Summary
Vi presenterer en protokoll for å screene anti-hepatitt B-virus (HBV) forbindelser rettet mot pre- og post-viral oppføring livssyklus stadier, ved hjelp av isotermisk titrering kalorimetri for å måle binding affinitet (KD) med vert natrium taurocholate cotransporting polypeptid. Antiviral effekt ble bestemt gjennom undertrykkelse av virale livssyklusmarkører (cccDNA-dannelse, transkripsjon og viral montering).
Abstract
Hepatitt B-virus (HBV) infeksjon har blitt ansett som en avgjørende risikofaktor for hepatocellulært karsinom. Nåværende behandling kan bare redusere virusbelastningen, men ikke resultere i fullstendig remisjon. En effektiv hepatocyttmodell for HBV-infeksjon vil tilby en sann viral livssyklus som vil være avgjørende for screening av terapeutiske midler. De fleste tilgjengelige anti-HBV-midler er rettet mot livssyklusstadier etter viral oppføring, men ikke før viral oppføring. Denne protokollen beskriver genereringen av en kompetent hepatocyttmodell som er i stand til å screene for terapeutiske midler rettet mot pre-viral oppføring og livssyklusstadier etter virusinngang. Dette inkluderer målretting av natriumtaurokolat som transporterer polypeptid (NTCP), cccDNA-dannelse, transkripsjon og viral montering basert på imHC eller HepaRG som vertsceller. Her brukte HBV-inngangshemmingsanalysen curcumin for å hemme HBV-bindings- og transportfunksjoner via NTCP. Hemmerne ble evaluert for bindingsaffinitet (KD) med NTCP ved bruk av isotermisk titreringskalorimetri (ITC)-et universelt verktøy for HBV-legemiddelscreening basert på termodynamiske parametere.
Introduction
Hepatitt B-virus (HBV) infeksjon regnes som en livstruende sykdom over hele verden. Kronisk HBV-infeksjon er belastet med risiko for levercirrhose og hepatocellulært karsinom1. Nåværende anti-HBV-behandling fokuserer hovedsakelig på postviral oppføring ved bruk av nukleos (t) idanaloger (NAs) og interferon-alfa (IFN-α) 2,3. Oppdagelsen av en HBV-inngangshemmer, Myrcludex B, har identifisert et nytt mål for anti-HBV-midler4. Kombinasjonen av inngangshemmere og NAer i kronisk HBV har betydelig redusert virusbelastningen sammenlignet med de som retter seg mot viral replikasjon alene 5,6. Den klassiske hepatocyttmodellen for screening av HBV-inngangshemmere er imidlertid begrenset av lave virale reseptornivåer (natriumtaurokolat som transporterer polypeptid, NTCP). Overekspresjonen av hNTCP i hepatomceller (dvs. HepG2 og Huh7) forbedrer HBV-smittsomhet 7,8. Likevel uttrykker disse cellelinjene lave nivåer av fase I og II legemiddelmetaboliserende enzymer og utviser genetisk ustabilitet9. Hepatocyttmodeller som kan bidra til å målrette forskjellige mekanismer for kandidat-anti-HBV-forbindelser som previral oppføring, NTCP-binding og viral oppføring, vil fremskynde identifisering og utvikling av effektive kombinasjonsregimer. Studien for anti-HBV-aktivitet av curcumin har belyst inhiberingen av viral oppføring som en ny mekanisme i tillegg til postviral inngangsavbrudd. Denne protokollen beskriver en vertsmodell for screening av anti-HBV-inngangsmolekyler10.
