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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Reconstrucción computacional de islotes pancreáticos como herramienta de análisis estructural y funcional

Published: March 9, 2022 doi: 10.3791/63351
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Investigador por México (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México), , 2Department of Electrical Engineering, Universidad Autónoma Metropolitana

Summary

En este protocolo, los islotes pancreáticos se reconstruyen y analizan utilizando algoritmos computacionales implementados en una aplicación multiplataforma dedicada.

Abstract

Las propiedades estructurales de los islotes pancreáticos son clave para la respuesta funcional de las células secretoras de insulina, glucagón y somatostatina, debido a sus implicaciones en la comunicación intraisleta a través de la señalización eléctrica, paracrina y autocrina. En este protocolo, la arquitectura tridimensional de un islote pancreático se reconstruye en primer lugar a partir de datos experimentales utilizando un nuevo algoritmo computacional. A continuación, se obtienen las propiedades morfológicas y de conectividad del islote reconstruido, como el número y los porcentajes de los diferentes tipos de células, el volumen celular y los contactos de célula a célula. Luego, la teoría de redes se utiliza para describir las propiedades de conectividad del islote a través de métricas derivadas de la red, como el grado promedio, el coeficiente de agrupamiento, la densidad, el diámetro y la eficiencia. Finalmente, todas estas propiedades se evalúan funcionalmente a través de simulaciones computacionales utilizando un modelo de osciladores acoplados. En general, aquí describimos un flujo de trabajo paso a paso, implementado en IsletLab, una aplicación multiplataforma desarrollada específicamente para el estudio y simulación de islotes pancreáticos, para aplicar una novedosa metodología computacional para caracterizar y analizar islotes pancreáticos como complemento al trabajo experimental.

Introduction

El páncreas se divide en regiones conocidas como cabeza, cuello, cuerpo y cola, cada una con diferentes estructuras, funciones y posición anatómica 1,2. Desde un punto de vista funcional, el páncreas se puede dividir en sistemas endocrinos y exocrinos, siendo el primero responsable de la secreción de hormonas críticamente involucradas en la regulación de la homeostasis de la glucosa, mientras que el segundo contribuye a la digestión de los alimentos a través de la secreción de enzimas en el duodeno1. Los islotes pancreáticos constituyen el tejido endocrino del páncreas y son responsables de la secreción de glucagón, insulina y somatostatina, secretadas por las células ɑ, β y δ, respectivamente3. Además de sus mecanismos reguladores intrínsecos, estas células se regulan a través de la comunicación eléctrica directa (entre las células β y las células β y δ), y también por señalización paracrina y autocrina 4,5,6. Ambos mecanismos dependen en gran medida de la arquitectura de los islotes (es decir, de la composición y organización de los diferentes tipos de células dentro del islote)7,8. Es importante destacar que la arquitectura de los islotes se altera en presencia de diabetes, lo que probablemente perturbe la comunicación intraislet como resultado 9,10.

El estudio de los islotes pancreáticos implica una amplia gama de metodologías experimentales. Entre ellas, el uso de técnicas de fluorescencia para determinar el número, ubicación y tipo de las diferentes células del islote ha permitido estudiar las propiedades estructurales y morfológicas de los islotes pancreáticos 11,12,13 y conocer mejor las implicaciones funcionales en la salud y la enfermedad. Como complemento, en las últimas décadas se han utilizado modelos computacionales de células pancreáticas 14,15,16 y, más recientemente, de islotes pancreáticos 12,17,18,19 para evaluar aspectos difíciles o incluso imposibles de abordar experimentalmente.

En este protocolo, nuestro objetivo es cerrar la brecha entre el trabajo experimental y computacional al delinear una metodología para reconstruir arquitecturas de islotes, analizar sus propiedades morfológicas y de conectividad a través de métricas cuantitativas y realizar simulaciones básicas para evaluar las implicaciones funcionales de las propiedades de los islotes.

El protocolo que se describe a continuación se basa en algoritmos computacionales diseñados específicamente para el estudio de islotes pancreáticos. En resumen, en el primer paso del protocolo, la arquitectura de los islotes se reconstruye a partir de datos experimentales utilizando el algoritmo propuesto recientemente por Félix-Martínez et al.19 en el que se obtienen posiciones nucleares obtenidas mediante tinción de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y tipos celulares identificados mediante inmunofluorescencia (descritos en detalle por Hoang et al.11,12 ) se procesan en un procedimiento de optimización iterativa. Esto lleva a determinar el tamaño y la posición óptimos de cada célula y obtener un islote compuesto por células no superpuestas. En segundo lugar, sobre la base de la arquitectura reconstruida, se identifican contactos de celda a celda para determinar las propiedades de conectividad y generar la red de islotes correspondiente que permite al usuario obtener métricas cuantitativas para describir mejor la arquitectura de islotes (los detalles sobre el algoritmo de reconstrucción se pueden consultar en el trabajo original sobre el tema19). Finalmente, se realizan simulaciones funcionales básicas utilizando el enfoque de modelado propuesto por Hoang et al.12 en el que, en base a la naturaleza pulsátil de la secreción hormonal observada experimentalmente20,21, cada célula es tratada como un oscilador, y por lo tanto el islote se representa como una red de osciladores acoplados siguiendo las propiedades de conectividad del islote reconstruido.

