Summary
نقدم بروتوكولا لفحص المركبات المضادة لفيروس التهاب الكبد B (HBV) التي تستهدف مراحل دورة حياة الدخول قبل وبعد الفيروس، باستخدام كالوريمتر المعايرة متساوي الحرارة لقياس تقارب الارتباط (KD) مع ببتيد ببتيد النقل المشترك لتوروكولات الصوديوم المضيف. تم تحديد الفعالية المضادة للفيروسات من خلال قمع علامات دورة الحياة الفيروسية (تكوين cccDNA ، والنسخ ، والتجميع الفيروسي).
Abstract
تعتبر عدوى فيروس التهاب الكبد B (HBV) عامل خطر حاسم لسرطان الخلايا الكبدية. العلاج الحالي يمكن أن يقلل فقط من الحمل الفيروسي ولكن لا يؤدي إلى مغفرة كاملة. من شأن نموذج خلايا الكبد الفعال لعدوى فيروس التهاب الكبد B أن يوفر دورة حياة فيروسية واقعية ستكون حاسمة لفحص العوامل العلاجية. تستهدف معظم العوامل المتاحة المضادة لفيروس التهاب الكبد B مراحل دورة الحياة بعد الدخول الفيروسي ولكن ليس قبل الدخول الفيروسي. يفصل هذا البروتوكول إنشاء نموذج كبدي كفء قادر على فحص العوامل العلاجية التي تستهدف مراحل دورة حياة الدخول قبل الفيروس وما بعد الفيروس. يتضمن ذلك استهداف ربط بولي ببتيد النقل المشترك لتوروكولات الصوديوم (NTCP) ، وتشكيل cccDNA ، والنسخ ، والتجميع الفيروسي بناء على imHC أو HepaRG كخلايا مضيفة. هنا ، استخدم اختبار تثبيط دخول HBV الكركمين لمنع وظائف ربط ونقل HBV عبر NTCP. تم تقييم مثبطات تقارب الارتباط (KD) مع NTCP باستخدام كالوريمتر المعايرة متساوي الحرارة (ITC) - وهي أداة عالمية لفحص أدوية HBV بناء على المعلمات الديناميكية الحرارية.
Introduction
تعتبر عدوى فيروس التهاب الكبد B (HBV) مرضا يهدد الحياة في جميع أنحاء العالم. عدوى فيروس التهاب الكبد B المزمنة محملة بخطر الإصابة بتليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية1. يركز العلاج الحالي المضاد لفيروس التهاب الكبد B في الغالب على الدخول بعد الفيروس باستخدام نظائر nucleos (t) ide (NAs) و interferon-alpha (IFN-α) 2،3. حدد اكتشاف مثبط دخول HBV ، Myrcludex B ، هدفا جديدا للعوامل المضادة ل HBV4. أدى الجمع بين مثبطات الدخول و NAs في فيروس التهاب الكبد B المزمن إلى تقليل الحمل الفيروسي بشكل كبير مقارنة بتلك التي تستهدف تكاثر الفيروس وحده 5,6. ومع ذلك ، فإن نموذج خلايا الكبد الكلاسيكي لفحص مثبطات دخول HBV محدود بمستويات مستقبلات فيروسية منخفضة (توروكولات الصوديوم cotransporting polypeptide ، NTCP). الإفراط في التعبير عن hNTCP في خلايا الورم الكبدي (أي HepG2 و Huh7) يحسن عدوى HBV 7,8. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا هذه تعبر عن مستويات منخفضة من المرحلة الأولى والثانية من إنزيمات استقلاب الأدوية وتظهر عدم الاستقرار الجيني9. نماذج خلايا الكبد التي يمكن أن تساعد في استهداف آليات متميزة للمركبات المرشحة المضادة لفيروس التهاب الكبد B مثل الدخول قبل الفيروسي ، وربط NTCP ، والدخول الفيروسي من شأنها أن تسرع في تحديد وتطوير أنظمة الجمع الفعالة. أوضحت دراسة النشاط المضاد لفيروس التهاب الكبد B للكركمين تثبيط الدخول الفيروسي كآلية جديدة بالإضافة إلى انقطاع الدخول بعد الفيروس. يفصل هذا البروتوكول نموذجا مضيفا لفحص جزيئات دخول HBVالمضادة 10.
الهدف من هذه الطريقة هو استكشاف المركبات المرشحة المضادة لفيروس التهاب الكبد B لتثبيط الدخول الفيروسي ، وخاصة منع ربط NTCP ونقله. نظرا لأن تعبير NTCP هو عامل حاسم لدخول HBV والعدوى ، فقد قمنا بتحسين بروتوكول نضج خلايا الكبد لزيادة مستويات NTCP11. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذا البروتوكول التمييز بين التأثير المثبط على دخول HBV كتثبيط لمرفق HBV مقابل تثبيط الاستيعاب. كما تم تعديل مقايسة امتصاص حمض التوروكوليك (TCA) باستخدام طريقة قائمة على ELISA بدلا من النظائر المشعة لتمثيل نقل NTCP12,13. تم تأكيد تفاعل المستقبلات والرباط من خلال هياكلها ثلاثية الأبعاد14,15. يمكن تقييم تثبيط وظيفة NTCP عن طريق قياس نشاط امتصاص TCA16. ومع ذلك ، لم تقدم هذه التقنية دليلا مباشرا على ارتباط NTCP بالمثبطات المرشحة. لذلك ، يمكن التحقيق في الارتباط باستخدام تقنيات مختلفة ، مثل رنين البلازمون السطحي 17 ، ELISA ، مقايسة التحول الحراري القائمة على التألق (FTSA) 18 ، FRET19 ، AlphaScreen ، وطرق أخرى مختلفة20. من بين هذه التقنيات ، يعد ITC معيارا للهدف في تحليل الربط لأنه يمكنه مراقبة امتصاص الحرارة أو انبعاثها في كل تفاعل تقريبا21. تم تقييم تقارب الربط (KD) ل NTCP والمركبات المرشحة مباشرة باستخدام ITC. كانت قيم التقارب هذه أكثر دقة من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام نموذج التنبؤ في السيليكو 22.
