Summary
Bu protokolde, pankreas adacıkları yeniden yapılandırılır ve özel bir çok platformlu uygulamada uygulanan hesaplamalı algoritmalar kullanılarak analiz edilir.
Abstract
Pankreatik adacıkların yapısal özellikleri, elektrik, parakrin ve otokrin sinyalizasyonu yoluyla adacık içi iletişimdeki etkileri nedeniyle insülin, glukagon ve somatostatin salgılayan hücrelerin fonksiyonel yanıtı için anahtardır. Bu protokolde, bir pankreas adacığının üç boyutlu mimarisi ilk olarak yeni bir hesaplama algoritması kullanılarak deneysel verilerden yeniden oluşturulmuştur. Daha sonra, yeniden yapılandırılmış adacığın morfolojik ve bağlantı özellikleri, örneğin farklı hücre tiplerinin sayısı ve yüzdeleri, hücresel hacim ve hücreden hücreye temaslar elde edilir. Daha sonra, adacığın bağlantı özelliklerini, ortalama derece, kümeleme katsayısı, yoğunluk, çap ve verimlilik gibi ağ kaynaklı ölçümlerle tanımlamak için ağ teorisi kullanılır. Son olarak, tüm bu özellikler, bir birleştirilmiş osilatör modeli kullanılarak hesaplamalı simülasyonlar yoluyla işlevsel olarak değerlendirilir. Genel olarak, burada, pankreas adacıklarının incelenmesi ve simülasyonu için özel olarak geliştirilmiş çok platformlu bir uygulama olan IsletLab'da uygulanan, pankreas adacıklarını deneysel çalışmanın tamamlayıcısı olarak karakterize etmek ve analiz etmek için yeni bir hesaplama metodolojisi uygulamak üzere adım adım bir iş akışını açıklıyoruz.
Introduction
Pankreas baş, boyun, vücut ve kuyruk olarak adlandırılan bölgelere ayrılır ve her biri farklı yapılara, fonksiyonlara ve anatomik pozisyona sahiptir 1,2. İşlevsel bir bakış açısına göre, pankreas endokrin ve ekzokrin sistemlere ayrılabilir, birincisi glikoz homeostazının düzenlenmesinde kritik rol oynayan hormonların salgılanmasından sorumludur, ikincisi ise enzimlerin duodenum1'e salgılanması yoluyla gıda sindirimine katkıda bulunur. Pankreas adacıkları pankreasın endokrin dokusunu oluşturur ve sırasıyla ɑ, β ve δ hücrelerinden salgılanan glukagon ve insülin ve somatostatin salgılanmasından sorumludur3. İçsel düzenleyici mekanizmalarına ek olarak, bu hücreler doğrudan elektriksel iletişim yoluyla (β hücreler ile muhtemelen β ve δ hücreler arasında) ve ayrıca 4,5,6 numaralı parakrin ve otokrin sinyalleme ile düzenlenir. Her iki mekanizma da adacık mimarisine (yani, adacık içindeki farklı hücre tiplerinin bileşimine ve organizasyonuna) büyük ölçüde bağımlıdır7,8. Daha da önemlisi, adacık mimarisi diyabet varlığında değiştirilir, büyük olasılıkla 9,10 sonuç olarak adacık içi iletişimi bozar.
Pankreas adacıklarının incelenmesi çok çeşitli deneysel metodolojileri içerir. Bunlar arasında, adacıktaki farklı hücrelerin sayısını, yerini ve tipini belirlemek için floresan tekniklerinin kullanılması, pankreasadacıklarının yapısal ve morfolojik özelliklerinin incelenmesine ve sağlık ve hastalıktaki fonksiyonel etkilerin daha iyi anlaşılmasına olanak sağlamıştır. Bir tamamlayıcı olarak, pankreas hücrelerininhesaplamalı modelleri 14,15,16 ve daha yakın zamanda pankreas adacıkları12,17,18,19, son yıllarda deneysel olarak ele alınması zor veya hatta imkansız yönleri değerlendirmek için kullanılmıştır.
Bu protokolde, adacık mimarilerini yeniden yapılandırmak, morfolojik ve bağlantı özelliklerini nicel metrikler aracılığıyla analiz etmek ve adacık özelliklerinin işlevsel etkilerini değerlendirmek için temel simülasyonlar gerçekleştirmek için bir metodoloji çizerek deneysel ve hesaplamalı çalışma arasındaki boşluğu kapatmayı amaçlıyoruz.
Aşağıda açıklanan protokol, pankreas adacıklarının incelenmesi için özel olarak tasarlanmış hesaplama algoritmalarına dayanmaktadır. Özetle, protokolün ilk adımında, adacık mimarisi, Félix-Martínez ve ark.19 tarafından yakın zamanda önerilen algoritma kullanılarak deneysel verilerden yeniden yapılandırılmıştır; burada nükleer pozisyonlar, 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama yoluyla elde edilir ve immünofloresan yoluyla tanımlanan hücresel tipler (Hoang ve ark.11,12 tarafından ayrıntılı olarak açıklandığı gibi). ) yinelemeli optimizasyon yordamında işlenir. Bu, her hücrenin optimal boyutunu ve konumunu belirlemeye ve örtüşmeyen hücrelerden oluşan bir adacık elde etmeye yol açar. İkincisi, yeniden yapılandırılmış mimariye dayanarak, bağlantı özelliklerini belirlemek ve kullanıcının adacık mimarisini daha ayrıntılı olarak tanımlamak için nicel metrikler elde etmesini sağlayan ilgili adacık ağını oluşturmak için hücreden hücreye temaslar tanımlanır (yeniden yapılandırma algoritması ile ilgili ayrıntılara konuyla ilgili orijinal çalışmada danışılabilir19). Son olarak, Hoang ve ark.12 tarafından önerilen modelleme yaklaşımı kullanılarak temel fonksiyonel simülasyonlar gerçekleştirilir; burada deneysel olarak gözlemlenenhormon sekresyonunun pulsatil doğasına dayanarak, her hücre bir osilatör olarak muamele edilir ve bu nedenle adacık, yeniden yapılandırılmış adacığın bağlantı özelliklerini takiben bir kuplajlı osilatörler ağı olarak temsil edilir.
