Summary
이 프로토콜에서 췌장섬은 전용 다중 플랫폼 응용 프로그램에서 구현 된 계산 알고리즘을 사용하여 재구성되고 분석됩니다.
Abstract
췌장섬의 구조적 특성은 인슐린, 글루카곤 및 소마토스타틴 분비 세포의 기능적 반응에 핵심적이며, 이는 전기, 파라크린 및 자가분비 신호를 통한 췌도 내 통신에 미치는 영향으로 인한 것입니다. 이 프로토콜에서 췌장섬의 입체 구조는 먼저 새로운 계산 알고리즘을 사용하여 실험 데이터로부터 재구성됩니다. 다음에, 재구성된 섬의 형태학적 및 연결성 특성, 예컨대 상이한 유형의 세포의 수 및 백분율, 세포 부피, 및 세포-대-세포 접촉이 얻어진다. 그런 다음 네트워크 이론은 평균 정도, 클러스터링 계수, 밀도, 직경 및 효율성과 같은 네트워크 파생 메트릭을 통해 췌도의 연결 특성을 설명하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 이러한 모든 특성은 결합된 발진기 모델을 사용하는 계산 시뮬레이션을 통해 기능적으로 평가됩니다. 전반적으로, 여기서는 췌장섬의 연구 및 시뮬레이션을 위해 특별히 개발된 다중 플랫폼 애플리케이션인 IsletLab에서 구현된 단계별 워크플로우를 설명하고, 실험 작업을 보완하기 위해 췌장섬을 특성화하고 분석하기 위한 새로운 계산 방법론을 적용합니다.
Introduction
췌장은 머리, 목, 신체 및 꼬리라고하는 영역으로 나뉘며, 각각은 서로 다른 구조, 기능 및 해부학 적 위치 1,2를 가지고 있습니다. 기능적 관점에서 볼 때, 췌장은 내분비 시스템과 외분비 시스템으로 나눌 수 있으며, 전자는 포도당 항상성 조절에 중요한 관여하는 호르몬 분비를 담당하는 반면, 후자는 십이지장1로 효소 분비를 통해 음식 소화에 기여합니다. 췌장섬은 췌장의 내분비 조직을 구성하며 각각 ɑ, β 및 δ 세포에서 분비되는 글루카곤, 인슐린 및 소마토스타틴의 분비를 담당합니다3. 그들의 본질적인 조절 메커니즘 외에도, 이들 세포는 직접적인 전기 소통 (β-세포와 가능성 있는 β 및 δ-세포 사이), 또한 파라크린 및 자가분비 신호전달 4,5,6에 의해 조절된다. 두 메카니즘 모두 췌도 구조(즉, 췌도 내의 상이한 유형의 세포의 조성 및 조직)7,8에 크게 의존한다. 중요하게도, 췌도 건축은 당뇨병이있는 상태에서 변경되며, 결과적으로 섬 내 의사 소통을 방해 할 가능성이 큽니다 9,10.
췌장섬에 대한 연구는 광범위한 실험 방법론을 포함합니다. 이들 중에서도, 췌도에서 상이한 세포의 수, 위치 및 유형을 결정하기 위한 형광 기술의 사용은 췌장섬11,12,13의 구조적 및 형태학적 특성을 연구하고 건강 및 질병에 대한 기능적 함의에 대한 더 나은 이해를 얻을 수 있게 하였다. 보완물로서, 췌장 세포 14,15,16 및 보다 최근에, 췌장섬12,17,18,19의 계산 모델은 실험적으로 다루기 어렵거나 심지어 불가능한 양상을 평가하기 위해 지난 수십 년 동안 사용되어 왔다.
이 프로토콜에서 우리는 췌도 아키텍처를 재구성하고, 정량적 메트릭을 통해 형태 학적 및 연결 특성을 분석하고, 췌도 특성의 기능적 영향을 평가하기위한 기본 시뮬레이션을 수행하는 방법론을 요약하여 실험과 계산 작업 사이의 격차를 해소하는 것을 목표로합니다.
