effektiviteten av differensiering var tilgjengeligheten av fersk membranmatrise til de dissosierte cellene. De ekstracellulære matrikskomponentene har tidligere vist seg å regulere stamcelleskjebnespesifikasjon31,32. Samlet sett er de gunstige effektene av ekstracellulære matrikskomponenter på bukspyttkjertelutvikling registrert 33,34,35, spesielt for membranmatrisen, som sammen med laminin ble vist å ha en pro-endokrin effekt på bukspyttkjertellinjeceller 36. Derfor kan replating av endodermale celler på fersk membranmatrise ha forbedret NKX6.1-uttrykk i hPSC-avledede pankreasprogenitorer.
Celletettheten til differensierende celler styrer også genuttrykk. Flere studier har vist betydningen av celle-cellekontakt for å regulere bukspyttkjertelutvikling37,38,39. Cellulær aggregering eller embryoid kroppsdannelse har vist seg å indusere høyere pankreas endokrine genuttrykk enn 2D-kulturer19. Resultatene viser imidlertid at høyere pankreasuttrykk, spesielt NKX6.1, kan oppnås ved å dyrke celler i et 2D-monolag ved halvparten av endodermal tetthet ved hjelp av vår optimaliserte protokoll21. Interessant nok hemmet denne metoden også levercelleskjebne (den alternative skjebnen til hPSC-avledet DE) som lagt merke til ved redusert ekspresjon av levergener AFP (Alfa-fetoprotein) og ALB (Albumin) 21, noe som indikerer at fysiske faktorer spiller en rolle i avstamningsspesifikasjon av hPSCs.
Samlet sett viser resultatene at modulering av det fysiske miljøet til de differensierende cellene kan forbedre bukspyttkjertelgenuttrykk21. Spesielt kan dissosiasjonen av hPSC-avledet endoderm og replating på fersk membranmatrise med lengre FGF- og retinoidsignalering og pinnsvin- og BMP-hemming forbedre PDX1- og NKX6.1-samuttrykket i hPSC-avledede pankreas-forfedre. Den optimaliserte protokollen er imidlertid minst 2 dager lenger enn tidligere publiserte protokoller. Lengden på trinn 4 kan også utvides utover det anbefalte minimumet, dvs. 4 dager, basert på cellelinjen som brukes. Flere rekombinante menneskelige vekstfaktorer brukes i den optimaliserte protokollen som kan erstattes av deres billigere, små molekylforbindelser som utfører samme virkning. Likevel kan denne optimaliserte protokollen lette den skalerbare generasjonen av bukspyttkjertelprogenitorer fra hPSCs for celleterapi og sykdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
- Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
- Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
- Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
- Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
- Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
- Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
- Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
- Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
- Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
- Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
- Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
- Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
- Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).