Bu protokolde kullanılan algoritmaların hesaplama karmaşıklığı göz önüne alındığında, ilgili tüm adımlar, bu hesaplama araçlarına, özel yazılım veya programlama dillerinin kullanımındaki deneyim seviyelerine bakılmaksızın ilgilenen tüm okuyuculara yaklaşmak amacıyla bağımsız bir uygulamada22 uygulanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Protokolün şematik diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir. Adım adım açıklama aşağıdaki gibidir (protokolün her adımında kullanılan kontrol panelleri hakkında ayrıntılar için Ek Dosya 1'e bakınız).
Şekil 1: Akış diyagramı. IsletLab'de uygulanan protokolün sıralı sırasını açıklayan bir akış diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. IsletLab'ı Linux'a Yükleme
NOT: IsletLab'ı Windows veya macOS'a yüklemek için Ek Dosya 2'nin 2. ve 3. bölümlerinde verilen yönergeleri izleyin.
- Bir internet tarayıcısı açın ve https://github.com/gjfelix/IsletLab'a gidin. IsletLab depo dosyalarını indirin ve ayıklayın.
NOT: Ek Dosya 3 , bu protokolde kullanılan IsletLab sürümünün bir kopyasını içerir. - gcc ve nvcc derleyicilerinin yüklü olduğunu doğrulayın. Bir terminal açın ve aşağıdaki komutları yazın:
gcc --versiyon
nvcc --versiyon
Bu komutlardan herhangi biri sistem tarafından tanınmıyorsa, Ek Dosya 2'nin 1. bölümünde listelenen yönergeleri izleyin. - Veri bilimi platformunu indirin ve yükleyin (bkz. Bir terminal açın ve IsletLab klasörüne gidin.
- Terminalde aşağıdaki komutu yazarak yeni bir ortam oluşturun:
conda env create -f isletlabgui_v1.0.yml - Aşağıdakileri yazarak yeni ortamı etkinleştirin:
conda isletlab_v1.0 etkinleştirmek - Terminalde aşağıdaki komutu yazarak IsletLab uygulamasını başlatın (ana pencerenin açıklaması için Şekil 2'ye bakın):
python isletlabgui_v1.0.py
Şekil 2: IsletLab'ın kullanıcı arabirimi. Arayüz üç ana panelden oluşur: konfigürasyon (1), istatistik (2) ve grafik (3) panelleri. Grafik araç çubuğu (4), grafik panelinin alt kısmında bulunur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Adacık rekonstrüksiyonu
- Giriş verilerini hazırlayın. Giriş adacığı verilerini (yani, hücre türleri ve üç boyutlu (3B) koordinatlar), sütun 1'in hücre türünü (11: ɑ hücre, 12: β hücre, 13: δ hücre olarak kodlanmış) içerdiği ve 2 ila 4 arasındaki sütunların sırasıyla x, y ve z koordinatlarını içerdiği dört sütunlu bir dosyada düzenleyin ( Ek Dosya 2'nin 5. bölümündeki bir giriş dosyasının alıntısına veya IsletLab deposunda bulunan giriş testi dosyasına bakın).
- Giriş dosyasının sütun başlıkları içermediğinden emin olun. Gerekirse protokolü izlemek için IsletLab deposunda bulunan örnek giriş dosyasını kullanın (Input_Islet_test.txt).
NOT: IsletLab'da uygulanan algoritmaları geliştirmek için kullanılan giriş verileri, Hoang ve ark.11,12 tarafından ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, hücresel tipleri tanımlamak için nükleer pozisyonları ve immünofloresanı belirlemek için DAPI boyaması kullanılarak deneysel olarak elde edilmiştir. - İlk Adacığı Yükle düğmesini tıklatın ve bir başlangıç adacığı, 3B gösterimi ve ilgili istatistikleri oluşturmak için giriş verilerini içeren dosyayı seçin. Hata durumunda, aşağıdaki mesaj görüntülenecektir: 'Adacık dosyası yüklenirken hata'. Bunu düzeltmek için adım 2.1'i yineleyin.
- Yeniden yapılandırma sürecini yapılandırın. Yeniden Yapılandırma Ayarları düğmesini tıklatın ve optimizasyon parametrelerini değiştirin (algoritmanın ve yeniden yapılandırma ayarları penceresinde gösterilen parametrelerin kısa bir açıklaması için Ek Dosya 2'nin 4. ve 5. bölümlerine bakın).
- Başlangıç sıcaklığını = 1, yineleme faktörü = 1 ve kabul faktörünü = 1 olarak ayarlayın. Parametre değerlerini kaydetmek için Tamam düğmesini tıklatın.