아래에 설명 된 프로토콜은 췌장섬의 연구를 위해 특별히 설계된 계산 알고리즘을 기반으로합니다. 요약하면, 프로토콜의 첫 번째 단계에서, 췌도 아키텍처는 Félix-Martínez et al.19에 의해 최근에 제안된 알고리즘을 사용하여 실험 데이터로부터 재구성되며, 여기서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 염색을 통해 얻어진 핵 위치 및 면역형광을 통해 확인된 세포 유형(Hoang et al.11,12에 의해 상세히 기술됨). )는 반복적인 최적화 절차로 처리됩니다. 이것은 각 세포의 최적 크기와 위치를 결정하고 겹치지 않는 세포로 구성된 섬을 얻게합니다. 둘째로, 재구성된 아키텍처에 기초하여, 세포-세포 접촉들이 식별되어 연결 특성들을 결정하고, 대응하는 췌도 네트워크를 생성하여, 사용자가 췌도 아키텍처를 더 기술하기 위해 정량적 메트릭들을 획득할 수 있게 한다(재구성 알고리즘에 대한 세부사항은 주제(19)에 대한 원래의 작업에서 참조될 수 있다). 마지막으로, 기본적인 기능 시뮬레이션은 Hoang et al.12에 의해 제안 된 모델링 접근법을 사용하여 수행되며, 여기서 실험적으로 관찰 된 호르몬 분비의 박동성 성질20,21에 기초하여, 각 세포는 발진기로 처리되고, 따라서 섬은 재구성 된 섬의 연결 특성에 따라 결합 된 발진기의 네트워크로 표현된다.
이 프로토콜에 사용된 알고리즘의 계산 복잡성을 감안할 때, 관련된 모든 단계들은 전문화된 소프트웨어 또는 프로그래밍 언어의 사용에 대한 그들의 경험 수준에 관계없이 모든 관심있는 독자들에게 이러한 계산 도구들에 접근하는 주된 목적을 갖는 독립형 애플리케이션(22 )에서 구현되었다.
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Protocol
참고: 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 단계별 설명은 다음과 같습니다 (프로토콜의 모든 단계에서 사용되는 제어판에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1 참조).
그림 1: 흐름도. IsletLab에서 구현된 프로토콜의 순차적 순서를 설명하는 흐름도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 리눅스에 IsletLab 설치
참고: 보충 파일 2의 섹션 2 및 3에 제공된 지침에 따라 Windows 또는 macOS에 IsletLab을 설치합니다.
- 인터넷 브라우저를 열고 https://github.com/gjfelix/IsletLab 로 이동합니다. IsletLab 저장소 파일을 다운로드하고 압축을 풉니다.
참고: 보충 파일 3 에는 이 프로토콜에 사용된 IsletLab 버전의 복사본이 포함되어 있습니다. - gcc 및 nvcc 컴파일러가 설치되어 있는지 확인하십시오. 터미널을 열고 다음 명령을 입력합니다.
gcc --version
nvcc --version
시스템에서 이러한 명령을 인식하지 못하는 경우 보충 파일 2 의 섹션 1에 나열된 지침을 따르십시오. - 데이터 과학 플랫폼을 다운로드하여 설치합니다(자료표 참조). 터미널을 열고 IsletLab 폴더로 이동합니다.
- 터미널에 다음 명령을 입력하여 새 환경을 만듭니다.
conda env create -f isletlabgui_v1.0.yml - 다음을 입력하여 새 환경을 활성화합니다.
콘다 활성화 isletlab_v1.0 - 터미널에 다음 명령을 입력하여 IsletLab 응용 프로그램을 시작합니다(주 창에 대한 설명은 그림 2 참조).
파이썬 isletlabgui_v1.0 .py
그림 2: IsletLab의 사용자 인터페이스 인터페이스는 세 개의 메인 패널로 구성됩니다 : 구성 (1), 통계 (2) 및 그래픽 (3) 패널. 그래픽 툴바(4)는 그래픽 패널의 하단에 위치한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 섬 재건
- 입력 데이터를 준비합니다. 입력 췌도 데이터(즉, 셀 유형 및 3차원(3D) 좌표)를 열 1에 셀 유형(11: ɑ-cell, 12: β셀, 13: δ셀로 코딩됨)을 포함하는 4열 파일로 구성하고, 열 2~4에는 각각 x, y 및 z 좌표가 포함되어 있습니다( 보충 파일 2 의 섹션 5에 있는 입력 파일 발췌 또는 IsletLab 저장소에 포함된 입력 테스트 파일 참조).
- 입력 파일에 열 헤더가 포함되어 있지 않은지 확인하십시오. 필요한 경우 IsletLab 저장소에 포함된 예제 입력 파일을 사용하여 프로토콜을 따르십시오(Input_Islet_test.txt).