Målet med denne metoden er å utforske kandidat anti-HBV forbindelser for viral oppføring hemming, spesielt blokkerer NTCP binding og transport. Siden NTCP-uttrykk er en kritisk faktor for HBV-oppføring og infeksjon, optimaliserte vi hepatocyttmodningsprotokollen for å maksimere NTCP-nivåene11. I tillegg kan denne protokollen differensiere den hemmende effekten på HBV-oppføring som inhibering av HBV-vedlegg versus inhibering av internalisering. Taurokolsyreanalysen (TCA) ble også modifisert ved hjelp av en ELISA-basert metode i stedet for en radioisotop for å representere NTCP-transport12,13. Reseptor- og ligandinteraksjonen ble bekreftet av deres 3D-strukturer14,15. Hemmingen av NTCP-funksjonen kan evalueres ved å måle TCA-opptaksaktivitet16. Denne teknikken ga imidlertid ikke direkte bevis for NTCP-binding til kandidathemmerne. Derfor kan bindingen undersøkes ved hjelp av forskjellige teknikker, for eksempel overflateplasmonresonans 17, ELISA, fluorescensbasert termisk skiftanalyse (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen og forskjellige andre metoder20. Blant disse teknikkene er ITC en målstandard i bindingsanalyse fordi den kan observere varmeabsorpsjon eller utslipp i nesten hver reaksjon21. Bindingsaffiniteten (KD) til NTCP og kandidatforbindelser ble direkte evaluert ved hjelp av ITC; Disse affinitetsverdiene var mer presise enn de som ble oppnådd ved bruk av In Silico prediksjonsmodell22.
Denne protokollen dekker teknikker i hepatocyttmodning, HBV-infeksjon og screening for HBV-inngangshemmer. Kort fortalt ble det utviklet en hepatocyttmodell basert på imHC- og HepaRG-cellelinjer. De dyrkede cellene ble differensiert til modne hepatocytter innen 2 uker. Oppregulering av NTCP-nivåer ble påvist ved bruk av sanntids PCR, western blot og flowcytometri11. Hepatitt B-virion (HBVcc) ble produsert og samlet inn fra HepG2.2.15. Den differensierte imHC eller HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) ble profylaktisk behandlet med anti-HBV-kandidatene 2 timer før inokuleringen med HBV-virion. Det forventede resultatet av forsøket var identifisering av midlene som reduserer cellulær HBV og smittsomhet. Anti-NTCP-aktivitet ble evaluert ved hjelp av TCA-opptaksanalysen. NTCP-aktivitet kan undertrykkes av agenter som spesifikt bundet NTCP. ITC-teknikken ble brukt til å undersøke muligheten for interaktiv binding som kunne forutsi inhibitorer og deres målproteiner, og bestemme bindingsaffiniteten (KD) av liganden for reseptoren via ikke-kovalente interaksjoner av det biomolekylære komplekset23,24. For eksempel representerer K D ≥ 1 × 103 mM svak binding, K D ≥ 1 × 106 μM representerer moderat binding, og K D ≤ 1 × 109 nM representerer sterk binding. ΔG er direkte korrelert med bindingsinteraksjoner. Spesielt er en reaksjon med negativ ΔG en eksergonisk reaksjon, noe som indikerer at binding er en spontan prosess. En reaksjon med negativ ΔH indikerer at bindingsprosessene er avhengige av hydrogenbinding og Van der Waals-krefter. Både TCA-opptak og ITC-data kan brukes til å screene for anti-HBV-inngangsagenter. Resultatene av disse protokollene kan gi grunnlag for ikke bare anti-HBV-screening, men også interaksjonen med NTCP vurdert gjennom bindingsaffinitet og transportfunksjon. Denne artikkelen beskriver vertscellepreparering og karakterisering, eksperimentell design og evaluering av anti-HBV-oppføringen sammen med NTCP-bindingsaffiniteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Følgende prosedyrer må utføres i en klasse II biologisk farestrømningshette eller en hette med laminær strømning. Håndteringen av HBV ble etisk godkjent av IRB (MURA2020/1545). Se materialfortegnelsen for detaljer om alle løsninger, reagenser, utstyr og cellelinjer som brukes i denne protokollen.
1. Forbereder vertsceller (modne hepatocytter)
- Dyrkningshepatocytter (3,75 × 105 celler HepaRG eller imHC) og opprettholdes i en 75 cm2 kulturkolbe med 10 ml DMEM / F12 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin. Vent til cellene når 80% -90% sammenløp (innen 1 uke).
- Kast det gamle mediet fra kolben og vask cellene med 4 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
- Aspirer PBS og tilsett 4 ml 0,05% trypsin-EDTA.
- Inkuber kolben i 37 ° C-inkubatoren i 2-3 minutter, og kontroller de vedheftende cellene ved hjelp av et omvendt mikroskop med en 10x objektivlinse. Forsikre deg om at monolaget har løsnet fra dyrkingsoverflaten.
- Hemmer trypsinet ved å tilsette 4 ml av kulturmediet supplert med 10% FBS til kolben og forsiktig resuspendere de høstede cellene. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk rør og sentrifuge i 3 minutter ved 300 × g, 25 °C.