يغطي هذا البروتوكول تقنيات نضوج خلايا الكبد ، وعدوى فيروس التهاب الكبد B ، وفحص مثبطات دخول فيروس التهاب الكبد B. باختصار ، تم تطوير نموذج خلايا الكبد على أساس خطوط خلايا imHC و HepaRG. تم تمييز الخلايا المستزرعة إلى خلايا كبدية ناضجة في غضون 2 أسابيع. تم الكشف عن تنظيم مستويات NTCP باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، واللطخة الغربية ، وقياس التدفق الخلوي11. تم إنتاج التهاب الكبد B virion (HBVcc) وجمعه من HepG2.2.15. تمت معالجة imHC أو HepaRG المتمايز (d-imHC ، d-HepaRG) بشكل وقائي مع المرشحين المضادين ل HBV قبل 2 ساعة من التلقيح ب HBV virion. كانت النتيجة المتوقعة للتجربة هي تحديد العوامل التي تقلل من فيروس التهاب الكبد B الخلوي والعدوى. تم تقييم نشاط مكافحة NTCP باستخدام مقايسة امتصاص TCA. يمكن منع نشاط NTCP بواسطة العوامل التي تربط NTCP على وجه التحديد. تم استخدام تقنية ITC للتحقيق في جدوى الارتباط التفاعلي الذي يمكن أن يتنبأ بالمثبطات والبروتينات المستهدفة ، وتحديد تقارب الارتباط (KD) لليجند للمستقبل عبر التفاعلات غير التساهمية للمركب الجزيئي الحيوي23,24. على سبيل المثال ، يمثل K D ≥ 1 × 103 mM ربطا ضعيفا ، ويمثل K D ≥ 1 × 106 μM ربطا معتدلا ، ويمثل K D ≤ 1 × 109 nM ارتباطا قويا. يرتبط ΔG ارتباطا مباشرا بالتفاعلات الملزمة. على وجه الخصوص ، التفاعل مع ΔG السلبي هو رد فعل مجهد ، مما يشير إلى أن الربط هو عملية عفوية. يشير التفاعل مع ΔH السالب إلى أن عمليات الارتباط تعتمد على الرابطة الهيدروجينية وقوى فان دير فال. يمكن استخدام كل من امتصاص TCA وبيانات ITC لفحص عوامل الدخول المضادة ل HBV. يمكن أن توفر نتائج هذه البروتوكولات أساسا ليس فقط للفحص المضاد لفيروس التهاب الكبد B ولكن أيضا للتفاعل مع NTCP كما تم تقييمه من خلال التقارب الملزم ووظيفة النقل. تصف هذه الورقة إعداد وتوصيف الخلية المضيفة ، والتصميم التجريبي ، وتقييم الإدخال المضاد ل HBV جنبا إلى جنب مع تقارب ربط NTCP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراءات التالية في غطاء تدفق المخاطر البيولوجية من الفئة الثانية أو غطاء التدفق الصفحي. تمت الموافقة على التعامل مع HBV أخلاقيا من قبل IRB (MURA2020/1545). راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع الحلول والكواشف والمعدات وخطوط الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. تحضير الخلايا المضيفة (خلايا الكبد الناضجة)
- خلايا الكبد المستزرعة (3.75 × 105 خلايا HepaRG أو imHC) وتحافظ على قارورة مزرعة 75 سم2 مع 10 مل من وسط DMEM / F12 مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 1٪ L- جلوتامين ، 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين. انتظر حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ (خلال أسبوع 1).
- تخلص من الوسط القديم من القارورة واغسل الخلايا ب 4 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- نضح PBS وإضافة 4 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA.
- احتضان القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق ، وتحقق من الخلايا الملتصقة باستخدام مجهر مقلوب مع عدسة موضوعية 10x. تأكد من انفصال الطبقة الأحادية عن سطح الزراعة.
- تثبيط التربسين عن طريق إضافة 4 مل من وسط الاستزراع المكمل بنسبة 10٪ FBS إلى القارورة وإعادة تعليق الخلايا المحصودة بعناية. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم ، 25 درجة مئوية.
- استنشاق المادة الطافية من حبيبات الخلية وإعادة تعليقها ب 1-2 مل من وسط الاستزراع قبل التسخين المكمل بنسبة 10٪ FBS والمضادات الحيوية.
- امزج 10 ميكرولتر لكل من معلق الخلية والتريبان الأزرق وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. تأكد من أن صلاحية الخلية أعلى من 90٪ قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
- قم بالبذور 1 × 10 6 خلايا لكل 2 مل في كل بئر من لوحة6 آبار واحتفظ بها في وسط DME / F12 الكامل حتى تصل الخلايا إلى التقاء 100٪.
- للنضج الكبدي ، قم بإعداد وسط النضج الكبدي (وسط Williams 'E المكمل ب 10٪ FBS ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 5 ميكروغرام / مل أنسولين ، 50 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، 2 مليمول L-جلوتامين ، و 2٪ DMSO).
- استبدل وسط الاستزراع 2x في الأسبوع.
- الحفاظ على خلايا الكبد في وسط النضج لمدة 2 أسابيع للحصول على خلايا الكبد الناضجة جاهزة لعدوى HBV.
2. القياس الكمي ل NTCP الخلوي
- قياس تعبير NTCP باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي
- اجمع حبيبات خلايا الكبد الناضجة من خلال التربسين (انظر الخطوات 1.2-1.5).
- استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي من حبيبات الخلية باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي مع علاج DNase I.
- توليف cDNA من 200 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام التمهيدي oligo-dT ونظام النسخ العكسي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- قم بتخفيف cDNA إلى 50 نانوغرام / ميكرولتر واستخدمه كقالب لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. امزج 2 ميكرولتر من cDNA المخفف مع كواشف المزيج الرئيسية PCR التي تحتوي على محلول SYBR الأخضر qRT-PCR Kit مع 5 ميكرومتر من البادئات الخاصة ب NTCP (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' و 5'-ATCATAGATCCCTGGAGTAGAT-3').
- للتطبيع ، استخدم GAPDH كجين تدبير منزلي مع بادئات محددة (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' و 5'-AAATGAGCCCCCCCCTTCTC-3').