참고: IsletLab에서 구현된 알고리즘을 개발하는 데 사용된 입력 데이터는 Hoang et al.11,12에 의해 상세히 기술된 바와 같이 실험적으로 얻어졌으며, DAPI 염색을 사용하여 핵 위치 및 면역형광을 결정하여 세포 유형을 확인하였다. - 초기 섬 로드 단추를 클릭하고 입력 데이터가 포함된 파일을 선택하여 초기 섬 , 3D 표현 및 해당 통계를 생성합니다. 오류가 발생하면 'islet 파일을로드하는 중 오류가 발생했습니다'라는 메시지가 표시됩니다. 이 문제를 해결하려면 2.1단계를 반복합니다.
- 재구성 프로세스를 구성합니다. 재구성 설정 단추를 클릭하고 최적화 매개 변수를 수정합니다(재구성 설정 창에 표시된 알고리즘 및 매개 변수에 대한 간략한 설명은 보충 파일 2 의 섹션 4 및 5 참조).
- 초기 온도 = 1, 반복 계수 = 1, 수락 계수 = 1을 설정합니다. 확인 단추를 클릭하여 매개 변수 값을 저장합니다.
참고: 일반적으로 온도 파라미터의 증가와 반복 및 수용 요인의 증가는 컴퓨팅 시간의 증가를 희생하여 재구성된 섬에 포함된 실험 세포의 관점에서 더 나은 재구성 결과를 산출할 것입니다. - Islet 재구성 단추를 클릭하여 재구성 로그 창을 엽니다(재구성 로그에 제공된 정보에 대한 설명은 보충 파일 2의 섹션 6 참조).
- 실행 단추를 클릭하여 재구성 프로세스를 시작합니다. '계속하려면 이 창을 닫으십시오'라는 메시지가 표시될 때까지 최적화 프로세스를 모니터링합니다. 재구성 로그 창을 닫아 재구성된 섬의 시각적 표현을 생성하고 관련 통계를 계산합니다(그림 3A-C의 왼쪽 열 참조).
- 통계 패널의 최종 췌도 탭에 표시된 최적화 통계를 분석하여 재구성 프로세스의 결과를 평가합니다. 특히, 재구성된 섬에 포함된 실험 세포의 백분율(실험의 %)을 최대화하거나 동등하게 중첩 횟수를 최소화하는 데 초점을 맞춥니다(도 3A-C의 수렴 플롯, 오른쪽 열에도 그래픽으로 표시됨).
- 실험 통계량의 %가 사용자 목표에 따라 낮은 것으로 간주되는 경우, 단계 9.1에 설명된 대로 IsletLab을 다시 시작하고 재구성 설정에서 초기 온도, 반복 인자 및 수용 계수를 증가시키고 만족스러운 결과가 얻어질 때까지 단계 2.1-2.4를 반복한다(실험 셀의 95% >). 재구성 과정 및 관련 결과에 대한 자세한 설명은 보충 파일 2 의 섹션 5-7을 참조하십시오.
3. 세포 대 세포 접촉 식별
- 재구성 설정 단추를 클릭하고 연락처 허용 오차 매개 변수를 설정하여 셀 간 접촉 허용 오차를 정의하고 확인을 클릭하여 매개 변수 값을 저장합니다.
참고: 접촉 허용 오차 매개변수는 접촉 중인 것으로 간주하기 위해 셀 사이의 최대 거리를 나타냅니다. - 셀 대 셀 접촉 단추를 클릭하여 밀접한 접촉에 있는 셀을 식별합니다. 연락처 탭에서, 그래픽 패널에 그래픽으로 표시된 접촉 셀(검은 선)과 통계 패널에 표시된 대응하는 통계(즉, 전체, 동형 및 이형 접점 및 ɑ-ɑ, β-β, δ-δ, ɑ-β, ɑ-δ, β-δ 접촉)를 통계패널에 표시한다(도 4A-C의 왼쪽 열 참조).
- 접촉 허용 오차 파라미터를 증가(감소)시켜 세포 대 세포 접촉의 수를 증가(감소)시킨다. 세포 간 접촉의 식별 및 관련 결과에 대한 자세한 내용은 보충 파일 2 의 섹션 8을 참조하십시오.
4. 췌도 네트워크 구축
- 네트워크 구축 단추를 클릭하여 섬 네트워크를 생성하고 연결된 네트워크 메트릭을 계산합니다(그림 4A-C의 오른쪽 열 참조).
참고: 생성된 췌도 네트워크와 관련된 결과에 대한 자세한 설명은 보충 파일 2의 섹션 9에 나와 있습니다.
5. 재건 된 섬의 기능 시뮬레이션
- 인터페이스의 구성 패널에 있는 시뮬레이션 탭 으로 전환합니다(그림 5).