NOT: Genel bir kural olarak, sıcaklık parametresindeki artışın yanı sıra yinelemeler ve kabul faktörlerindeki bir artış, hesaplama süresindeki bir artış pahasına yeniden yapılandırılmış adacığa dahil edilen deneysel hücreler açısından daha iyi yeniden yapılandırma sonuçları verecektir. - Yeniden yapılandırma günlüğü penceresini açmak için Islet'i Yeniden Yapılandır düğmesini tıklatın (yeniden yapılandırma günlüğünde sağlanan bilgilerin açıklaması için Ek Dosya 2'nin 6. bölümüne bakın).
- Yeniden yapılandırma işlemini başlatmak için Çalıştır düğmesine tıklayın. Optimizasyon sürecini, 'Lütfen devam etmek için bu pencereyi kapatın' mesajı görüntülenene kadar izleyin. Yeniden yapılandırılmış adacığın görsel temsilini oluşturmak ve ilgili istatistikleri hesaplamak için yeniden yapılandırma günlüğü penceresini kapatın (Şekil 3A-C'deki sol sütuna bakın).
- İstatistik panelinin son adacık sekmesinde gösterilen optimizasyon istatistiklerini analiz ederek yeniden yapılanma sürecinin sonuçlarını değerlendirin. Özellikle, yeniden yapılandırılmış adacıklara dahil edilen deneysel hücrelerin yüzdesini (deneysel % 'si) veya eşdeğer bir şekilde, örtüşme sayısını en aza indirmeye odaklanın (ayrıca yakınsama grafiğinde, Şekil 3A-C'de sağ sütunda grafiksel olarak gösterilmiştir).
- Deneysel istatistiğin yüzdesi kullanıcı hedeflerine göre düşük kabul edilirse, adım 9.1'de açıklandığı gibi IsletLab'ı yeniden başlatın ve yeniden yapılandırma ayarlarında başlangıç sıcaklığını, yineleme faktörünü ve kabul faktörünü artırın ve tatmin edici sonuçlar elde edilene kadar 2.1-2.4 adımlarını tekrarlayın (deneysel hücrelerin %95'ini >). Yeniden yapılandırma sürecinin ve ilgili sonuçların daha ayrıntılı açıklaması için Ek Dosya 2'nin 5-7 bölümlerine bakınız.
3. Hücreden hücreye temasları tanımlama
- Yeniden Yapılandırma Ayarları düğmesini tıklatın ve hücreden hücreye temas toleransını tanımlamak için Temas Toleransı parametresini ayarlayın ve parametre değerlerini kaydetmek için Tamam'ı tıklatın.
NOT: Temas toleransı parametresi, temas halinde olarak kabul edilmek üzere hücreler arasındaki maksimum mesafeyi temsil eder. - Yakın temastaki hücreleri tanımlamak için Hücreden Hücreye Kişiler düğmesini tıklatın. Kişiler sekmesinde, grafik panelinde grafiksel olarak gösterilen temas halindeki hücreleri (siyah çizgiler) ve istatistik panelinde gösterilen ilgili istatistikleri (ör. toplam, homotipik ve heterotipik kişiler ve ɑ-ɑ, β-β, δ-δ, ɑ-β, ɑ-δ, β-δ kişiler) kontrol edin (bkz. Şekil 4A-C'nin sol sütunu).
- Hücreden hücreye temasların sayısını artırmak (azaltmak) için temas toleransı parametresini artırın (azaltın). Hücreden hücreye kişilerin tanımlanması ve ilişkili sonuçlar hakkında ayrıntılar için Ek Dosya 2'nin 8. bölümüne bakın.
4. Adacık ağının oluşturulması
- Adacık ağını oluşturmak ve ilişkili ağ ölçümlerini hesaplamak için Ağ Oluştur düğmesini tıklatın (Şekil 4A-C'deki sağ sütuna bakın).
NOT: Oluşturulan adacık ağı ile ilgili sonuçların daha ayrıntılı bir açıklaması Ek Dosya 2'nin 9. bölümünde verilmiştir.
5. Yeniden inşa edilen adacığın fonksiyonel simülasyonu
- Arayüzün konfigürasyon panelinin Simülasyon Sekmesine geçin (Şekil 5).
- İstediğiniz içsel frekans modunu seçin - Sabit veya Rastgele - ve osilatörlerin frekansını (Hz cinsinden) tanımlamak için İçsel Frekansı Yapılandır düğmesine tıklayın. Rastgele bir içsel frekans seçilirse, normal olarak dağıtılmış rastgele frekanslar üretmek için ortalama ve sapmayı (Hz cinsinden) tanımlayın (simülasyon parametrelerinin açıklaması için Ek Dosya 2'nin 11. bölümüne bakın).
- Başlangıç aşamasının istediğiniz modunu seçin - Sabit veya Rastgele. Sabit başlangıç fazı seçiliyse, osilatörlerin fazını (radyan cinsinden) tanımlamak için Başlangıç Aşamasını Yapılandır düğmesini tıklatın. Rastgele başlangıç fazı seçilirse, sistem tüm osilatörlere 0 ile 2π arasında rastgele fazlar atar.
NOT: Sabit bir başlangıç fazı seçilirse, tüm osilatörler faz olarak başlatılacaktır. - Etkileşim gücü penceresinde hücreden hücreye etkileşim parametrelerini tanımlamak için Etkileşimleri Yapılandır düğmesini tıklatın. Etkileşim parametrelerinin açıklaması için, Ek Dosya 2'nin 11. bölümüne bakın.