- تضخيم عينات cDNA باستخدام دورة حرارية تحت ظروف درجة الحرارة التالية: 1 دورة من 3 دقائق عند 95 درجة مئوية (تمسخ الأولي) ؛ 40 دورة من 30 ثانية عند 95 درجة مئوية (تمسخ) ، 30 ثانية عند 60 درجة مئوية إلى 65 درجة مئوية (التلدين) ، 30 ثانية عند 72 درجة مئوية (تمديد) ؛ 1 دورة من 5 دقائق عند 72 درجة مئوية (التمديد النهائي).
- احسب تغير طية NTCP في خلايا الكبد الناضجة على الخلايا غير المتمايزة باستخدام GAPDH كجين معاير بناء على طريقة 2-ΔΔCT .
- قياس NTCP باستخدام تحليل اللطخة الغربية
- حصاد خلايا الكبد باستخدام مكشطة الخلايا والطرد المركزي لهم في 300 × غرام ، 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لجمع بيليه الخلية.
- اتبع تعليمات الشركة المصنعة للمخزن المؤقت RIPA لاستخراج البروتين الخلوي مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA الذي يحتوي على 1x مثبط الأنزيم البروتيني.
- قم بقياس تركيز البروتين الكلي باستخدام طريقة حمض البيسينتشونينيك (BCA).
- امزج 12.5 ميكرولتر من البروتين مع صبغة تحميل 2x بنسبة 1: 1 من حيث الحجم.
- يغلى خليط البروتين والسلم القياسي على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- أضف 1x تشغيل العازلة إلى غرفة الكهربائي.
- قم بتحميل 5 ميكرولتر من سلم البروتين القياسي أو 20 ميكرولتر من خليط البروتين المغلي في هلام بولي أكريلاميد 10٪ (وزن / حجم).
- أداء هلام الكهربائي: 50 فولت لمدة 30 دقيقة تليها 90 فولت لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإعداد غشاء PVDF عن طريق نقعه في الميثانول لمدة 30 ثانية ، واغسله بالماء المقطر المزدوج لمدة 1-2 دقيقة ، ثم انقعه مع قطعتين من ورق الترشيح في محلول النقل لمدة 10 دقائق أو حتى الاستخدام.
- ضع ورقة الترشيح على لوحة الأنود لخلية نقل شبه جافة ؛ ثم ضع غشاء PVDF والهلام وورق الترشيح في الأعلى بهذا الترتيب.
- انقل البروتينات من الجل إلى غشاء PVDF عند 10 فولت لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- سد الغشاء بمحلول حجب WB لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الغشاء مع ببتيد ببتيد توروكولات المضاد للصوديوم (مضاد NTCP) (تخفيف 1: 100) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- اغسل الغشاء 3 × 10 دقائق باستخدام TBST.
- احتضان الغشاء مع بيروكسيديز الفجل (HRP) - مترافق الماعز المضادة للأرانب (1: 10000 تخفيف) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الغشاء 3 × 10 دقائق باستخدام TBST ثم 1 × 5 دقائق باستخدام TBS.
- كشف NTCP باستخدام ركيزة HRP (انظر جدول المواد).
- أضف ما لا يقل عن 0.1 مل من محلول ركيزة HRP / سم2 من الغشاء واحتضان الغشاء لمدة 3-5 دقائق في الظلام.
- تصور NTCP باستخدام نظام توثيق الهلام في وضع التلألؤ الكيميائي ، وحدد خيار العلامة للغشاء ، واضبط وقت التعرض مع الوضع التراكمي كل 1 دقيقة ، والتقط الصورة بأوقات تعرض مختلفة لمدة 5 دقائق.
- قم بتجريد وفحص اللطخة باستخدام الجسم المضاد ل GAPDH للفأر (1: 200000 تخفيف) والجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر المقترن بالماعز HRP (1: 10000 تخفيف).
- قياس مستوى NTCP باستخدام قياس التدفق الخلوي
- اجمع كريات الخلايا من خلايا الكبد الناضجة عن طريق احتضان الخلايا ب 8 mM EDTA لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: تجنب استخدام التربسين أو البروتياز الأخرى التي يمكن أن تعطل مستقبلات سطح الخلية. نظرا لأن NTCP هو بروتين مستقبلات سطح الخلية ، فإن الضرر الناجم عن التربسين يمكن أن يعطي نتائج سلبية. - إصلاح خلايا الكبد مع 300 ميكرولتر من 3.7 ٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS لمدة 15 دقيقة. انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جم ، 25 درجة مئوية.
- اغسل الخلايا 2x ب 700 ميكرولتر من 1x PBS مع 1٪ FBS (v / v) ، جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جم ، 25 درجة مئوية ، أضف 300 ميكرولتر من 0.05٪ Triton X-100 في PBS إلى حبيبات الخلية ، واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لاختراقها.
- جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جم ، 25 درجة مئوية ، اغسل حبيبات الخلية 3 × 1 دقيقة مع 700 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ FBS (v / v). احتضان الخلايا بالجسم المضاد الأساسي ضد NTCP (تخفيف 1: 100) عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا 3 × 1 دقيقة باستخدام بيرم / واش عازلة وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جم ، 25 درجة مئوية.
- قم بتلطيخ الخلايا بجسم مضاد ثانوي مقترن ب Alexa Fluor 488 عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا 3 × 1 دقيقة باستخدام عازل بيرم / واش وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جم ، 25 درجة مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 200 ميكرولتر من PBS مع 1٪ FBS (v / v).
- قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي ، وقم بتسخين الليزر لمدة 15 دقيقة ، وقم بإجراء التنظيف الروتيني.
- حدد معلمات القياس ، بما في ذلك التشتت الأمامي (FSC) ، والتشتت الجانبي (SSC) ، وإيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) أو phycoerythrin (PE) ، وقم بتعيين تعديل التعويض التلقائي بواسطة البرنامج. قم بتضمين عينات التحكم في التعويض: التحكم غير الملوث ، والتحكم الملون ب FITC ، والتحكم الملون ب PE.
ملاحظة: يتم استخدام معلمات FSC و SSC لتحديد حجم ودقة الخلايا الفردية لتحديد عدد الخلايا لتحليل البوابات. يحتوي كاشف قناة التألق على قنوات FITC و PE . بالنسبة لهذا البروتوكول ، حدد قناة FITC لاكتشاف Alexa Fluor 488. - قم بتشغيل العينة غير الملوثة بمعدل تدفق سائل متوسط (60 ميكرولتر / دقيقة) ، واضبط عتبة FSC و SSC حتى تغطي عدد الخلايا محل الاهتمام ، وحدد منطقة البوابة في هذه المنطقة ، وتنطبق على جميع ضوابط التعويض.