- 원하는 고유 주파수 모드( 상수 또는 임의 )를 선택하고 고유 주파수 구성 단추를 클릭하여 발진기 주파수(Hz)를 정의합니다. 랜덤 고유 주파수가 선택되면 평균과 편차(Hz)를 정의하여 정상적으로 분포된 랜덤 주파수를 생성합니다(시뮬레이션 파라미터에 대한 설명은 보충 파일 2 의 섹션 11 참조).
- 초기 단계의 원하는 모드( 상수 또는 임의)를 선택합니다. 상수 초기 단계를 선택한 경우 초기 단계 구성 단추를 클릭하여 발진기의 위상(라디안 단위)을 정의합니다. 임의의 초기 위상이 선택되면, 시스템은 모든 발진기에 0과 2π 사이의 랜덤 위상을 할당합니다.
참고: 일정한 초기 위상을 선택하면 모든 발진기가 위상으로 초기화됩니다. - 상호 작용 구성 단추를 클릭하여 상호 작용 강도 창에서 셀-셀 간 상호 작용 매개 변수를 정의합니다. 상호 작용 매개 변수에 대한 설명은 보충 파일 2의 섹션 11을 참조하십시오.
- 총 시뮬레이션 시간(ins), 시간 단계(ins) 및 저장 계수(저장된 데이터 요소 사이의 단계 수)를 정의하여 시뮬레이션을 구성합니다. 그림 5 에 표시된 시뮬레이션에서 총 시간은 20000초였으며 시간 단계는 0.1초이고 절약 계수는 500초였습니다.
- 시뮬레이션을 수행하는 데 사용할 수 있는 블록, 스레드 및 컴퓨팅 플랫폼 기능의 수를 정의합니다. 사용 가능한 그래픽 처리 장치(GPU)의 특정 특성에 따라 이러한 파라미터를 정의하십시오.
참고: 그림 5에 표시된 예에서는 멀티프로세서당 36개의 멀티프로세서와 64개의 컴퓨팅 플랫폼 코어가 있는 GPU가 사용되었기 때문에 블록당 36개의 블록과 64개의 스레드(2304개의 컴퓨팅 플랫폼 코어)가 사용되었습니다. 사용된 컴퓨팅 플랫폼 능력 파라미터의 값은 하드웨어 컴퓨팅 플랫폼 능력이 7.5이기 때문에 75였다(이러한 파라미터에 대한 자세한 내용은 보충 파일 2 의 섹션 10 참조). - 시뮬레이션 실행 단추를 클릭하여 시뮬레이션 로그 창을 엽니다. 실행 버튼을 클릭하여 시뮬레이션을 시작하고 '계속하려면 창을 닫으십시오'라는 범례가 표시 될 때까지 프로세스를 모니터링하십시오. 시뮬레이션 로그에 대한 자세한 내용은 보충 파일 2의 섹션 12를 참조하십시오.
- 시뮬레이션 로그 창을 닫아 시뮬레이션 결과를 관찰합니다( 그림 5 참조). 시뮬레이션 결과에 대한 자세한 내용은 보충 파일 2의 섹션 13에 나와 있습니다.
6. 프로젝트 저장 (선택 사항)
- 메뉴 모음에서 파일 > 프로젝트 내보내기 를 클릭합니다. 프로젝트 파일을 저장할 디렉토리를 선택하고 확인 버튼을 클릭하십시오.
참고: 프로젝트 파일의 이름은 초기 데이터 파일의 이름에 따라 자동으로 결정됩니다. 프로젝트가 저장되지 않으면 모든 결과 및 관련 파일이 자동으로 삭제됩니다. - 파일 > 프로젝트 로드를 클릭하여 내보낸 프로젝트를 로드합니다.
7. 숫자 저장 (선택 사항)
- 플롯 도구 모음에 있는 플롯 저장 아이콘을 클릭하여 현재 시각화를 이미지 파일에 저장합니다. 프로토콜 전체에서 생성된 모든 그림에 대해 이 단계를 반복합니다.
참고: 플롯 및 섬 시각화는 그래픽 패널의 플롯 도구 모음에서 사용할 수 있는 아이콘을 사용하여 수정할 수 있습니다.
8. 프로젝트로드 (선택 사항)
- 주 메뉴에서 파일 > 프로젝트 로드 를 클릭하고 6.1-6.2단계에 설명된 대로 이전에 저장한 프로젝트 파일을 선택합니다.
참고: 프로젝트 파일이 외부에서 수정된 경우 프로젝트가 올바르게 로드되지 않습니다. 프로젝트가 성공적으로 로드되면 시뮬레이션 기능만 사용할 수 있습니다.