- Aspirer supernatanten fra cellepelleten og resuspender med 1-2 ml av det forvarmede kulturmediet supplert med 10% FBS og antibiotika.
- Bland 10 μL hver av cellesuspensjonen og trypanblå og tell cellene ved hjelp av et hemacytometer. Forsikre deg om at cellens levedyktighet er høyere enn 90% før du går videre til neste trinn.
- Frø 1 × 10 6 celler per 2 ml i hver brønn i en 6-brønns plate og opprettholdes i DME / F12 komplett medium til cellene når 100% sammenløp.
- For hepatisk modning, lag hepatisk modningsmedium (Williams 'E medium supplert med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 5 μg / ml insulin, 50 μM hydrokortison, 2 mM L-glutamin og 2% DMSO).
- Bytt ut kulturmediet 2x per uke.
- Opprettholde hepatocytter i modningsmedium i 2 uker for å oppnå modne hepatocytter klar for HBV-infeksjon.
2. Kvantifisering av cellulær NTCP
- Måle NTCP-uttrykk ved hjelp av sanntids-PCR
- Samle pelleten av modne hepatocytter gjennom trypsinisering (se trinn 1.2-1.5).
- Trekk ut totalt RNA fra cellepelleten ved hjelp av et RNA-ekstraksjonssett med DNase I-behandling.
- Syntetiser cDNA fra 200 ng av totalt RNA ved hjelp av et oligo-dT primer og revers-transkripsjonssystem etter produsentens instruksjoner.
- Fortynn cDNA til 50 ng/μL og bruk det som mal for PCR-reaksjonen. Bland 2 μL av det fortynnede cDNA med PCR-masterblandingsreagensene som inneholder SYBR grønn qRT-PCR Kit-løsning med 5 μM NTCP-spesifikke primere (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' og 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
- For normalisering, bruk GAPDH som et rengjøringsgen med spesifikke primere (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' og 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3').
- Forsterk cDNA-prøvene ved hjelp av en termisk syklus under følgende temperaturforhold: 1 syklus på 3 minutter ved 95 °C (innledende denaturering); 40 sykluser på 30 s ved 95 °C (denaturering), 30 s ved 60 °C til 65 °C (glødning), 30 s ved 72 °C (forlengelse); 1 syklus på 5 min ved 72 °C (endelig forlengelse).
- Beregn NTCP-foldendringen i modne hepatocytter over udifferensierte celler ved bruk av GAPDH som et kalibratorgen basert på 2-ΔΔCT-metoden .
- Kvantifisering av NTCP ved hjelp av western blot-analyse
- Høst hepatocytter ved hjelp av en celleskrape og sentrifuger dem ved 300 x g, 25 ° C i 5 minutter for å samle cellepelleten.
- Følg RIPA-bufferprodusentens instruksjoner for å trekke ut det cellulære proteinet med 100 μL RIPA-buffer som inneholder 1x proteasehemmer.
- Mål den totale proteinkonsentrasjonen ved hjelp av bicinchoninsyre (BCA) -metoden.
- Bland 12,5 μL protein med 2x lastfargestoff i et volumforhold på 1: 1.
- Kok opp proteinblandingen og standardstigen ved 95 °C i 5 minutter.
- Legg til 1x løpende buffer til elektroforesekammeret.
- Last 5 μL av proteinstandardstigen eller 20 μL av den kokte proteinblandingen i en 10% (w / v) polyakrylamidgel.
- Utfør gelelektroforese: 50 V i 30 minutter etterfulgt av 90 V i 1 time ved romtemperatur.
- Forbered en PVDF-membran ved å suge den i metanol i 30 s, vask den med dobbeltdestillert vann i 1-2 minutter, og suge den sammen med to stykker filterpapir i overføringsbuffer i 10 minutter eller til bruk.
- Plasser filterpapiret på anodeplaten til en halvtørr overføringscelle; Plasser deretter PVDF-membranen, gelen og filterpapiret på toppen, i den rekkefølgen.
- Overfør proteinene fra gelen til PVDF-membranen ved 10 V i 25 minutter ved romtemperatur.
- Blokker membranen med WB-blokkeringsløsning i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber membranen med antinatriumtaurokolat som transporterer polypeptid (anti-NTCP) (1:100 fortynning) ved 4 °C over natten.