- اضبط أنبوب المضاعف الضوئي الفلوري (PMT) باستخدام التحكم غير الملوث ، واضبط جهد PMT ل FITC أو PE في الربع السالب. قم بتشغيل العينة الملطخة الموجبة واضبط FITC أو PE في مقياس الربع الموجب. قم بتشغيل عناصر التحكم غير الملوثة أو الملطخة ب FITC أو الملطخة ب PE ، واحسب التعويض ، وقم بتطبيقه على إعدادات العينة. قم بتشغيل عينة خلايا الكبد لقياس مستوى NTCP.
- تحليل خلايا الكبد الملطخة باستخدام برنامج مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد).
- ضمن نوافذ BD FACSuite ، انقر فوق أنبوب التحكم في علامة التبويب مصادر البيانات وانتظر ظهور البيانات الأولية.
- في علامة التبويب ورقة العمل على الجانب الأيمن ، انقر فوق الزر Ellipse Gate ، وحدد مجتمع الخلية في SSC ومخطط نقطة FSC باستخدام مؤشر الماوس ، وانتظر ظهور الدائرة P1.
- انقر فوق الزر Interval Gate وقم بتمييز المنطقة في الرسم البياني FITC ، بدءا من أعلى قيمة لشدة التألق إلى الجانب الأيمن. لاحظ السطر P2 الذي يظهر.
- انقر فوق أنبوب التجربة ولاحظ أن البيانات الموجودة في علامة التبويب ورقة العمل تتغير. انقر فوق الزر إحصائيات ثم على المساحة الفارغة في ورقة العمل. لاحظ القيم الإحصائية لمجتمع NTCP الذي يظهر.
- اجمع كريات الخلايا من خلايا الكبد الناضجة عن طريق احتضان الخلايا ب 8 mM EDTA لمدة 15 دقيقة.
3. إنتاج جسيمات HBV المشتقة من زراعة الخلايا (HBVcc)
- استزرع HepG2.2.15 في وسط كامل (مكمل DMEM ب 10٪ FBS و 100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين) في طبق بتري 10 سم لمدة 24 ساعة.
- استبدل الوسط الكامل المكمل ب 380 ميكروغرام / مل من الجينات (G418) عندما يصل HepG2.2.15 إلى التقاء 60٪ -70٪. حصاد المتوسطة المكيفة كل 2 أيام ؛ قم بتخزين الوسط الذي يحتوي على HBV عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي للمادة الطافية عند 5000 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. اجمع الوسط المكيف باستخدام حقنة سعة 20 مل وقم بترشيحه من خلال مرشح منخفض البروتين 0.45 ميكرومتر لإزالة بقايا الخلية.
- لتركيز HBV ، قم بتخفيف حجم 1 من المكثف مع 3 مجلدات من المادة الطافية المفلترة من الخطوة 3.3 في أنبوب طرد مركزي مخروطي وخلط المحلول بعناية عن طريق انعكاس الأنبوب. ضع الخليط على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. جهاز طرد مركزي للمحلول لمدة 1 ساعة عند 1500 × جم ، 4 درجات مئوية وتأكد من ظهور حبيبات بيضاء اللون.
ملاحظة: لكل 30 مل من المادة الطافية المفلترة من الخطوة 3.3، أضف 10 مل من المكثف للوصول إلى 40 مل من الحجم الكلي. - تقييم عيار HBV (مكافئ الجينوم) مع HBV 1.3-mer WT replicon كمنحنى قياسي يتراوح من 1 × 102 إلى 1 × 1010 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المطلق في الوقت الفعلي ، كما هو موضح سابقا11.
- أعد تكوين الحبيبات برفق في FBS وقم بتخزينها لمدة تصل إلى 1 عام عند -80 درجة مئوية في القسمة ذات الاستخدام الواحد.
4. مقايسة دخول مكافحة HBV
- حافظ على 100٪ imHC أو HepaRG متكدس في 6 ألواح آبار في وسط النضج (2٪ DMSO في وسط Williams 'E ، 10٪ FBS ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 5 ميكروغرام / مل أنسولين ، 50 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 2 مليمتر L-جلوتامين) لمدة أسبوعين وقم بتغيير المتوسط 2x في الأسبوع.
- نضح الوسط ، ثم أضف الكركمين (10-30 ميكرومتر) أو 4 ميكرومتر السيكلوسبورين A (CsA) المخفف بوسط ويليام E لمدة 2 ساعة. استنشاق مثبط دخول HBV المرشح واستبداله ب 1 مل من وسط William E الذي يحتوي على 4٪ بولي إيثيلين جلايكول.
- أضف جسيمات HBV إلى وسط الاستزراع عند تعدد العدوى (MOI) بمقدار 100 لكل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 2 مل من PBS البارد ، وقم بالدوران برفق لشطف الوسط القديم باستخدام HBV غير المرتبط.
- أضف 2 مل من وسيط William E الكامل والثقافة لمدة 7 أيام. نضح الوسط ، وغسل الخلايا مع 1x PBS ، وإصلاح الخلايا مع 3.7 ٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اختراق الخلايا المصابة وحظرها بمحلول حجب IF (0.2٪ Triton X-100 و 3٪ ألبومين مصل الأبقار في PBS) واحتضانها لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أضف الجسم المضاد الأساسي (المستضد الأساسي المضاد لفيروس التهاب الكبد الوبائي) عند تخفيف 1: 200 في محلول الحجب واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الخلايا 3 × 1 دقيقة بمحلول الغسيل (0.5٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني).
- أضف جسما مضادا ثانويا (تخفيف 1: 500) إلى محلول حجب IF ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، واغسل الخلايا 3 × 1 دقيقة بمحلول الغسيل.
- قم بتركيب العينة بوسط تركيب مضاد للتلاشي باستخدام 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي. الكشف عن إشارة التألق باستخدام مجهر مضان مجهز بمرشح DAPI (Ex 352-402 nM و Em 417-477) ومرشح PE (Ex 542-582 و Em 604-644) ، جنبا إلى جنب مع عدسة موضوعية 20x ، وتحديد نشاط الدخول المضاد ل HBV للمركبات المرشحة.