- Toplam simülasyon süresini (s cinsinden), zaman adımını (s cinsinden) ve kaydetme faktörünü (kaydedilen veri noktaları arasındaki adım sayısı) tanımlayarak simülasyonu yapılandırın. Şekil 5'te gösterilen simülasyonda toplam süre, 0,1 sn zaman adımı ve 500 tasarruf faktörü ile 20000 sn idi.
- Simülasyonu gerçekleştirmek için kullanılabilecek blok, iş parçacığı ve bilgi işlem platformu kapasitesinin sayısını tanımlayın. Bu parametreleri, mevcut grafik işlem biriminin (GPU) belirli özelliklerine göre tanımlayın.
NOT: Şekil 5'te gösterilen örnekte, 36 çoklu işlemcili bir GPU ve çok işlemcili başına 64 bilgi işlem platformu çekirdeği kullanıldığından, 36 blok ve blok başına 64 iş parçacığı (2304 bilgi işlem platformu çekirdeği) kullanılmıştır. Kullanılan bilgi işlem platformu yetenek parametresinin değeri, donanım bilgi işlem platformu yeteneği 7,5 olduğundan 75 idi (bu parametrelerle ilgili ayrıntılar için Ek Dosya 2'nin 10. bölümüne bakın). - Simülasyon günlüğü penceresini açmak için Simülasyonu Çalıştır düğmesine tıklayın. Simülasyonu başlatmak için Çalıştır düğmesine tıklayın ve gösterge görüntülenene kadar işlemi izleyin: 'Lütfen devam etmek için pencereyi kapatın'. Simülasyon günlüğü hakkında ayrıntılar için Ek Dosya 2'nin 12 . bölümüne bakın.
- Simülasyon sonuçlarını gözlemlemek için simülasyon günlüğü penceresini kapatın (bkz. Şekil 5). Simülasyon sonuçları ile ilgili detaylar Ek Dosya 2'nin 13. bölümünde verilmiştir.
6. Projeyi kaydedin (isteğe bağlı)
- Menü çubuğunda Dosya > Projeyi Dışa Aktar'ı tıklatın. Proje dosyasının kaydedileceği dizini seçin ve Tamam düğmesine tıklayın.
Not: Proje dosyasının adı, ilk veri dosyasının adına göre otomatik olarak belirlenir. Proje kaydedilmezse, tüm sonuçlar ve ilgili dosyalar otomatik olarak silinir. - Dosya > Projeyi Yükle'yi tıklatarak dışa aktarılan bir projeyi yükleyin.
7. Rakamları kaydet (isteğe bağlı)
- Geçerli görselleştirmeyi bir görüntü dosyasına kaydetmek için çizim araç çubuğunda bulunan Grafiği Kaydet Simgesini tıklatın. Protokol boyunca oluşturulan tüm rakamlar için bu adımı yineleyin.
NOT: Grafikler ve adacık görselleştirmeleri, grafik panelinin çizim araç çubuğunda bulunan simgeler kullanılarak değiştirilebilir.
8. Yük projesi (isteğe bağlı)
- Ana menüde Dosya > Proje Yükle'yi tıklatın ve 6.1-6.2 adımlarında açıklandığı gibi daha önce kaydedilmiş bir proje dosyası seçin.
NOT: Proje dosyası harici olarak değiştirilmişse, proje doğru yüklenmez. Bir proje başarıyla yüklenirse, yalnızca simülasyon yetenekleri kullanılabilir olacaktır.
9. Yeniden yapılanma sürecini ve analizini yeniden başlatın (isteğe bağlı)
- Kullanıcı istediği zaman tüm sonuçları atmak ve yeni bir yeniden yapılandırma ve analiz başlatmak için Dosya > Yeniden Başlat'ı seçebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Félix-Martínez ve ark.19 tarafından önerilen metodolojiyi kullanarak pankreas adacıklarının yeniden yapılandırılması, optimizasyon algoritmasına (rekonstrüksiyon ayarlarında tanımlanan) verilen parametrelere büyük ölçüde bağlıdır. Bunun bir örneği, farklı parametre kümeleri kullanılarak elde edilen yeniden yapılandırılmış adacıkların gösterildiği Şekil 3'te görsel olarak gösterilmiştir. İlk olarak, Şekil 3A'da, ilk verilerde yer alan hücrelerin% 86.6'sını içeren bir rekonstrüksiyon gösterilmiştir (588 hücreden 509'u, başlangıç sıcaklığı = 1, yineleme faktörü = 1, kabul faktörü = 1). Başlangıç sıcaklığı ve yineleme ve kabul faktörleri arttığında (başlangıç sıcaklığı = 10, yineleme faktörü = 5 ve kabul faktörü = 5, Şekil 3B), yeniden yapılandırılmış adacıklara (yani, 588 hücreden 549'u) başlangıç hücrelerinin daha yüksek bir yüzdesi (% 93.37) dahil edilmiştir. Yeniden yapılandırılmış adacığın başlangıç hücrelerinin %99,15'inden (588 hücreden 583'ü) oluştuğu Şekil 3C'de (başlangıç sıcaklığı = 10, yineleme faktörü = 1000, kabul faktörü = 500) gösterildiği gibi, özellikle yineleme ve kabul faktörleri için çok daha yüksek değerler kullanılırsa daha iyi sonuçlar elde edilebilir. Sıcaklığın bir fonksiyonu olarak üst üste binen hücrelerin evrimini gösteren yakınsama grafikleri (Şekil 3A-C'deki sağ sütun), parametrelerin optimizasyon işlemini nasıl etkilediğini belirlemek için değerlendirilmelidir. Genel bir kural olarak, yeniden yapılandırılmış adacık başlangıç hücrelerinin düşük bir yüzdesini içerdiğinde etkileşim ve kabul faktörleri arttırılmalıdır. Sonuç olarak, hesaplama süresi kaçınılmaz olarak artacaktır, çünkü bu faktörler değerlendirilen yineleme sayısını doğrudan arttırır. Örneğin, yukarıda açıklanan ilk rekonstrüksiyonun hesaplama süresi 6 sn idi. Buna karşılık, ikinci ve üçüncü rekonstrüksiyonların hesaplama süreleri sırasıyla 21 s ve 24 min 6 s idi.