9. 재구성 프로세스 및 분석 다시 시작 (선택 사항)
- 사용자는 언제든지 파일 > 다시 시작 을 선택하여 모든 결과를 삭제하고 새 재구성 및 분석을 시작할 수 있습니다.
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Representative Results
Félix-Martínez et al.19가 제안한 방법론을 사용한 췌장섬의 재구성은 최적화 알고리즘 (재구성 설정에 정의 된)에 주어진 매개 변수에 크게 의존합니다. 이에 대한 예가 그림 3에 시각적으로 표시되어 있으며, 여기서 서로 다른 매개 변수 집합을 사용하여 얻은 재구성된 섬이 표시됩니다. 먼저, 도 3A에서, 초기 데이터에 포함된 셀의 86.6%를 포함하는 재구성이 도시되어 있다(588개 셀 중 509개, 초기 온도 = 1, 반복 인자 = 1, 수용 인자 = 1). 초기 온도 및 반복 및 수용 인자가 증가하면(초기 온도 = 10, 반복 인자 = 5, 및 수용 인자 = 5, 도 3B), 초기 세포의 더 높은 백분율(93.37%)이 재구성된 섬에 포함되었다(즉, 588개 세포 중 549개). 도 3C에 예시된 바와 같이, 특히 반복 및 수용 인자에 대해 훨씬 더 높은 값이 사용되는 경우(초기 온도 = 10, 반복 계수 = 1000, 수용 인자 = 500), 여기서 재구성된 췌도는 초기 세포의 99.15%(588개 셀 중 583개)로 구성된다. 온도의 함수로서 겹쳐진 셀의 진화를 보여주는 수렴 플롯(그림 3A-C의 오른쪽 열)을 평가하여 파라미터가 최적화 프로세스에 어떤 영향을 미치는지 결정해야 합니다. 엄지 손가락의 규칙으로, 재구성 된 섬이 초기 세포의 낮은 비율을 포함 할 때 상호 작용 및 수용 요인을 증가시켜야합니다. 결과적으로, 컴퓨팅 시간은 필연적으로 증가할 것인데, 그 이유는 이러한 요소들이 평가되는 반복의 수를 직접적으로 증가시키기 때문이다. 예를 들어, 위에서 설명한 첫 번째 재구성의 컴퓨팅 시간은 6초였다. 대조적으로, 두 번째 및 세 번째 재구성의 컴퓨팅 시간은 각각 21 초 및 24 분 6 초였습니다.
그림 3: 재구성 설정에서 차선책의 파라미터 세트를 사용한 섬 재구성 차선책의 파라미터 세트를 사용하면 재구성된 섬에서 실험 세포의 비율이 낮아질 수 있습니다. (a) 왼쪽: 실험 세포의 86.6%가 재구성된 췌도에 포함되었다(초기 온도 = 1, 반복 인자 = 1, 수용 인자 = 1, 계산 시간 = 6 s). 오른쪽: 재건 과정의 수렴 플롯. (b) 왼쪽: 실험 세포의 93.4%가 재구성된 췌도에 포함되었다(초기 온도 = 10, 반복 인자 = 10, 수용 인자 = 5, 계산 시간 = 21 s). 오른쪽: 재건 과정의 수렴 플롯. (c) 왼쪽: 실험 세포의 99.15%가 재구성된 췌도에 포함되었다(초기 온도 = 10, 반복 인자 = 1000, 수용 인자 = 500, 컴퓨팅 시간 = 24분, 8초). 오른쪽: 재건 과정의 수렴 플롯. 수렴 플롯의 화살표는 재구성 프로세스의 초기 및 최종 겹쳐진 셀 수(재구성 알고리즘의 후처리 단계 이전)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
재구성된 췌도로부터의 세포-세포 접촉의 식별은 도 4A-C에 예시된 바와 같이 접촉 공차 파라미터(재구성 설정에서 정의됨)의 값에 의존하며, 여기서 도 3A-C에 도시된 재구성된 아키텍처로부터 식별된 세포-세포 접촉(검은 선으로 표시됨)이 제시된다. 예를 들어, 도 4A에서와 같이 1μm의 접촉 허용오차가 정의되면, 290개의 셀-셀 접촉만이 식별된다. 대조적으로, 도 4B,C에서와 같이 접촉 허용오차가 2μm로 증가하면, 식별된 총 접촉자는 각각 636 및 731로 증가하였다(도 4A-C의 통계 패널 참조). 이러한 차이는 또한 도 4A-C의 왼쪽 열에 도시된 세포간 접촉의 시각적 표현에서 주목될 수 있는데, 이는 접촉 허용오차의 더 높은 값이 사용됨에 따라 세포들 사이의 접촉의 수가 명백히 증가하기 때문이다. 접촉의 수는 또한 재구성 된 섬에 포함 된 세포의 수에 달려 있으므로 온도 매개 변수, 반복 및 수용 요인 및 접촉 허용 오차의 조합은 궁극적으로 형성된 췌도 네트워크와 해당 네트워크 메트릭에 반영되는 재구성 된 섬의 연결성을 결정한다는 것을 강조 할 가치가 있습니다. 도 4A-C의 오른쪽 열에 도시된 바와 같다. 네트워크 플롯을 통해 사용자는 서로 다른 셀이 어떻게 연결되는지 시각화 할 수 있습니다. 정량적으로, 섬의 연결 특성은 다음과 같은 네트워크 메트릭의 관점에서 설명된다: 평균 정도, 밀도, 평균 클러스터링 계수, 효율 및 직경(이러한 메트릭에 대한 자세한 내용은 보충 파일 2의 섹션 9에서 참조할 수 있음).