Dada la complejidad computacional de los algoritmos utilizados en este protocolo, todos los pasos implicados se han implementado en una aplicación independiente22 con el objetivo principal de acercar estas herramientas computacionales a todos los lectores interesados independientemente de su nivel de experiencia en el uso de software especializado o lenguajes de programación.

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Protocol

NOTA: En la figura 1 se muestra un diagrama esquemático del protocolo. Una descripción paso a paso es la siguiente (consulte el Archivo complementario 1 para obtener detalles sobre los paneles de control utilizados en cada paso del protocolo).

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo. Un diagrama de flujo que describe el orden secuencial del protocolo tal como se implementa en IsletLab. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Instalación de IsletLab en Linux

NOTA: Siga las instrucciones dadas en las secciones 2 y 3 del Archivo complementario 2 para instalar IsletLab en Windows o macOS.

  1. Abra un navegador de Internet y vaya a https://github.com/gjfelix/IsletLab. Descargue y extraiga los archivos del repositorio de IsletLab.
    NOTA: El Archivo Suplementario 3 incluye una copia de la versión de IsletLab utilizada en este protocolo.
  2. Compruebe que los compiladores gcc y nvcc están instalados. Abra un terminal y escriba los siguientes comandos:
    gcc --versión
    nvcc --versión
    Siga las instrucciones enumeradas en la sección 1 del archivo complementario 2 si el sistema no reconoce alguno de estos comandos.
  3. Descargue e instale la plataforma de ciencia de datos (consulte la Tabla de materiales). Abra un terminal y vaya a la carpeta IsletLab.
  4. Cree un nuevo entorno escribiendo el siguiente comando en el terminal:
    conda env create -f isletlabgui_v1.0.yml
  5. Active el nuevo entorno escribiendo:
    conda activar isletlab_v1.0
  6. Inicie la aplicación IsletLab escribiendo el siguiente comando en el terminal (consulte la Figura 2 para obtener una descripción de la ventana principal):
    python isletlabgui_v1.0.py

Figure 2
Figura 2: La interfaz de usuario de IsletLab. La interfaz se compone de tres paneles principales: configuración (1), estadísticas (2) y gráficos (3). La barra de herramientas de gráficos (4) se encuentra en la parte inferior del panel de gráficos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Reconstrucción de islotes