Şekil 3: Rekonstrüksiyon ortamlarında optimal olmayan parametre kümeleri kullanılarak adacık rekonstrüksiyonu Optimal olmayan parametre kümelerinin kullanılması, yeniden yapılandırılmış adacıklarda düşük bir deney hücresi yüzdesine yol açabilir. (A) Solda: Deneysel hücrelerin% 86.6'sı yeniden yapılandırılmış adacığa dahil edildi (başlangıç sıcaklığı = 1, yineleme faktörü = 1, kabul faktörü = 1, hesaplama süresi = 6 s). Sağda: yeniden yapılanma sürecinin yakınsama grafiği. (B) Solda: Deneysel hücrelerin% 93.4'ü yeniden yapılandırılmış adacığa dahil edildi (başlangıç sıcaklığı = 10, yineleme faktörü = 10, kabul faktörü = 5, hesaplama süresi = 21 s). Sağda: yeniden yapılanma sürecinin yakınsama grafiği. (C) Solda: Deneysel hücrelerin% 99.15'i yeniden yapılandırılmış adacığa dahil edildi (başlangıç sıcaklığı = 10, yineleme faktörü = 1000, kabul faktörü = 500, hesaplama süresi = 24 dakika, 8 sn). Sağda: yeniden yapılanma sürecinin yakınsama grafiği. Yakınsama grafiklerindeki oklar, rekonstrüksiyon sürecinin üst üste binen ilk ve son sayı hücrelerini gösterir (rekonstrüksiyon algoritmasının işlem sonrası aşamasından önce). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Yeniden yapılandırılmış adacıktan hücreden hücreye temasların tanımlanması, Şekil 3A-C'de gösterilen yeniden yapılandırılmış mimarilerden tanımlanan hücreden hücreye temasların (siyah çizgilerle temsil edilen) sunulduğu Şekil 4A-C'de gösterildiği gibi temas toleransı parametresinin (yeniden yapılandırma ayarlarında tanımlanan) değerine bağlıdır. Örneğin, Şekil 4A'da olduğu gibi 1 μm'lik bir temas toleransı tanımlanırsa, yalnızca 290 hücreden hücreye temas tanımlanır. Buna karşılık, temas toleransı Şekil 4B,C'de olduğu gibi 2 μm'ye yükseltilirse, tespit edilen toplam kontaklar sırasıyla 636 ve 731'e yükselmiştir (bkz. Şekil 4A-C'deki istatistik paneli). Bu farklılıklar, Şekil 4A-C'nin sol sütununda gösterilen hücreden hücreye temasların görsel temsilinde de fark edilebilir, çünkü temas toleransının daha yüksek bir değeri kullanıldıkça hücreler arasındaki temas sayısı açıkça artar. Temas sayısının aynı zamanda yeniden yapılandırılmış adacıklara dahil edilen hücre sayısına da bağlı olduğunu ve bu nedenle, sıcaklık parametresinin, yinelemelerin ve kabul faktörlerinin ve temas toleransının kombinasyonunun, sonuçta oluşturulan adacık ağlarına ve ilgili ağ metriklerine yansıyan yeniden yapılandırılmış adacığın bağlantısını belirlediğini vurgulamakta fayda vardır. Şekil 4A-C'nin sağ sütununda gösterildiği gibi. Ağ grafiği, kullanıcının farklı hücrelerin nasıl bağlandığını görselleştirmesini sağlar. Kantitatif olarak, adacığın bağlantı özellikleri aşağıdaki ağ metrikleri açısından açıklanmıştır: ortalama derece, yoğunluk, ortalama kümeleme katsayısı, verimlilik ve çap (bu metriklerle ilgili ayrıntılara Ek Dosya 2'nin 9. bölümünde danışılabilir).