- Vask membranen 3 x 10 min med TBST.
- Inkuber membranen med pepperrotperoksidase (HRP) -konjugert geitantikaninantistoff (1: 10 000 fortynning) i 1 time ved romtemperatur.
- Vask membranen 3 x 10 min med TBST og deretter 1 x 5 min med TBS.
- Oppdag NTCP ved hjelp av et HRP-substrat (se materialtabellen).
- Tilsett minst 0,1 ml HRP-substratløsning/cm2 av membranen og inkuber membranen i 3-5 minutter i mørket.
- Visualiser NTCP ved hjelp av et geldokumentasjonssystem i kjemiluminescensmodus, velg markøralternativet for membranen, juster eksponeringstiden med akkumulerende modus hvert 1. minutt, og ta bildet med forskjellige eksponeringstider i 5 minutter.
- Strip og sonder flekken med mus anti-GAPDH antistoff (1:200,000 fortynning) og HRP-konjugert geit anti-mus sekundært antistoff (1:10,000 fortynning).
- Måling av NTCP-nivå ved hjelp av flowcytometri
- Samle cellepellets av modne hepatocytter ved å inkubere cellene med 8 mM EDTA i 15 minutter.
MERK: Unngå å bruke trypsin eller andre proteaser som kan forstyrre celleoverflatereseptorer. Siden NTCP er et celleoverflatereseptorprotein, kan skade på grunn av trypsinisering gi negative resultater. - Fest hepatocyttene med 300 μL 3,7% paraformaldehyd i 1x PBS i 15 minutter. Overfør cellesuspensjonen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuge i 10 minutter ved 300 × g, 25 °C.
- Vask cellene 2x med 700 μL 1x PBS med 1% FBS (v / v), sentrifuge i 10 minutter ved 300 × g, 25 ° C, tilsett 300 μL 0,05% Triton X-100 i PBS til cellepelleten, og inkuber cellene ved romtemperatur i 20 minutter for å permeabilisere dem.
- Sentrifuge i 10 min ved 300 × g, 25 °C, vask cellepelleten 3 x 1 min med 700 μL PBS inneholdende 1% FBS (v/v). Inkuber cellene med det primære antistoffet mot NTCP (1:100 fortynning) ved 4 °C i 30 minutter. Vask cellene 3 x 1 min med Perm/Wash buffer og sentrifuge i 10 min ved 300 × g, 25 °C.
- Flekk cellene med sekundært antistoff konjugert til Alexa Fluor 488 ved 4 °C i 30 minutter. Vask cellene 3 x 1 min med Perm/Wash buffer og sentrifuge i 10 min ved 300 × g, 25 °C. Resuspender cellepelleten med 200 μL PBS med 1% FBS (v / v).
- Slå på flowcytometeret, varm opp laseren i 15 minutter og utfør rutinemessig rengjøring.
- Velg måleparametrene, inkludert forward scatter (FSC), side scatter (SSC) og fluorescein isothiocyanate (FITC) eller phycoerythrin (PE), og still inn automatisk kompensasjonsjustering av programvaren. Inkluder kompensasjonskontrolleksemplene: ufarget kontroll, FITC-farget kontroll og PE-farget kontroll.
MERK: FSC- og SSC-parametere brukes til å bestemme størrelsen og granulariteten til individuelle celler for å velge cellepopulasjonen for gating analyse. Fluorescenskanaldetektoren har FITC - og PE-kanaler . For denne protokollen velger du FITC-kanalen for å oppdage Alexa Fluor 488. - Kjør den ufargede prøven med middels fluidisk strømningshastighet (60 μL / min), juster terskelen til FSC og SSC til de dekker cellepopulasjonen av interesse, merk portområdet i dette området og bruk for alle kompensasjonskontroller.
- Still inn fluorescensfotomultiplikatorrøret (PMT) ved hjelp av den ufargede kontrollen, og juster PMT-spenningen til FITC eller PE i den negative kvadranten. Kjør den positivt fargede prøven og juster FITC eller PE i den positive kvadrantskalaen. Kjør de ufargede, FITC-fargede eller PE-fargede kontrollene, beregn kompensasjonen og bruk den på eksempelinnstillingene. Kjør hepatocytprøven for å måle NTCP-nivået.