5. مقايسة ربط خلية HBV
- حافظ على 100٪ imHC أو HepaRG متكدس في 6 ألواح آبار في وسط النضج (2٪ DMSO في وسط Williams 'E ، 10٪ FBS ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 5 ميكروغرام / مل أنسولين ، 50 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 2 مليمتر L-جلوتامين) لمدة أسبوعين وقم بتغيير المتوسط 2x في الأسبوع.
- نضح الوسط ، ثم أضف الكركمين (10-30 ميكرومتر) أو السيكلوسبورين A (4 ميكرومتر) المخفف في وسط ويليام E لمدة 2 ساعة. استنشاق مثبط دخول HBV واستبداله ب 1 مل من وسط William E الذي يحتوي على 4٪ بولي إيثيلين جلايكول.
- أضف جزيئات HBV إلى وسط الاستزراع عند MOI 100 لكل بئر واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة للسماح ل HBV بالارتباط بخلايا الكبد. تخلص من الوسيط الذي يحتوي على HBV غير المنضم ، وأضف 2 مل من PBS البارد ، وقم بالدوران برفق لإزالة آثار الوسط المستهلك.
- حصاد الخلايا المصابة باستخدام مكشطة الخلايا وتعطيل الخلايا مع العازلة التحلل. انقل المحللة إلى أنبوب تجميع واستخرج الحمض النووي الكلي لتقييم الحمض النووي HBV باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي مع بادئات محددة ل HBV (التمهيدي الأمامي: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3 '، والتمهيدي العكسي: 5 '- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3 ') باستخدام PRNP (التمهيدي الأمامي: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3 '، التمهيدي العكسي: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') كعنصر تحكم داخلي.
- قم بتضخيم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز تدوير حراري باستخدام ظروف درجة الحرارة الموضحة في الخطوة 2.1.
- احسب مستويات الحمض النووي النسبي HBV / 1 × 106 خلايا في العلاج مقابل التحكم باستخدام PRNP كجين معاير بناء على طريقة 2-ΔΔCT .
6. مقايسة امتصاص حمض التوروكوليك (TCA)
- حافظ على خلايا imHC و HepaRG المتقاربة بنسبة 100٪ في وسط النضج لمدة 14 يوما.
- نضح الوسط وغسل خلايا الكبد مع 1x PBS. أضف الكركمين أو السيكلوسبورين A (10-50 ميكرومتر) المخفف في وسط ويليام E لمدة 2 ساعة. استبدل الوسط بمحلول حمض توروكوليك الصوديوم (0.5 مليون هيدرات توروكولات الصوديوم في 1x HEPES) واحتضانه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح محلول حمض توروكوليك الصوديوم ، واغسل 3x مع 1x HEPES الباردة. أضف 300-500 ميكرولتر من 1x HEPES البارد واحصد الخلايا بكاشطات الخلايا على الجليد.
- تجانس الخلايا عن طريق الموجات فوق الصوتية على تردد 20 كيلو هرتز لمدة 20 ثانية واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي المحللات عند 10000 × جم لمدة 20 دقيقة لترسيب حطام الخلية. اجمع الطافي وقم بتقييم تركيز حمض التوروكوليك داخل الخلايا باستخدام مجموعة مقايسة TCA ELISA (انظر جدول المواد).
7. تحديد تفاعلات البروتين والليجند باستخدام كالوريمتر المعايرة متساوي الحرارة
ملاحظة: تم تطوير نظام الفحص هذا بناء على برنامج MicroCal PEAQ-ITC (ITC).
- تحضير المخزن المؤقت (50 mM Tris-HCl buffer ، درجة الحموضة 7.0).
- تحضير 15 ميكرومتر من NTCP في المخزن المؤقت.
- تحضير محاليل مثبطات دخول HBV المرشحة 150 ميكرومتر في المخزن المؤقت.
- اغسل خلية العينة والخلية المرجعية والمحقنة في أداة ITC باستخدام المخزن المؤقت (الخطوة 7.1.).
- قم بتشغيل برنامج ITC بالنقر المزدوج على أيقونة البرنامج في أنظمة Windows. ضمن علامة التبويب "تشغيل تمييز التجربة" ، حدد طريقة microCal ل 19 Injection.itcm ، وانقر فوق فتح. عند فتح نافذة جديدة ، انقر فوق علامة التبويب "تنظيف" ، وفي نافذة "طريقة التنظيف" ، حدد زر الغسيل لطريقة تنظيف الخلية وزر الشطف لطريقة تنظيف المحقنة. انقر فوق التالي واتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة.
ملاحظة: يمكن أن تستغرق خطوة الغسيل 1.4 ساعة حتى تكتمل.
- قم بتشغيل برنامج ITC بالنقر المزدوج على أيقونة البرنامج في أنظمة Windows. ضمن علامة التبويب "تشغيل تمييز التجربة" ، حدد طريقة microCal ل 19 Injection.itcm ، وانقر فوق فتح. عند فتح نافذة جديدة ، انقر فوق علامة التبويب "تنظيف" ، وفي نافذة "طريقة التنظيف" ، حدد زر الغسيل لطريقة تنظيف الخلية وزر الشطف لطريقة تنظيف المحقنة. انقر فوق التالي واتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة.
- قم بتحميل العينة في مركز التجارة الدولية ؛ ضمن علامة التبويب تشغيل التجربة ، انقر فوق الزر تحميل ، واقرأ التعليمات التي تظهر على الشاشة. انقر فوق التالي واتبع تعليمات الفيديو حتى تكتمل خطوة التحميل هذه.
- املأ الخلية المرجعية بمخزن محلول باستخدام حقنة. املأ خلية العينة ب 15 ميكرومتر NTCP في المخزن المؤقت باستخدام حقنة وقم بإزالة محلول NTCP الزائد فوق خلية العينة. املأ المحقنة بمحلول 150 ميكرومتر من الكركمين (يجند) ، وتجنب فقاعات الهواء في المحقنة.