Şekil 4: Temas toleransı parametresinin hücreden hücreye temasların tanımlanmasındaki etkisi. (A-C) Sol: Şekil 3A-C'de gösterilen yeniden yapılandırılmış adacıklardan tanımlanan hücreden hücreye temaslar (sırasıyla A, B ve C panellerinde toplam 290, 636 ve 731 kontak). Temas toleransı parametresi için kullanılan değerler 1 μm (A) ve 2 μm (B ve C) idi. Yeniden yapılandırılan adacıklara dahil edilen hücre sayısının, tanımlanan hücreden hücreye temas sayısını da etkilediğini unutmayın. Sağ: Hücreden hücreye kişilerden oluşturulan ağlar ilgili sol sütunda gösterilir. Bağlantının ağ ölçümleri üzerindeki etkisinin istatistik panelinde vurgulandığını unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Son olarak, adacık yeniden yapılandırıldıktan ve hücreden hücreye temaslar tanımlandıktan sonra, işlevsel bir simülasyon gerçekleştirilebilir (yalnızca uyumlu bir GPU mevcut olduğunda). Tipik simülasyon sonuçları, farklı hücre popülasyonlarının (ɑ, β ve δ hücreler) ve tüm adacığın (Şekil 5'teki grafik panelinin üst grafiği) toplanmış salınımları dahil olmak üzere Şekil 5'te gösterilmiştir. Bu şekil, bağlantı ve etkileşim özelliklerinin bir sonucu olarak farklı hücre popülasyonları arasındaki zaman içindeki faz farklılıklarını gösterir ve kullanıcının her hücre popülasyonunun (kırmızı, yeşil ve mavi çizgiler) tüm adacığın salınım davranışına (siyah çizgi) katkısını belirlemesini sağlar. Örneğin, Şekil 5'in üst paneli, popülasyon düzeyinde, ɑ ve β hücrelerinin tamamen faz dışı salındığını, δ hücrelerinin ise ɑ ve β hücrelerle faz dışına salındığını göstermektedir. Dahası, simülasyona göre, adacığın salınım davranışına ɑ hücrelerinin salınımları hakimdir, ancak diğer hücre popülasyonlarının etkisi de fark edilebilir. Tüm adacık hücrelerinin salınım sinyallerinin otomatik olarak bir veri dosyasına kaydedildiğini unutmayın (Ek Dosya 2'deki Tablo 1 ve bölüm 13'e bakınız), böylece kullanıcının simülasyon sonuçlarının ayrıntılı bir analizini yapmasına izin verilir. Tamamlayıcı olarak, salınımların faz tutarlılığını yansıtan adacık senkronizasyon indeksi de hesaplanır ve görüntülenir (Şekil 5'teki grafik panelinin alt grafiği). Eşitleme dizininin 0 ile 1 arasında değiştiğini, burada 0 ve 1'in adacıktaki tüm hücreler arasında sırasıyla boş ve toplam eşitlemeyi gösterdiğini unutmayın. Bu nedenle senkronizasyon indeksi grafiği, yeniden yapılandırılmış adacığın bağlantı ve etkileşim özelliklerinin bir sonucu olarak adacık hücreleri arasındaki eşzamanlılığın zaman içinde nasıl değiştiğinin bir görselleştirmesi olarak yorumlanabilir. Yapılan simülasyon, birleştirilmiş osilatörler12 fikrine dayandığından ve büyük ölçüde yeniden yapılandırılmış adacığın bağlantısına bağlı olduğundan, işlevsel bir simülasyon gerçekleştirmeden önce kabul edilebilir bir adacık rekonstrüksiyonuna ve hücreden hücreye bağlantıya ulaşmak önemlidir.
Şekil 5: Simülasyon parametreleri, simülasyon sekmesinin konfigürasyon panelinde tanımlanmıştır. Simülasyonun sonuçları, farklı hücre popülasyonlarının (ɑ, β ve δ) ve tüm adacığın (üstte) toplam salınımlı davranışının gösterildiği grafik panelinin simülasyon sekmesinde gösterilir. Adacık hücreleri arasındaki faz tutarlılığının bir ölçüsü olan senkronizasyon indeksi de gösterilmiştir (altta). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Pratik olarak sürecin her adımında veri dosyalarının oluşturulduğunu belirtmekte fayda var. Oluşturulan veri dosyalarının açıklaması Tablo 1'de ve Ek Dosya 2'de bulunabilir.
| Dosya | Tarif |
| IsletFileName | Giriş verileri (kullanıcı tarafından verilir) |
| IsletFileName_initial.txt | Algoritma tarafından yeniden yapılanmanın ilk adımı olarak önerilen ilk adacık mimarisi |
| IsletFileName_reconstructed.txt | Yeniden yapılandırılmış adacık (posptrocessed değil) |
| IsletFileName_postprocessed_islet.txt | Yeniden inşa edilen son adacık ve postrocessed adacık |
| IsletFileName_processlog.txt | Rekonstrüksiyon günlüğü (optimizasyon algoritması) |
| IsletFileName_overlapped_cells.txt | Rekonstrüksiyon sürecinin sonunda üst üste binen hücreler (postprocessing) |
| IsletFileName_all_contacts.txt | Tüm kişilerin adjancency matrisi |
| IsletFileName_aa_contacts.txt | ɑ-ɑ kontaklarının adjancency matrisi |
| IsletFileName_ab_contacts.txt | ɑ-β kontakların adjancency matrisi |
| IsletFileName_ad_contacts.txt | ɑ-δ kontakların adjancency matrisi |
| IsletFileName_bbbd_contacts.txt | β β ve β δ kontakların adjancency matrisi |
| IsletFileName_bb_contacts.txt | β β kişilerin adjancency matrisi |
| IsletFileName_bd_contacts.txt | β δ kişilerin adjancency matrisi |
| IsletFileName_dd_contacts.txt | δ δ kişilerin adjancency matrisi |
| IsletFileName_Kmat.txt | Simülasyonda kullanılan etkileşim matrisi |
| IsletFileName_kuramoto_angles.txt | Kuramoto simülasyonunun sonuçları |
Tablo 1: Proje dosyasının bir parçası olarak kaydedilen dosyaların açıklaması. Proje dosyalarını kaydetmek için kullanılan dosya adının, kullanıcı tarafından seçilen ilk veri dosyası tarafından otomatik olarak tanımlandığını unutmayın.