도 4: 세포간 접촉의 식별에서 접촉 허용 오차 파라미터의 효과. (A-C) 좌측: 도 3A-C에 도시된 재구성된 섬으로부터 확인된 세포-세포 접촉(패널 A, B 및 C에서 각각 290, 636 및 731개의 총 접촉). 접촉 허용 오차 파라미터에 사용된 값은 1 μm(A) 및 2 μm(B 및 C)였다. 재구성된 섬에 포함된 세포의 수는 또한 식별된 세포-세포 접촉의 수에 영향을 미친다는 점에 유의한다. 오른쪽: 셀 간 연락처에서 생성된 네트워크가 해당 왼쪽 열에 표시됩니다. 네트워크 메트릭에 대한 연결의 영향은 통계 패널에서 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마지막으로, 췌도가 재구성되고 세포 대 세포 접촉이 확인되면 기능 시뮬레이션을 수행할 수 있습니다(호환되는 GPU를 사용할 수 있는 경우에만 해당). 전형적인 시뮬레이션 결과는 상이한 세포 집단 (ɑ, β, 및 δ-cells) 및 전체 췌도 (도 5의 그래픽 패널의 상부 플롯)의 합산 진동을 포함하여 도 5에 도시되어 있다. 이 그림은 연결성 및 상호작용 특성의 결과로서 상이한 세포 집단 사이의 시간에 따른 위상 차이를 보여주고, 사용자가 전체 섬(검은 선)의 진동 거동에 대한 각 세포 집단(적색, 녹색 및 청색 선)의 기여도를 결정할 수 있게 한다. 예를 들어, 도 5의 상부 패널은, 집단 수준에서, ɑ 및 β-세포는 위상 밖으로 완전히 진동하는 반면, δ-세포는 ɑ 및 β-세포와 함께 위상 밖으로 진동한다는 것을 암시한다. 더욱이, 시뮬레이션에 따르면, 췌도의 진동 거동은 ɑ-세포의 진동에 의해 지배되지만, 다른 세포 집단의 효과도 또한 주목될 수 있다. 모든 췌도 세포의 진동 신호는 데이터 파일에 자동으로 저장되므로 (보충 파일 2의 표 1 및 섹션 13 참조), 따라서 사용자는 시뮬레이션 결과에 대한 자세한 분석을 수행 할 수 있습니다. 보완적으로, 진동의 위상 일관성을 반영하는 췌도 동기화 인덱스도 계산되어 표시됩니다(그림 5의 그래픽 패널의 하단 그림). 동기화 인덱스의 범위는 0에서 1까지이며, 여기서 0과 1은 각각 섬의 모든 셀 간의 null 및 총 동기화를 나타냅니다. 따라서 동기화 인덱스 플롯은 재구성된 섬의 연결성 및 상호 작용 특성의 결과로 췌도 세포 간의 동시성이 시간에 따라 어떻게 변하는지에 대한 시각화로 해석될 수 있습니다. 수행된 시뮬레이션은 커플링된 발진기(12)의 아이디어에 기초하고 재구성된 섬들의 연결성에 크게 의존하기 때문에, 기능적 시뮬레이션을 수행하기 전에 수용가능한 췌도 재구성 및 세포-세포 연결성에 도달하는 것이 중요하다.