  1. Prepare los datos de entrada. Organice los datos de los islotes de entrada (es decir, los tipos de celda y las coordenadas tridimensionales (3D)) en un archivo de cuatro columnas en el que la columna 1 contiene el tipo de celda (codificada como 11: ɑ-cell, 12: β-cell, 13: δ-cell) y las columnas 2 a 4 contienen las coordenadas x, y y z, respectivamente (consulte un extracto de un archivo de entrada en la sección 5 del Archivo suplementario 2 o el archivo de prueba de entrada incluido en el repositorio isletLab).
  2. Asegúrese de que el archivo de entrada no incluya encabezados de columna. Utilice el archivo de entrada de ejemplo incluido en el repositorio de IsletLab para seguir el protocolo si es necesario (Input_Islet_test.txt).
    NOTA: Los datos de entrada utilizados para desarrollar los algoritmos implementados en IsletLab se obtuvieron experimentalmente según lo descrito en detalle por Hoang et al.11,12 utilizando tinción DAPI para determinar las posiciones nucleares e inmunofluorescencia para identificar los tipos celulares.
  3. Haga clic en el botón Cargar islote inicial y seleccione el archivo que contiene los datos de entrada para generar un islote inicial, la representación 3D y las estadísticas correspondientes. En caso de error, se mostrará el siguiente mensaje: 'Error al cargar el archivo de islotes'. Para corregir esto, repita el paso 2.1.
  4. Configure el proceso de reconstrucción. Haga clic en el botón Configuración de reconstrucción y modifique los parámetros de optimización (consulte las secciones 4 y 5 del Archivo complementario 2 para obtener una breve descripción del algoritmo y los parámetros que se muestran en la ventana de configuración de reconstrucción).
  5. Establezca la temperatura inicial = 1, el factor de iteraciones = 1 y el factor de aceptación = 1. Haga clic en el botón Aceptar para guardar los valores de los parámetros.
    NOTA: Como regla general, un aumento en el parámetro de temperatura, así como en las iteraciones y los factores de aceptación, producirá mejores resultados de reconstrucción en términos de las células experimentales incluidas en el islote reconstruido a expensas de un aumento en el tiempo de cómputo.
  6. Haga clic en el botón Reconstruir islote para abrir la ventana del registro de reconstrucción (consulte la sección 6 del archivo complementario 2 para obtener una descripción de la información proporcionada en el registro de reconstrucción).
  7. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar el proceso de reconstrucción. Supervise el proceso de optimización hasta que aparezca el mensaje: 'Cierre esta ventana para continuar'. Cierre la ventana del registro de reconstrucción para generar la representación visual del islote reconstruido y calcular las estadísticas relacionadas (consulte la columna de la izquierda en la Figura 3A-C).
  8. Evalúe los resultados del proceso de reconstrucción analizando las estadísticas de optimización que se muestran en la pestaña de islote final del panel de estadísticas. En particular, centrarse en maximizar el porcentaje de células experimentales incluidas en los islotes reconstruidos (% de los experimentales) o, equivalentemente, en minimizar el número de superposiciones (también se muestra gráficamente en la gráfica de convergencia, columna derecha en la Figura 3A-C).
  9. Si el % de estadística experimental se considera bajo de acuerdo con los objetivos del usuario, reinicie IsletLab como se describe en el paso 9.1 y aumente la temperatura inicial, el factor de iteraciones y el factor de aceptación en la configuración de reconstrucción y repita los pasos 2.1-2.4 hasta que se obtengan resultados satisfactorios (> el 95% de las células experimentales). Véanse las secciones 5 a 7 del expediente complementario 2 para obtener una descripción más detallada del proceso de reconstrucción y los resultados conexos.

3. Identificación de contactos de célula a célula

  1. Haga clic en el botón Configuración de reconstrucción y establezca el parámetro Tolerancia de contacto para definir la tolerancia de contacto de celda a celda y haga clic en Aceptar para guardar los valores de los parámetros.
    NOTA: El parámetro de tolerancia de contacto representa la distancia máxima entre celdas para ser considerada como en contacto.
  2. Haga clic en el botón Contactos de celda a celda para identificar las celdas en contacto cercano. En la pestaña contactos, compruebe si hay celdas en contacto que se muestran gráficamente (líneas negras) en el panel gráfico y las estadísticas correspondientes (es decir, contactos totales, homotípicos y heterotípicos y contactos ɑ-ɑ, β-β, δ-δ, ɑ-β, ɑ-δ, β-δ contactos) que se muestran en el panel de estadísticas (consulte la columna izquierda de la Figura 4A-C).
  3. Aumentar (disminuir) el parámetro de tolerancia de contacto para aumentar (disminuir) el número de contactos de celda a celda. Consulte la sección 8 del Archivo Complementario 2 para obtener detalles sobre la identificación de contactos de célula a célula y los resultados asociados.

4. Construcción de la red de islotes

  1. Haga clic en el botón Generar red para generar la red de islotes y calcular las métricas de red asociadas (consulte la columna derecha de la figura 4A-C).
    NOTA: Una descripción adicional de los resultados relacionados con la red de islotes generada se da en la sección 9 del Archivo Suplementario 2.