Ek Dosya 1: IsletLab'ın kontrol panellerini kullanarak protokolün grafiksel açıklaması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 2: IsletLab belgeleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 3: IsletLab'ı yüklemek için gereken tüm dosyaları içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki protokol, yeni hesaplama algoritmaları kullanarak pankreas adacık mimarilerini yeniden yapılandırmak ve analiz etmek için pratik bir yaklaşımı özetlemektedir. Bu çalışmanın temel amacı, adacık araştırma topluluğunun, pankreas adacık mimarilerinin morfolojik ve bağlantı özelliklerini karakterize etmek için nicel metrikler elde etmesini sağlamak ve bu özelliklerin olası işlevsel etkilerini hesaplamalı simülasyonlar yoluyla değerlendirmektir.
Bu protokolde benimsenen algoritmalar daha önce12,19 ayrıntılı olarak tanımlanmış olsa da, göreceli karmaşıklıkları nedeniyle doğrudan ve kullanıcı dostu bir uygulama eksikti, bu nedenle deneysel ve teorik çalışmalara tamamlayıcı bir araç olarak kullanımlarını sınırladılar.
İlk olarak, Félix-Martínez ve ark.19 tarafından önerilen yeni bir algoritma, adacık mimarilerini deneysel verilerden (örneğin, nükleer koordinatlar ve hücre tipi) yeniden yapılandırmak için kullanılır. Sonuç olarak, kullanıcı, rapor edilen deneysel dağılımlara uygun olarak otomatik olarak atanan yarıçapa sahip, örtüşmeyen küresel hücrelerden oluşan bir adacık mimarisi elde eder. Uygulamada, rekonstrüksiyon algoritması, adacıktaki hücre sayısı arttıkça hesaplama açısından pahalı hale gelen yinelemeli bir optimizasyon prosedürüdür. Bu nedenle, bu protokolde açıklanan algoritmanın paralel işleme uygulamasından yararlanmak için çok işlemcili bir sistem kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Yukarıda açıklandığı gibi, yeniden yapılandırma işlemi için önemli bir adım, ilgili parametreler (yinelemeler, kabul faktörleri ve başlangıç sıcaklığı) için uygun değerleri tanımlamaktır, çünkü hesaplama süresi, kullanılan paralel işlemlerin sayısına ek olarak gerçekleştirilen yineleme sayısıyla doğrudan ilişkili olacaktır (yani, yeniden yapılandırma ayarlarındaki iş parçacıkları parametresi). Hesaplama süresi bir sorun değilse, gerçekleştirilen yineleme sayısını artırmak için yinelemeler ve kabul faktörleri için mümkün olan en yüksek değerlerin kullanılmasını kesinlikle öneririz.
Protokolün sonraki adımları, hücreden hücreye temasların tanımlanması ve adacık ağının oluşturulmasıdır. Her iki adım da doğrudan rekonstrüksiyon süreci ile ilgilidir ve bu nedenle, yeniden yapılandırılmış adacıklara dahil edilen hücrelerin sayısı (ve dolayısıyla ilgili parametreler) ve kullanılan temas toleransının değeri, mümkün olan en iyi sonuçları elde etmenin anahtarıdır.
Son olarak, kullanıcı tarafından istenirse, salınım sistemini yapılandırmak için yeniden yapılandırma işleminden türetilen bağlantı ağı kullanılarak Hoang ve ark.12 tarafından önerilen birleştirilmiş osilatörler modelinin uygulanması yoluyla fonksiyonel simülasyonlar gerçekleştirilebilir. Simülasyon işleminin yüzlerce veya binlerce bağlı diferansiyel denklemden oluşan bir sistemi (adacıktaki her hücre için bir tane) çözmeyi içerdiği göz önüne alındığında, simülasyon algoritması, GPU'yu kullanarak paralel hesaplamalar yapma olasılığından yararlanarak uygulanmıştır, böylece kullanıcının nispeten kısa bir hesaplama süresinde önemli miktarda uzun simülasyonları simüle etmesine izin verilmiştir. Protokolün simülasyon aşamasındaki temel adımlar, simülasyon panelinin bilgi işlem platformu ayarları bölümünde bulunan ve kullanılan donanımın özellikleriyle doğrudan ilgili bir özellik olan uygun sayıda blok ve iş parçacığı belirlemektir. İlgili diğer parametreler (simülasyon panelindeki içsel frekans, başlangıç aşaması ve etkileşim güçleri), simülasyon sonuçlarıyla ilgili olmasına rağmen, esas olarak incelenen problemle ilgilidir ve istenen simülasyon senaryosunu temsil etmek için düşünceli bir değerlendirmeden sonra kullanıcı tarafından tanımlanmalıdır.