- قم بتشغيل العينة ، وضمن علامة التبويب تشغيل التجربة ، انقر فوق الزر "تشغيل ". راقب النوافذ الموجودة على الجانب الأيسر والتي تعرض المعلومات التجريبية والإعداد التجريبي. أدخل تركيزات الليجند والبروتين على أنها 150 ميكرومتر في [Syr] ، و 15 ميكرومتر في [الخلية] ، و 25 درجة مئوية في درجة الحرارة.
- في البرنامج ، انقر فوق ابدأ لإجراء عملية الحقن وانتظر 1.4 ساعة حتى يكتمل تفاعل البروتين والرباط.
ملاحظة: يظهر زر التحليل الباهت أسفل إطارات البرامج. - لاحظ أن زر التحليل يضيء بعد اكتمال الحقن. انقر فوق زر التحليل في برنامج التحكم لتحليل البيانات الأولية باستخدام برنامج التحليل . انقر فوق نظرة عامة لعرض البيانات الأولية واختيار نموذج التركيب كمجموعة واحدة من موقع الربط.
- تأكد من أن حالة الربط تظهر البيانات التجريبية (بيانات الربط أو عدم الربط أو التحكم أو التحقق) وأن قيم التجربة (KD و ΔG و ΔH و TΔS و N) معروضة على لوحة البرنامج.
- قم بتصدير المعلمات الديناميكية الحرارية التي تتنبأ بربط التفاعل ، بما في ذلك الرابطة الهيدروجينية ، ورابطة فان دير فال ، والتفاعل الكارهة للماء إلى تنسيق tif أو jpeg.
- بعد اكتمال التجربة ، اغسل خلية العينة باتباع الخطوة 7.4.
8. التحليل الإحصائي
- قم بإجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ متماثلة مستقلة (n = 3).
- تقديم البيانات التجريبية كوسيلة ± SD، وإجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج التحليل الإحصائي المطلوب.
- استخدم اختبار t للطلاب غير المزاوجين ثنائي الطرف للمقارنة بين قيمتين متوسطتين أو تطبيق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) مع Dunnett لإجراء مقارنات متعددة بين قيم متعددة لقيمة تحكم. اضبط مستوى الأهمية على p ≤ 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لوحظت سمات النضج الكبدي ، بما في ذلك الخلايا ثنائية النواة والتشكل متعدد الأضلاع (الشكل 1) ، خاصة في المرحلة المتمايزة من imHC (الشكل 1 أ). تم قياس زيادة كبيرة في تعبير NTCP في d-HepaRG و d-imHC عند 7 أضعاف و 40 ضعفا على التوالي (الشكل 1B). تم الكشف عن الشكل عالي الغليكوزيلاتي من NTCP ، المفترض أنه يمنح قابلية دخول HBV ، في d-imHC أكثر منه في d-HepaRG (الشكل 1C). احتوى imHC المتمايز على مستويات NTCP أعلى بنسبة 65.9٪ من الخلايا غير المتمايزة (الشكل 1D).
يوضح الشكل 2 أ ملخصا للعلاج الوقائي. يوضح الشكل 2B تلطيخ التألق المناعي HBV الذي تم إجراؤه لتقييم أنشطة الدخول المضادة ل HBV في اليوم 7 بعد الإصابة ، بينما يوضح الشكل 2C بروتوكول فحص ربط HBV. تم تقييم مستوى ارتباط HBV على مستقبل سطح الخلية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (الشكل 2D). لتحديد ما إذا كان NTCP هو مستقبل ارتباط HBV ، تم تحديد امتصاص TCA لمثبطات الربط المرشحة (الشكل 2E). بناء على هذا النموذج ، قلل النشاط المثبط المفترض للمركبات المرشحة من ارتباط HBV من خلال NTCP.
تم الكشف عن التغيير المسعر مع الحقن المستمر لخلية العينة (الشكل 3). تم رسم انحدار قياسي للمربعات الصغرى غير الخطية بناء على موقع ربط واحد مناسب جيدا للبيانات. يشير الخط المتصل إلى أفضل ملاءمة للقيم التجريبية (الشكل 3 أ ، ب). يوضح الجدول 1 المعلمات الديناميكية الحرارية المرتبطة بربط NTCP بالسيكلوسبورين A (CsA) أو مركب مرشح.
الشكل 1: النضج الكبدي ل HepaRG و imHC مع توصيف NTCP. تم استزراع كل من خطوط الخلايا في وسط النضج الكبدي لمدة 2 أسابيع. (أ) لوحظت خواص الخلايا الكبدية مثل الخلايا ثنائية النواة والتشكل متعدد الأضلاع حصريا في مرحلة نضج imHC. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) تم تنظيم تعبير NTCP في كل من HepaRG و imHC. كان NTCP الذي تم تطبيعه مع GAPDH أعلى في imHC منه في HepaRG. (ج) لوحظ وجود شكل عالي الغليكوزيلاتي من NTCP بعد النضج. (د) تم تقييم النسبة المئوية لارتفاع NTCP في d-imHC باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD. * و ** و *** تمثل الفرق الإحصائي مع p < 0.05 و p < 0.01 و p < 0.001 على التوالي. الاختصارات: NTCP = الصوديوم taurocholate cotransporting polypeptide. GAPDH = ديهيدروجيناز الجليسرالدهيد 3-فوسفات. NTCP-FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات المسمى NTCP. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: أدى العلاج الوقائي ل CCM إلى انخفاض دخول الفيروس ، والحمض النووي HBV داخل الخلايا ، ونشاط امتصاص TCA. (أ) تمت معالجة d-imHC مسبقا باستخدام CCM لمدة 2 ساعة قبل التطعيم بفيروس التهاب الكبد الوبائي. (ب) تم تحديد نشاط الدخول المضاد لفيروس التهاب الكبد B عن طريق تلطيخ التألق المناعي في اليوم 7 بعد الإصابة. (ج) يتم تقديم جدول تخطيطي لبروتوكول ربط HBV. (د) تم تقييم مستوى الحمض النووي المرتبط بفيروس التهاب الكبد B على خلايا الكبد ومقارنته ب 4 μM CsA ومثبط دخول HBV الكلاسيكي 25 وحدة / مل من الهيبارين. (ه) تم التوسط في تأثير 10-30 μM CCM على تثبيط امتصاص TCA من خلال مستقبل NTCP. الاختصارات: CCM = الكركمين ؛ HBV = فيروس التهاب الكبد B ؛ TCA = حمض التوروكوليك. d-imHC = imHC متباينة ؛ CsA = السيكلوسبورين أ ؛ HP = الهيبارين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تم توضيح تقارب NTCP مع الجزيئات الفردية (CsA أو المركب المرشح) باستخدام ITC. تم إنشاء ملف تعريف ITC لمزيج NTCP مع (A) CsA أو (B) الكركمين من الحقن المتسلسل لمركب (150 μM CsA أو مرشح) في محلول NTCP (15 ميكرومتر من NTCP ، درجة الحموضة 7.0 ، 25 درجة مئوية). تم رسم البيانات الخام المسعرية بين القدرة التفاضلية (μcal / s) والوقت (min). تم تحليل البيانات بناء على نموذج ربط موقع واحد حيث تشير الخطوط الصلبة إلى أفضل النتائج. أثناء حقن الروابط (CSA أو الكركمين) في محلول NTCP ، تغير المحتوى الحراري (ΔH) بعد زيادة تركيز الليجند في خلية العينة. تشير هذه البيانات إلى حدوث تفاعل الربط. الاختصارات: CsA = السيكلوسبورين أ ؛ NTCP = الصوديوم توروكولات نقل متعدد الببتيد. ITC = كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة; DP = القوة التفاضلية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| بروتين | ليجند | ثابت الربط (KD) | تغير المحتوى الحراري (ΔH) | تغير الإنتروبيا (ΔTΔS) | تغيير الطاقة الحرة جيبس (ΔG) | نوع الربط |
| (م -1) | (كيلو كالوري / مول) | (كيلو كالوري / مول) | (كيلو كالوري / مول) | |||
| NTCP البشري (SLA10A1) | سي سي إم | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | الرابطة الهيدروجينية |
| NTCP البشري (SLA10A1) | تي سي ايه | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | تفاعل مسعور |
الجدول 1: المعلمات الديناميكية الحرارية الناتجة عن التفاعل بين NTCP والمركبات الفردية (CCM و TCA) باستخدام ITC. الاختصارات: NTCP = الصوديوم taurocholate cotransporting polypeptide. CCM = الكركمين. TCA = حمض التوروكوليك. ITC = كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تبدأ عدوى HBV عن طريق الارتباط منخفض التقارب ببروتيوغليكان كبريتات الهيباران (HSPGs) على خلايا الكبد25 ، يليها الارتباط ب NTCP مع الاستيعاب الداخلي اللاحق من خلال الالتداخل الخلوي26. نظرا لأن NTCP هو مستقبل حاسم لدخول فيروس التهاب الكبد B ، يمكن ترجمة استهداف دخول HBV سريريا لتقليل عدوى دي نوفو ، وانتقال العدوى من الأم إلى الطفل (MTCT) ، والتكرار بعد زرع الكبد. ستكون مقاطعة دخول الفيروس علاجا بديلا ممكنا للعدوى المزمنة بفيروس التهاب الكبد B.
يتم تلخيص بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول المذكور أعلاه هنا. أثناء تحضير الخلايا المضيفة ، تأكد من أن خلايا الكبد تصل إلى التقاء 100٪ قبل إضافة وسط النضج مع 2٪ DMSO. سيؤدي استزراع خلايا الكبد دون المتقاربة في 2٪ DMSO إلى موت الخلايا وانفصالها. يمكن تمديد فترة النضج حتى 4 أسابيع لتعظيم تعبير NTCP27,28 ، على الرغم من أنه يوصى بفترة نضج لمدة أسبوعين.
تم اقتراح ثلاث تقنيات لتحديد تعبير NTCP الخلوي. يوصى بأن يختار المستخدمون التقنية الأكثر دراية بها ؛ هنا ، فضلنا قياس التدفق الخلوي على تحليل اللطخة الغربية لأنه مريح وسريع وسهل.
لإنتاج جسيمات HBV المشتقة من زراعة الخلايا (HBVcc) ، تم اشتقاق HepG2.2.15 من HepG2 عن طريق النقل العابر مع جينوم HBV كامل الطول مع جين مقاومة الجينات (G418)29. يجب أن يحتوي وسط الاستزراع على 380-500 ميكروغرام / مل وراثي ، وإلا فلن تنتج الخلايا HBVcc. يجب استخدام مرشح منخفض البروتين ، 0.45 ميكرومتر لتوضيح المادة الطافية لتجنب فقدان محصول HBV. لتركيز HBV ، تم استخدام البولي إيثيلين جلايكول (PEG) مع جهاز طرد مركزي قياسي. يمكن أيضا تركيز جزيئات HBV باستخدام تدرج السكروز والطرد المركزي الفائق. يجب تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة حيث سيتم تقليل العدوى.
في مقايسة الدخول المضادة ل HBV ، يجب أن تصل خلايا الكبد إلى التقاء 100٪ قبل تحريض النضج. تم تطوير هذا البروتوكول على أساس العلاج الوقائي. تعرضت الخلايا المضيفة للمركبات المرشحة لمدة 2 ساعة قبل الإصابة بفيروس التهاب الكبد B12. بعد 7 أيام من الإصابة ، تم تقييم عدوى فيروس التهاب الكبد B باستخدام التألق المناعي. يجب تحسين جميع المكونات وتركيزات محلول الحجب والأجسام المضادة الأولية والثانوية وخطوات الغسيل لتحقيق أفضل نتيجة مع الحد الأدنى من التلوين غير المحدد. هنا ، قدمنا تركيزات وتقنيات محسنة.
يصف بروتوكول مقايسة امتصاص TCA المعيار الذهبي لتثبيط نقل NTCP. قمنا بتعديل البروتوكول لتجنب TCA المشع. الخطوات الحاسمة لفحص امتصاص TCA هي غسل الخلايا والحصاد. يجب تنفيذ جميع هذه الإجراءات على الجليد طوال الوقت لمنع المزيد من استيعاب النشاط الخلوي للمركب. بعد تجانس الخلايا وتكوير حطام الخلية, يجب استنشاق المادة الطافية برفق دون تعطيل الحبيبات. إذا سمحت منشأة المستخدم باستخدام تقنية التلألؤ السائل ، فإن 3حمض H-taurocholic يستخدم بشكل شائع في دراسات نقل وامتصاص TCA. نظرا لأننا تحققنا من امتصاص TCA باستخدام ELISA ، يمكن أن تحل هذه التقنية البديلة محل استخدام المركب المشع.