5. Simulación funcional del islote reconstruido

  1. Cambie a la ficha Simulación del panel de configuración de la interfaz (Figura 5).
  2. Seleccione el modo deseado de frecuencia intrínseca - Constante o Aleatorio - y haga clic en el botón Configurar frecuencia intrínseca para definir la frecuencia de los osciladores (en Hz). Si se selecciona una frecuencia intrínseca aleatoria, defina la media y la desviación (en Hz) para generar frecuencias aleatorias normalmente distribuidas (consulte la sección 11 del Archivo Complementario 2 para obtener una descripción de los parámetros de simulación).
  3. Seleccione el modo deseado de la fase inicial : constante o aleatorio. Si se selecciona una fase inicial constante, haga clic en el botón Configurar fase inicial para definir la fase de los osciladores (en radianes). Si se selecciona la fase inicial aleatoria, el sistema asignará fases aleatorias entre 0 y 2π a todos los osciladores.
    NOTA: Si se selecciona una fase inicial constante, todos los osciladores se inicializarán en fase.
  4. Haga clic en el botón Configurar interacciones para definir los parámetros de interacción de celda a celda en la ventana de intensidad de interacción. Para obtener una descripción de los parámetros de interacción, consulte la sección 11 del Archivo complementario 2.
  5. Configure la simulación definiendo el tiempo total de simulación (en s), el paso de tiempo (en s) y el factor de ahorro (número de pasos entre los puntos de datos guardados). En la simulación mostrada en la Figura 5 el tiempo total fue de 20000 s, con un paso temporal de 0,1 s y un factor de ahorro de 500.
  6. Defina el número de bloques, subprocesos y capacidad de plataforma informática disponibles para realizar la simulación. Defina estos parámetros de acuerdo con las características específicas de la unidad de procesamiento de gráficos (GPU) disponible.
    NOTA: En el ejemplo que se muestra en la Figura 5, se utilizaron 36 bloques y 64 hilos por bloque (2304 núcleos de plataforma de computación) ya que se utilizó una GPU con 36 multiprocesadores y 64 núcleos de plataforma de computación por multiprocesador. El valor del parámetro de capacidad de la plataforma informática utilizada fue de 75, ya que la capacidad de la plataforma de computación por hardware fue de 7,5 (consulte la sección 10 del archivo complementario 2 para obtener detalles sobre estos parámetros).
  7. Haga clic en el botón Ejecutar simulación para abrir la ventana de registro de simulación. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar la simulación y supervisar el proceso hasta que se muestre la leyenda: 'Cierre la ventana para continuar'. Consulte la sección 12 del archivo complementario 2 para obtener detalles sobre el registro de simulación.
  8. Cierre la ventana de registro de simulación para observar los resultados de la simulación (consulte la figura 5). Los detalles sobre los resultados de la simulación se dan en la sección 13 del Archivo Complementario 2.

6. Guardar el proyecto (opcional)

  1. Haga clic en Archivo > Exportar proyecto en la barra de menús. Seleccione el directorio en el que se guardará el archivo de proyecto y haga clic en el botón Aceptar .
    Nota : el nombre del archivo de proyecto se determina automáticamente en función del nombre del archivo de datos inicial. Si el proyecto no se guarda, todos los resultados y archivos relacionados se eliminarán automáticamente.
  2. Cargue un proyecto exportado haciendo clic en Archivo > Cargar proyecto.

7. Guardar cifras (opcional)

  1. Haga clic en el icono Guardar trazado situado en la barra de herramientas de trazado para guardar la visualización actual en un archivo de imagen. Repita este paso para todas las figuras creadas a lo largo del protocolo.
    NOTA: Las gráficas y visualizaciones de islotes se pueden modificar utilizando los iconos disponibles en la barra de herramientas de gráficos del panel gráfico.

8. Cargar proyecto (opcional)

  1. Haga clic en Archivo > Cargar proyecto en el menú principal y seleccione un archivo de proyecto guardado anteriormente como se describe en los pasos 6.1-6.2.
    Nota : un proyecto no se cargará correctamente si el archivo de proyecto se ha modificado externamente. Si un proyecto se carga correctamente, solo estarán disponibles las capacidades de simulación.

9. Reinicie el proceso de reconstrucción y análisis (opcional)

  1. En cualquier momento el usuario puede seleccionar Archivo > Reiniciar para descartar todos los resultados e iniciar una nueva reconstrucción y análisis.

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Representative Results

La reconstrucción de islotes pancreáticos utilizando la metodología propuesta por Félix-Martínez et al.19 depende en gran medida de los parámetros dados al algoritmo de optimización (definidos en los ajustes de reconstrucción). Un ejemplo de esto se muestra visualmente en la Figura 3 donde se muestran los islotes reconstruidos obtenidos utilizando diferentes conjuntos de parámetros. En primer lugar, en la Figura 3A, se muestra una reconstrucción que incluyó el 86,6% de las células incluidas en los datos iniciales (509 de 588 células, temperatura inicial = 1, factor de iteraciones = 1, factor de aceptación = 1). Cuando se aumenta la temperatura inicial y los factores de iteración y aceptación (temperatura inicial = 10, factor de iteraciones = 5 y factor de aceptación = 5, Figura 3B), un porcentaje mayor (93,37%) de células iniciales se incluyeron en los islotes reconstruidos (es decir, 549 de 588 células). Se pueden obtener resultados aún mejores si se utilizan valores mucho más altos, particularmente para los factores de iteración y aceptación, como se ilustra en la Figura 3C (temperatura inicial = 10, factor de iteraciones = 1000, factor de aceptación = 500), donde el islote reconstruido está compuesto por el 99,15% de las células iniciales (583 de 588 células). Los gráficos de convergencia (columna derecha en la Figura 3A-C), que muestran la evolución de las celdas superpuestas en función de la temperatura, deben evaluarse para determinar cómo los parámetros afectan el proceso de optimización. Como regla general, los factores de interacción y aceptación deben aumentarse cuando el islote reconstruido incluye un bajo porcentaje de células iniciales. En consecuencia, el tiempo de cómputo aumentará inevitablemente, ya que estos factores aumentan directamente el número de iteraciones evaluadas. Por ejemplo, el tiempo de cálculo de la primera reconstrucción descrita anteriormente fue de 6 s. En contraste, los tiempos de cómputo de la segunda y tercera reconstrucción fueron de 21 s y 24 min 6 s, respectivamente.