Protokolün sunduğu avantajlara rağmen, bazı sınırlamalar kabul edilmelidir. İlk olarak, rekonstrüksiyon süreci ve hücreden hücreye temasların tanımlanması ile ilgili parametreler benzersiz değildir ve durumdan duruma değişebilir. Bu nedenle, gerekli parametrelerin değerini belirlemek için bir temel kural kullanılabilse de, bir deneme yanılma yaklaşımı hala kaçınılmazdır. Protokolün uygulanabilirliğini sınırlayabilecek bir diğer husus, özellikle protokolün yeniden yapılanma ve simülasyon aşamaları için ihtiyaç duyulan hesaplama kaynaklarıdır. Bu sınırlamalara rağmen, protokolün uygulanması için programlama bilgisine ihtiyaç duyulmaması, farklı geçmişlerden gelen araştırmacıların, aksi takdirde uzman olmayan kullanıcı için belirsiz kalacak olan önerilen algoritmaları kolayca kullanmalarını sağlar.
Önerilen protokolün potansiyel kullanımları arasında deneysel verilerin görselleştirilmesi, normal ve değiştirilmiş adacıkların karşılaştırmalı analizi (örneğin, tip 1 veya 2 diyabet varlığında) veya hatta nicel morfolojik, yapısal ve ağ tabanlı metrikler kullanılarak farklı türlerden adacıklar arasında karşılaştırmayer almaktadır 23. Ayrıca, burada özetlenen protokolü kullanarak yeniden yapılandırılmış adacıklar, yeniden yapılandırılmış adacıklar içindeki hücreler arası iletişimin işlevsel etkilerini aydınlatmak için rekonstrüksiyon algoritması tarafından belirlenen bağlantı ve hücre boyutlarının pankreas hücrelerinin ayrıntılı elektrofizyolojik modelleriyle tamamlandığı ayrıntılı fonksiyonel matematiksel modeller oluşturmak için kolayca kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
G.J. Félix-Martínez, CONACYT'e (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) ve Universidad Autónoma Metropolitana (México City) Elektrik Mühendisliği Bölümü'ne bu projeye verdikleri destek için teşekkür eder. Dr. Danh-Tai Hoang, Dr. Manami Hara ve Dr. Junghyo Jo'ya, bu çalışmayı mümkün kılan adacık mimarilerini araştırma topluluğuyla paylaşmadaki olağanüstü çalışmaları ve cömertlikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUDA-capable NVIDIA graphics card | Required for the functional simulations | ||
| IsletLab | https://github.com/gjfelix/IsletLab (Follow the instructions to download and install the application.) |
References
- Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells. ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).
- Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas. The Pancreas. Beger, H. G., Warshaw, A. L., Hruban, R. H., Buchler, M. W., Lerch, M. M., Neoptolemos, J. P., Shimosegawa, T., Whitcomb, D. C., GroB, C. , Wiley Online Library. (2018).
- Liao, E. P., Brass, B., Abelev, Z., Poretsky, L. Endocrine Pancreas. Principles of Diabetes Mellitus. Poretsky, L. , Springer. Cham. (2017).
- Noguchi, G. M., Huising, M. O. Integrating the inputs that shape pancreatic islet hormone release. Nature Metabolism. 1, 1189-1201 (2019).
- Pérez-Armendariz, E. M. Connexin 36, a key element in pancreatic beta cell function. Neuropharmacology. 75, 557-566 (2013).
- Briant, L., et al. δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. The Journal of Physiology. 596 (2), 197-215 (2018).
- Arrojoe Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Folli, F., et al. Pancreatic islet of Langerhans' cytoarchitecture and ultrastructure in normal glucose tolerance and in type 2 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 20, Suppl 2 137-144 (2018).
- Kilimnik, G., et al. Altered islet composition and disproportionate loss of large islets in patients with type 2 diabetes. PloS One. 6 (11), 27445 (2011).
- Hoang, D. T., et al. A Conserved Rule for Pancreatic Islet Organization. PloS One. 9 (10), 110384 (2014).
- Hoang, D. T., Hara, M., Jo, J. Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses. PloS One. 11 (4), 0152446 (2016).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Félix-Martinez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Mathematical models of electrical activity of the pancreatic β-cell: a physiological review. Islets. 6 (3), 949195 (2014).
- Félix-Martínez, G. J., González-Vélez, V., Godínez-Fernández, J. R., Gil, A. Electrophysiological models of the human pancreatic δ-cell: From single channels to the firing of action potentials. International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering. 36 (2), 3296 (2020).
- Watts, M., Sherman, A. Modeling the pancreatic α-cell: dual mechanisms of glucose suppression of glucagon secretion. Biophysical Journal. 106 (3), 741-751 (2014).
- Lei, C. L., et al. Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations. Islets. 10 (4), 151-167 (2018).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).
- Félix-Martínez, G. J., Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. Reconstructing human pancreatic islet architectures using computational optimization. Islets. 12 (6), 121-133 (2020).
- Hellman, B., Salehi, A., Gylfe, E., Dansk, H., Grapengiesser, E. Glucose generates coincident insulin and somatostatin pulses and antisynchronous glucagon pulses from human pancreatic islets. Endocrinology. 150 (12), 5334-5340 (2009).
- Hellman, B., Salehi, A., Grapengiesser, E., Gylfe, E. Isolated mouse islets respond to glucose with an initial peak of glucagon release followed by pulses of insulin and somatostatin in antisynchrony with glucagon. Biochemical and Biophysical Research Communications. 417 (4), 1219-1223 (2012).
- Félix-Martínez, G. J. IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures. Islets. 14 (1), 36-39 (2022).
- Félix-Martínez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets. Islets. 14 (1), 23-35 (2022).