ITC هي طريقة فيزيائية حيوية تستخدم على نطاق واسع لتحديد المعلمات الديناميكية الحرارية المرتبطة بالتفاعلات بين البروتينات القابلة للذوبان وروابط الوزن الجزيئي الصغيرة30,31. يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في تفاعل الروابط المختلفة مع جزيء صغير أو بروتين. ITC هي طريقة مباشرة وغير جراحية بدون خطوات إضافية للكشف عن الإشارة ، ولا قيود على الوزن الجزيئي ، ولا توجد علامات أو تجميد أو أي تعديل كيميائي آخر. الحد من ITC هو الشرط الأساسي للتركيزات العالية للمواد المتفاعلة. يجب أن يكون البروتين والليجند عالي النقاء وقابل للذوبان في الماء بدرجة كافية (10-100 ميكرومتر) عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريك. يمكن اكتشاف محلول البروتين غير المستقر من خلال تغيير إشارة الحرارة كدالة للوقت.
توفر خلايا الكبد المحسنة البشرية NTCP نموذجا بديلا للدراسة المختبرية لعدوى فيروس التهاب الكبد B ولكنها تشبه HepaRG وخلايا الكبد البشرية الأولية. تعوق هذه النماذج المضيفة موثوقيتها المحدودة وقابليتهاللتأثر 8,33. تم إثبات الانتشار غير الفعال ل HBV في خلايا HepG2-NTCP أو Huh7-NTCP من خلال انخفاض لقاح HBV المشتق من الخلايا المنتجة ل HBVcc. في العديد من الدراسات ، تم استخدام HBV لإصابة الخلايا المستهدفة في MOI من 1,00033,34. تحتوي الجسيمات دون الفيروسية في HBVcc على بروتين غلاف HBV (L / M / S) وتربط NTCP بشكل تنافسي ، مما يؤدي إلى انخفاض العدوى35. للتغلب على هذا القيد ، قام هذا البروتوكول بتعديل ثقافة HepaRG أو imHC مع بروتوكول النضج لزيادة مستويات NTCP. تم تركيز HBVcc المشتق من HepG2.2.15 قبل استخدامه كلقاح. كانت عدوى HBV أعلى من 80٪ في imHC المتمايز بناء على قياس مستضد HBV الأساسي11.
لقد وصفنا تحديد المركبات المضادة لفيروس التهاب الكبد B التي تستهدف NTCP لمقاطعة دخول الفيروس واعتمدنا إجراء النضج الكبدي لزيادة مستويات NTCP. لتحديد مثبطات الدخول ، تمت معالجة خلايا الكبد بمركبات مرشحة لمدة 2 ساعة قبل الإصابة بفيروس التهاب الكبد B عند 4 درجات مئوية للسماح بالارتباط الفيروسي ولكن ليس الدخول. تم تقييم الانخفاض في عدوى فيروس التهاب الكبد B في اليوم 7 بعد الإصابة. تضمنت البيانات التمثيلية السيكلوسبورين A ، وهو مثبط NTCP كلاسيكي ، كعنصر تحكم إيجابي للتحقق من صحة النموذج.
نظرا لأن NTCP يسهل وظائف التداخل الخلوي بوساطة الناقل والمستقبلات ، يمكن أن تستهدف مثبطات دخول HBV واحدة على الأقل من هذه الآليات. يمكن تقييم تثبيط نقل NTCP باستخدام مقايسة امتصاص TCA بناء على ELISA ، مما يلغي TCA المشع من البروتوكولالكلاسيكي 36. تم قياس التقارب بين NTCP ومثبط الدخول باستخدام ITC. قدمت هذه التقنية معلمات ديناميكية حرارية أساسية ، بما في ذلك القياس المتكافئ (n) ، وثابت التفكك (KD) ، والتغير في الطاقة الحرة (ΔG) ، والمحتوى الحراري (ΔH) ، والانتروبيا (ΔS) ، والقدرة الحرارية للربط (ΔCp). تم تحديد العديد من العوامل المضادة لفيروس التهاب الكبد B عن طريق الالتحام الجزيئي ، مثل كيرسيتين ، روتين ، هيسبيريدين ، ولوبيرول ، والتي يمكن أن تربط على وجه التحديد النسخ العكسي HBV مقارنة ب lamivudine ، وهو نظير نيوكليوسيد. تم فحص المركبات باستخدام ITC وأظهرت طاقة جيب سلبية (−ΔG) تتراوح من -9.3 إلى -5.2 كيلو كالوري / مول و KD من 1 × 10-6 إلى 1 × 10-3 M مع بوليميراز HBV37. مجتمعة ، ستساعد البيانات التي تم الحصول عليها من هذه المقايسات المذكورة أعلاه في فحص الفعالية المضادة للفيروسات للمركبات المرشحة التي تعمل كمثبطات دخول HBV. سيكون البروتوكول المعمول به مفيدا لاكتشاف مضادات / مثبطات NTCP الجديدة. يمكن أن يكون قمع دخول الفيروس مفيدا في العلاج الوقائي والعلاجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
يتم دعم هذا المشروع البحثي من قبل جامعة ماهيدول وتايلاند للبحث العلمي والابتكار (TSRI) بشكل منفصل إلى A. Wongkajornsilp و K. Sa-ngiamsuntorn. تم دعم هذا العمل ماليا من قبل مكتب المجلس الوطني لسياسة البحث العلمي والابتكار في التعليم العالي من خلال وحدة إدارة البرنامج للقدرة التنافسية (رقم المنحة C10F630093). A. Wongkajornsilp هو المستفيد من منحة Chalermprakiat من كلية الطب مستشفى Siriraj ، جامعة ماهيدول. يود المؤلفون أن يشكروا الآنسة Sawinee Seemakhan (المركز الممتاز لاكتشاف الأدوية ، كلية العلوم ، جامعة ماهيدول) على مساعدتها في تقنية ITC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J.
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
- Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
- Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
- Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
- Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
- Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
- Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
- Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
- Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
- Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
- Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
- Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
- Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
- Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
- Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
- Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
- Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
- Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
- Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
- Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
- Srivastava, V. K., Yadav, R. Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).
- Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
- Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
- Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
- Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).