Figure 3
Figura 3: Reconstrucción de islotes utilizando conjuntos subóptimos de parámetros en la configuración de reconstrucción El uso de conjuntos subóptimos de parámetros podría conducir a un bajo porcentaje de células experimentales en los islotes reconstruidos. (A) Izquierda: El 86,6% de las células experimentales se incluyeron en el islote reconstruido (temperatura inicial = 1, factor de iteraciones = 1, factor de aceptación = 1, tiempo de cálculo = 6 s). Derecha: parcela de convergencia del proceso de reconstrucción. (B) Izquierda: El 93,4% de las células experimentales se incluyeron en el islote reconstruido (temperatura inicial = 10, factor de iteraciones = 10, factor de aceptación = 5, tiempo de cálculo = 21 s). Derecha: parcela de convergencia del proceso de reconstrucción. (C) Izquierda: El 99,15% de las células experimentales se incluyeron en el islote reconstruido (temperatura inicial = 10, factor de iteraciones = 1000, factor de aceptación = 500, tiempo de cálculo = 24 min, 8 s). Derecha: parcela de convergencia del proceso de reconstrucción. Las flechas en los gráficos de convergencia indican el número inicial y final de células superpuestas del proceso de reconstrucción (antes de la fase de postprocesamiento del algoritmo de reconstrucción). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La identificación de los contactos de celda a celda del islote reconstruido depende del valor del parámetro de tolerancia de contacto (definido en la configuración de reconstrucción) como se ilustra en la Figura 4A-C, donde se presentan los contactos de celda a celda (representados por líneas negras), identificados a partir de las arquitecturas reconstruidas que se muestran en la Figura 3A-C. Por ejemplo, si se define una tolerancia de contacto de 1 μm, como en la Figura 4A, solo se identifican 290 contactos de célula a célula. Por el contrario, si la tolerancia de contacto se incrementa a 2 μm, como en la Figura 4B,C, el total de contactos identificados aumentó a 636 y 731, respectivamente (véase el panel de estadísticas de la Figura 4A-C). Estas diferencias también se pueden notar en la representación visual de los contactos de celda a celda que se muestra en la columna izquierda de la Figura 4A-C, ya que el número de contactos entre celdas aumenta claramente a medida que se utiliza un valor más alto de la tolerancia de contacto. Vale la pena destacar que el número de contactos también depende del número de células incluidas en los islotes reconstruidos, y por lo tanto, la combinación del parámetro de temperatura, las iteraciones y los factores de aceptación, y la tolerancia de contacto determinan en última instancia la conectividad del islote reconstruido, que se refleja en las redes de islotes formadas y las métricas de red correspondientes, como se muestra en la columna derecha de la Figura 4A-C. El trazado de red permite al usuario visualizar cómo se conectan las diferentes celdas. Cuantitativamente, las propiedades de conectividad del islote se describen en términos de las siguientes métricas de red: grado medio, densidad, coeficiente de agrupamiento promedio, eficiencia y diámetro (los detalles sobre estas métricas se pueden consultar en la sección 9 del Archivo Complementario 2).