그림 5: 시뮬레이션 매개변수는 시뮬레이션 탭의 구성 패널에 정의되어 있습니다. 시뮬레이션 결과는 그래픽 패널의 시뮬레이션 탭에 표시되며, 여기서 서로 다른 세포 집단(ɑ, β 및 δ)과 전체 섬의 합산된 진동 거동이 표시됩니다(상단). 췌도 세포 사이의 위상 일관성의 척도인 동기화 인덱스도 도시된다(하단). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
프로세스의 거의 모든 단계에서 데이터 파일이 생성된다는 것을 언급 할 가치가 있습니다. 생성된 데이터 파일에 대한 설명은 표 1 및 보충 파일 2에서 찾을 수 있습니다.
| 파일 | 묘사 |
| 섬파일 이름 | 입력 데이터(사용자가 제공) |
| IsletFileName_initial.txt | 초기 췌도 건축은 재구성의 초기 단계로서 알고리즘에 의해 제안되었다. |
| IsletFileName_reconstructed.txt | 재건 된 섬 (posptrocessed되지 않음) |
| IsletFileName_postprocessed_islet.txt | 최종 재건 된 섬과 사후 섬 |
| IsletFileName_processlog.txt | 재구성 로그(최적화 알고리즘) |
| IsletFileName_overlapped_cells.txt | 재구성 프로세스가 끝날 때 겹쳐진 셀(후처리) |
| IsletFileName_all_contacts.txt | 모든 연락처의 보조 행렬 |
| IsletFileName_aa_contacts.txt | ɑ-ɑ 접촉의 Adjancency 행렬 |
| IsletFileName_ab_contacts.txt | ɑ-β 접점의 Adjancency 행렬 |
| IsletFileName_ad_contacts.txt | ɑ-δ 연락처의 Adjancency 행렬 |
| IsletFileName_bbbd_contacts.txt | β 및 β β 접점의 δ속 매트릭스 |
| IsletFileName_bb_contacts.txt | β β 연락처의 보조 매트릭스 |
| IsletFileName_bd_contacts.txt | β δ 연락처의 보조 매트릭스 |
| IsletFileName_dd_contacts.txt | δ δ 연락처의 Adjancency matrix |
| IsletFileName_Kmat.txt | 시뮬레이션에 사용되는 상호 작용 매트릭스 |
| IsletFileName_kuramoto_angles.txt | 쿠라모토 시뮬레이션 결과 |
표 1: 프로젝트 파일의 일부로 저장된 파일에 대한 설명입니다. 프로젝트 파일을 저장하는 데 사용되는 파일 이름은 사용자가 선택한 초기 데이터 파일에 의해 자동으로 정의됩니다.
보충 파일 1: IsletLab의 제어판을 사용한 프로토콜에 대한 그래픽 설명입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: IsletLab 문서. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3 : IsletLab을 설치하는 데 필요한 모든 파일이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위의 프로토콜은 새로운 계산 알고리즘을 사용하여 췌장섬 구조를 재구성하고 분석하는 실용적인 접근 방식을 설명합니다. 이 연구의 주요 목적은 췌도 연구 공동체가 췌장섬 아키텍처의 형태 학적 및 연결 특성을 특성화하고 계산 시뮬레이션을 통해 이러한 특성의 가능한 기능적 함의를 평가하기위한 양적 메트릭을 도출 할 수있게하는 것입니다.
이 프로토콜에 채택된 알고리즘은 앞서12,19에서 상세히 설명되었지만, 상대적인 복잡성으로 인해 직접적이고 사용자 친화적인 구현이 부족하여 실험 및 이론 작업에 대한 보완적인 도구로서의 사용이 제한되었습니다.
첫째, Félix-Martínez et al.19 에 의해 제안 된 최근의 알고리즘은 실험 데이터 (예 : 핵 좌표 및 세포 유형)로부터 섬 구조를 재구성하는 데 사용됩니다. 그 결과, 사용자는 보고된 실험 분포에 따라 반경이 자동으로 할당된 겹치지 않는 구형 세포로 구성된 췌도 구조를 획득한다. 실제로, 재구성 알고리즘은 췌도의 셀 수가 증가함에 따라 계산 관점에서 비용이 많이 드는 반복적 인 최적화 절차입니다. 이러한 이유로 다중 프로세서 시스템을 사용하여 이 프로토콜에 설명된 알고리즘의 병렬 처리 구현을 활용하는 것이 좋습니다. 전술한 바와 같이, 재구성 프로세스를 위한 핵심 단계는 관련된 파라미터들(즉, 반복, 수용 인자, 및 초기 온도)에 대한 적절한 값들을 정의하는 것이고, 컴퓨팅 시간은 사용된 병렬 프로세스들의 수(즉, 재구성 설정들에서의 스레드 파라미터들) 이외에 수행된 반복의 수와 직접적으로 관련될 것이기 때문이다. 계산 시간이 문제가되지 않는 경우 수행 된 반복 횟수를 늘리기 위해 반복 및 수락 요소에 대해 가능한 가장 높은 값을 사용하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 다음 단계는 세포 대 세포 접촉의 식별 및 췌도 네트워크의 생성이다. 두 단계 모두 재구성 과정과 직접적으로 관련이 있으며, 따라서 재구성 된 섬에 포함 된 세포의 수 (따라서 관련된 매개 변수)와 사용 된 접촉 허용 오차의 값은 가능한 최상의 결과를 얻는 데 중요합니다.