Figure 4
Figura 4: Efecto del parámetro de tolerancia de contacto en la identificación de contactos de célula a célula. (A-C) Izquierda: contactos de célula a célula identificados a partir de los islotes reconstruidos que se muestran en la Figura 3A-C (290, 636 y 731 contactos totales en los paneles A, B y C, respectivamente). Los valores utilizados para el parámetro de tolerancia de contacto fueron 1 μm (A) y 2 μm (B y C). Tenga en cuenta que el número de células incluidas en los islotes reconstruidos también afecta al número de contactos de célula a célula identificados. Derecha: las redes generadas a partir de los contactos de celda a celda se muestran en la columna izquierda correspondiente. Tenga en cuenta que el impacto de la conectividad en las métricas de red se destaca en el panel de estadísticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Finalmente, una vez que se ha reconstruido el islote y se han identificado los contactos de célula a célula, se puede realizar una simulación funcional (solo cuando se dispone de una GPU compatible). Los resultados típicos de la simulación se muestran en la Figura 5, incluidas las oscilaciones sumadas de las diferentes poblaciones celulares (ɑ, β y δ-células) y todo el islote (gráfico superior del panel gráfico en la Figura 5). Esta figura muestra las diferencias de fase a lo largo del tiempo entre las diferentes poblaciones celulares como resultado de las propiedades de conectividad e interacción y permite al usuario determinar la contribución de cada población celular (líneas roja, verde y azul) al comportamiento oscilatorio de todo el islote (línea negra). Por ejemplo, el panel superior de la Figura 5 sugiere que, a nivel de población, las células ɑ y β oscilan completamente fuera de fase, mientras que las células δ oscilan fuera de fase con las células ɑ y β. Además, según la simulación, el comportamiento oscilatorio del islote está dominado por las oscilaciones de las células ɑ, aunque también se puede notar el efecto de las otras poblaciones celulares. Tenga en cuenta que las señales oscilatorias de todas las celdas de los islotes se guardan automáticamente en un archivo de datos (consulte la Tabla 1 y la sección 13 en el Archivo complementario 2), lo que permite al usuario realizar un análisis detallado de los resultados de la simulación. Como complemento, también se calcula y muestra el índice de sincronización de islotes, que refleja la coherencia de fase de las oscilaciones (gráfico inferior del panel gráfico en la Figura 5). Tenga en cuenta que el índice de sincronización varía de 0 a 1, donde 0 y 1 indican una sincronización nula y total entre todas las celdas del islote, respectivamente. Por lo tanto, la gráfica del índice de sincronización puede interpretarse como una visualización de cómo la sincronicidad entre las celdas de los islotes varía con el tiempo como resultado de las propiedades de conectividad e interacción del islote reconstruido. Dado que la simulación realizada se basa en la idea de osciladores acoplados12 y depende en gran medida de la conectividad del islote reconstruido, es clave alcanzar una reconstrucción aceptable de islotes y conectividad de celda a celda antes de realizar una simulación funcional.

Figure 5
Figura 5: Los parámetros de simulación se definen en el panel de configuración de la ficha simulación. Los resultados de la simulación se muestran en la pestaña de simulación del panel gráfico donde se muestra el comportamiento oscilatorio sumado de las diferentes poblaciones de células (ɑ, β y δ) y todo el islote (arriba). También se muestra el índice de sincronización, una medida de la coherencia de fase entre las células de los islotes (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vale la pena mencionar que prácticamente en cada paso del proceso, se generan archivos de datos. Una descripción de los archivos de datos generados se puede encontrar en la Tabla 1 y en todo el Archivo Complementario 2.

Archivo Descripción
IsletFileName Datos de entrada (proporcionados por el usuario)
IsletFileName_initial.txt Arquitectura inicial de islotes propuesta por el algoritmo como paso inicial de la reconstrucción
IsletFileName_reconstructed.txt Islote reconstruido (no posptrocesado)
IsletFileName_postprocessed_islet.txt Islote final reconstruido e islote postrocesado
IsletFileName_processlog.txt Registro de reconstrucción (algoritmo de optimización)
IsletFileName_overlapped_cells.txt Células superpuestas al final del proceso de reconstrucción (postprocesamiento)
IsletFileName_all_contacts.txt Matriz de adjancency de todos los contactos
IsletFileName_aa_contacts.txt Matriz de adjancency de contactos ɑ-ɑ
IsletFileName_ab_contacts.txt Matriz de admisión de contactos ɑ-β
IsletFileName_ad_contacts.txt Matriz de adjancency de contactos ɑ-δ
IsletFileName_bbbd_contacts.txt Matriz de aplazamiento de contactos β-β y β-δ
IsletFileName_bb_contacts.txt Matriz de β-β contactos
IsletFileName_bd_contacts.txt Matriz de β-δ contactos
IsletFileName_dd_contacts.txt Matriz de δ-δ contactos
IsletFileName_Kmat.txt Matriz de interacción utilizada en la simulación
IsletFileName_kuramoto_angles.txt Resultados de la simulación de Kuramoto

Tabla 1: Descripción de los archivos guardados como parte del archivo de proyecto. Tenga en cuenta que el nombre de archivo utilizado para guardar los archivos de proyecto se define automáticamente por el archivo de datos inicial seleccionado por el usuario.

Expediente complementario 1: Descripción gráfica del protocolo utilizando los paneles de control de IsletLab. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente Complementario 2: Documentación de IsletLab. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 3: Incluye todos los archivos necesarios para instalar IsletLab. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El protocolo anterior describe un enfoque práctico para reconstruir y analizar arquitecturas de islotes pancreáticos utilizando nuevos algoritmos computacionales. El objetivo principal de este trabajo es permitir a la comunidad investigadora de islotes derivar métricas cuantitativas para caracterizar las propiedades morfológicas y de conectividad de las arquitecturas de islotes pancreáticos y evaluar las posibles implicaciones funcionales de dichas propiedades a través de simulaciones computacionales.

Si bien los algoritmos adoptados en este protocolo han sido descritos previamente en detalle12,19, faltaba una implementación directa y fácil de usar debido a su relativa complejidad, limitando así su uso como herramienta complementaria al trabajo experimental y teórico.

En primer lugar, un algoritmo reciente propuesto por Félix-Martínez et al.19 se utiliza para reconstruir las arquitecturas de islotes a partir de datos experimentales (por ejemplo, coordenadas nucleares y tipo de célula). Como resultado, el usuario obtiene una arquitectura de islotes compuesta por células esféricas no superpuestas con radios asignados automáticamente de acuerdo con las distribuciones experimentales reportadas. En la práctica, el algoritmo de reconstrucción es un procedimiento de optimización iterativa que se vuelve costoso desde el punto de vista computacional a medida que aumenta el número de células en el islote. Por esta razón, es muy recomendable utilizar un sistema multiprocesador para aprovechar la implementación de procesamiento paralelo del algoritmo descrito en este protocolo. Como se describió anteriormente, un paso clave para el proceso de reconstrucción es definir valores apropiados para los parámetros involucrados (es decir, iteraciones, factores de aceptación y temperatura inicial), ya que el tiempo de cálculo estará directamente relacionado con el número de iteraciones realizadas, además del número de procesos paralelos utilizados (es decir, el parámetro de subprocesos en la configuración de reconstrucción). Si el tiempo de cálculo no es un problema, recomendamos encarecidamente utilizar los valores más altos posibles para las iteraciones y los factores de aceptación con el fin de aumentar el número de iteraciones realizadas.

Los siguientes pasos del protocolo son la identificación de contactos de célula a célula y la generación de la red de islotes. Ambos pasos están directamente relacionados con el proceso de reconstrucción y, como tal, el número de células incluidas en los islotes reconstruidos (y por lo tanto los parámetros involucrados), así como el valor de la tolerancia de contacto utilizada, es clave para obtener los mejores resultados posibles.

Finalmente, si así lo desea el usuario, se pueden realizar simulaciones funcionales mediante la implementación del modelo de osciladores acoplados propuesto por Hoang et al.12 utilizando la red de conectividad derivada del proceso de reconstrucción para configurar el sistema oscilatorio. Dado que el proceso de simulación implica resolver un sistema de cientos o miles de ecuaciones diferenciales acopladas (una para cada celda del islote), se ha implementado el algoritmo de simulación aprovechando la posibilidad de realizar cálculos paralelos utilizando la GPU, permitiendo así al usuario simular simulaciones largas considerables en un tiempo de cómputo relativamente corto. Los pasos clave en la etapa de simulación del protocolo son determinar el número apropiado de bloques y subprocesos disponibles en la sección de configuración de la plataforma informática del panel de simulación, un aspecto directamente relacionado con las características del hardware utilizado. Los otros parámetros involucrados (frecuencia intrínseca, fase inicial y fortalezas de interacción en el panel de simulación), aunque relevantes para los resultados de la simulación, están relacionados principalmente con el problema bajo investigación y deben ser definidos por el usuario después de una consideración cuidadosa para representar el escenario de simulación deseado.

A pesar de las ventajas que ofrece el protocolo, hay que reconocer algunas limitaciones. En primer lugar, los parámetros relacionados con el proceso de reconstrucción y la identificación de los contactos de célula a célula no son únicos y pueden variar de un caso a otro. Por esta razón, aunque se puede utilizar una regla general para determinar el valor de los parámetros requeridos, un enfoque de prueba y error sigue siendo inevitable. Otro aspecto que podría limitar la aplicabilidad del protocolo son los recursos computacionales necesarios, particularmente para las etapas de reconstrucción y simulación del protocolo. A pesar de estas limitaciones, el hecho de que el conocimiento de programación no sea necesario para la implementación del protocolo permite a los investigadores de diversos orígenes hacer uso fácilmente de los algoritmos propuestos que de otro modo permanecerían oscuros para el usuario no especializado.