마지막으로, 사용자가 원하는 경우, 기능 시뮬레이션은 Hoang et al.12 에 의해 제안된 결합 발진기 모델의 구현을 통해 수행될 수 있으며, 재구성 프로세스로부터 도출된 연결성 네트워크를 사용하여 발진 시스템을 구성할 수 있다. 시뮬레이션 프로세스가 수백 또는 수천 개의 결합 된 미분 방정식 (섬의 각 셀마다 하나씩)의 시스템을 해결하는 것을 포함한다는 점을 감안할 때, 시뮬레이션 알고리즘은 GPU를 사용하여 병렬 계산을 수행 할 수있는 가능성을 활용하여 구현되었으므로 사용자는 비교적 짧은 컴퓨팅 시간에 상당한 긴 시뮬레이션을 시뮬레이션 할 수 있습니다. 프로토콜의 시뮬레이션 단계에서 주요 단계들은 시뮬레이션 패널의 컴퓨팅 플랫폼 설정 섹션에서 이용가능한 블록들 및 스레드들의 적절한 개수를 결정하는 것이며, 이는 사용된 하드웨어의 특성들과 직접적으로 관련된 측면이다. 관련된 다른 파라미터(시뮬레이션 패널의 고유 주파수, 초기 위상 및 상호 작용 강도)는 시뮬레이션 결과와 관련이 있지만 주로 조사 중인 문제와 관련이 있으며 원하는 시뮬레이션 시나리오를 나타내기 위해 신중한 고려 후에 사용자가 정의해야 합니다.
프로토콜이 제공하는 장점에도 불구하고 몇 가지 제한 사항을 인정해야합니다. 첫째, 재구성 과정 및 세포 간 접촉의 식별과 관련된 파라미터는 고유하지 않으며 경우에 따라 다를 수 있습니다. 이러한 이유로 엄지 손가락 규칙을 사용하여 필요한 매개 변수의 값을 결정할 수 있지만 시행 착오 접근법은 여전히 피할 수 없습니다. 프로토콜의 적용 가능성을 제한 할 수있는 또 다른 측면은 특히 프로토콜의 재구성 및 시뮬레이션 단계에 필요한 계산 리소스입니다. 이러한 한계에도 불구하고, 프로토콜의 구현에 프로그래밍 지식이 필요하지 않다는 사실은 다양한 배경을 가진 연구원들이 제안된 알고리즘을 쉽게 사용할 수 있게 해주며, 그렇지 않으면 비전문화된 사용자에게는 모호하게 남아있을 것이다.
제안된 프로토콜의 잠재적인 용도는 실험 데이터의 시각화, 정상 및 변경된 섬의 비교 분석(예를 들어, 제1형 또는 제2형 당뇨병의 존재하에서), 또는 정량적 형태학적, 구조적, 및 네트워크 기반 메트릭(23)을 사용하는 상이한 종으로부터의 섬들 사이의 비교를 포함한다. 더욱이, 여기에 개괄된 프로토콜을 사용하여 재구성된 섬은 재구성된 섬들 내의 세포간 통신의 기능적 함의를 밝히기 위해 재구성 알고리즘에 의해 결정된 연결성 및 세포 크기가 췌장 세포의 상세한 전기생리학적 모델로 보완되는 상세한 기능적 수학적 모델을 생성하는데 용이하게 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
G.J. Félix-Martínez는 CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México)와 Universidad Autónoma Metropolitana (México City)의 전기 공학과에 감사드립니다. Danh-Tai Hoang 박사, Manami Hara 박사 및 Junghyo Jo 박사가이 작업을 가능하게하는 섬 건축물을 연구 공동체와 공유하는 데 탁월한 노력과 관대함에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
| IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |
References
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