Los usos potenciales del protocolo propuesto incluyen la visualización de datos experimentales, el análisis comparativo de islotes normales y alterados (por ejemplo, en presencia de diabetes tipo 1 o 2), o incluso la comparación entre islotes de diferentes especies utilizando métricas morfológicas cuantitativas, estructurales y basadas en redes23. Además, los islotes reconstruidos utilizando el protocolo descrito aquí se pueden utilizar fácilmente para generar modelos matemáticos funcionales detallados en los que la conectividad y los tamaños de células determinados por el algoritmo de reconstrucción se complementan con modelos electrofisiológicos detallados de células pancreáticas para dilucidar las implicaciones funcionales de la comunicación intercelular dentro de los islotes reconstruidos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

G.J. Félix-Martínez agradece al CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) y al Departamento de Ingeniería Eléctrica de la Universidad Autónoma Metropolitana (Ciudad de México) por el apoyo brindado a este proyecto. Agradecemos al Dr. Danh-Tai Hoang, al Dr. Manami Hara y al Dr. Junghyo Jo por su excelente trabajo y generosidad al compartir las arquitecturas de islotes que hicieron posible este trabajo con la comunidad de investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CUDA-capable NVIDIA graphics card Required for the functional simulations
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References

  1. Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells. ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).
  2. Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas. The Pancreas. Beger, H. G., Warshaw, A. L., Hruban, R. H., Buchler, M. W., Lerch, M. M., Neoptolemos, J. P., Shimosegawa, T., Whitcomb, D. C., GroB, C. , Wiley Online Library. (2018).
  3. Liao, E. P., Brass, B., Abelev, Z., Poretsky, L. Endocrine Pancreas. Principles of Diabetes Mellitus. Poretsky, L. , Springer. Cham. (2017).
  4. Noguchi, G. M., Huising, M. O. Integrating the inputs that shape pancreatic islet hormone release. Nature Metabolism. 1, 1189-1201 (2019).
  5. Pérez-Armendariz, E. M. Connexin 36, a key element in pancreatic beta cell function. Neuropharmacology. 75, 557-566 (2013).
  6. Briant, L., et al. δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. The Journal of Physiology. 596 (2), 197-215 (2018).
  7. Arrojoe Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
  8. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  9. Folli, F., et al. Pancreatic islet of Langerhans' cytoarchitecture and ultrastructure in normal glucose tolerance and in type 2 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 20, Suppl 2 137-144 (2018).
  10. Kilimnik, G., et al. Altered islet composition and disproportionate loss of large islets in patients with type 2 diabetes. PloS One. 6 (11), 27445 (2011).
  11. Hoang, D. T., et al. A Conserved Rule for Pancreatic Islet Organization. PloS One. 9 (10), 110384 (2014).
  12. Hoang, D. T., Hara, M., Jo, J. Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses. PloS One. 11 (4), 0152446 (2016).
  13. Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).
  14. Félix-Martinez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Mathematical models of electrical activity of the pancreatic β-cell: a physiological review. Islets. 6 (3), 949195 (2014).
  15. Félix-Martínez, G. J., González-Vélez, V., Godínez-Fernández, J. R., Gil, A. Electrophysiological models of the human pancreatic δ-cell: From single channels to the firing of action potentials. International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering. 36 (2), 3296 (2020).
  16. Watts, M., Sherman, A. Modeling the pancreatic α-cell: dual mechanisms of glucose suppression of glucagon secretion. Biophysical Journal. 106 (3), 741-751 (2014).
  17. Lei, C. L., et al. Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations. Islets. 10 (4), 151-167 (2018).
  18. Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).
  19. Félix-Martínez, G. J., Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. Reconstructing human pancreatic islet architectures using computational optimization. Islets. 12 (6), 121-133 (2020).
  20. Hellman, B., Salehi, A., Gylfe, E., Dansk, H., Grapengiesser, E. Glucose generates coincident insulin and somatostatin pulses and antisynchronous glucagon pulses from human pancreatic islets. Endocrinology. 150 (12), 5334-5340 (2009).
  21. Hellman, B., Salehi, A., Grapengiesser, E., Gylfe, E. Isolated mouse islets respond to glucose with an initial peak of glucagon release followed by pulses of insulin and somatostatin in antisynchrony with glucagon. Biochemical and Biophysical Research Communications. 417 (4), 1219-1223 (2012).
  22. Félix-Martínez, G. J. IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures. Islets. 14 (1), 36-39 (2022).
  23. Félix-Martínez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets. Islets. 14 (1), 23-35 (2022).

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Bioingeniería Número 181
Reconstrucción computacional de islotes pancreáticos como herramienta de análisis estructural y funcional
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Félix-Martínez, G. J., Nicolás-Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. Computational Reconstruction of Pancreatic Islets as a Tool for Structural and Functional Analysis. J. Vis. Exp. (181), e63351, doi:10.3791/63351 (2022).

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