- Analyser de fargede hepatocytter ved hjelp av flowcytometerprogramvare (se materialtabellen).
- Under BD FACSuite-vinduer klikker du på kontrollrøret i kategorien Datakilder og venter på at rådataene skal vises.
- I regnearkfanen på høyre side klikker du på Ellipse Gate-knappen , velger cellepopulasjonen i SSC og FSC-punktplottet ved hjelp av musepekeren, og venter på at sirkelen P1 skal vises.
- Klikk på Intervallport-knappen og merk regionen i FITC-histogrammet, fra den høyeste fluorescensintensitetsverdien til høyre side. Vær oppmerksom på linjen P2 som vises.
- Klikk på eksperimentrøret og observer at dataene i regnearkfanen endres. Klikk på Statistikk-knappen og deretter på det tomme rommet i regnearket. Vær oppmerksom på de statistiske verdiene for NTCP-populasjonen som vises.
- Samle cellepellets av modne hepatocytter ved å inkubere cellene med 8 mM EDTA i 15 minutter.
3. Produksjon av cellekultur-avledede HBV-partikler (HBVcc)
- Kultur HepG2.2.15 i komplett medium (DMEM supplert med 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) i en 10 cm petriskål i 24 timer.
- Erstatt hele mediet supplert med 380 μg / ml genein (G418) når HepG2.2.15 når 60% -70% sammenløp. Høst det kondisjonerte mediet hver 2. oppbevar mediet som inneholder HBV ved 4 °C.
- Fjern celleavfall ved å sentrifugere supernatanten ved 5000 × g, 4 °C i 20 minutter. Samle det kondisjonerte mediet ved hjelp av en 20 ml sprøyte og filtrer det gjennom et 0,45 μm lavproteinbindende filter for å fjerne celleavfall.
- For å konsentrere HBV, fortynn 1 volum konsentrator med 3 volumer av den filtrerte supernatanten fra trinn 3.3 i et konisk sentrifugerør og bland oppløsningen forsiktig ved rørinversjon. Plasser blandingen ved 4 °C i 1 time. Sentrifuge oppløsningen i 1 time ved 1 500 × g, 4 °C og sikre at en off-white pellet er synlig.
MERK: For hver 30 ml filtrert supernatant fra trinn 3.3, tilsett 10 ml konsentratoren for å nå 40 ml totalt volum. - Evaluer HBV-titeren (genomekvivalent) med HBV 1,3-mer WT-replikon som en standardkurve fra 1 × 102 til 1 × 1010 ved bruk av absolutt sanntids-PCR, som beskrevet tidligere11.
- Rekonstituer pelleten forsiktig i FBS og oppbevar i opptil 1 år ved -80 °C i engangs aliquots.
4. Anti-HBV oppføring analyse
- Oppretthold 100% konfluent imHC eller HepaRG i 6-brønnsplater i modningsmedium (2% DMSO i Williams 'E medium, 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 5 μg / ml insulin, 50 μM hydrokortison og 2 mM L-glutamin) i 2 uker og bytt medium 2x per uke.
- Aspirer mediet, tilsett deretter curcumin (10-30 μM) eller 4 μM ciklosporin A (CsA) fortynnet med Williams E-medium i 2 timer. Aspirer kandidaten HBV-inngangshemmer og erstatt den med 1 ml Williams E-medium som inneholder 4% polyetylenglykol.
- Tilsett HBV-partikler til kulturmediet ved en infeksjonsmangfold (MOI) på 100 per brønn og inkuber ved 37 °C i 18 timer. Kast supernatanten, tilsett 2 ml kald PBS, og virvle forsiktig for å skylle av det gamle mediet med ubundet HBV.
- Legg til 2 ml komplett William's E medium og kultur i 7 dager. Aspirer mediet, vask cellene med 1x PBS, og fest cellene med 3,7% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved romtemperatur. Permeabiliser og blokker de infiserte cellene med IF-blokkerende løsning (0,2% Triton X-100 og 3% bovint serumalbumin i PBS) og inkuber dem i 60 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett det primære antistoffet (anti-HBV kjerneantigen) ved 1:200 fortynning i blokkeringsløsningen og inkuber over natten ved 4 °C. Vask cellene 3 x 1 min med vaskeløsning (0,5% Tween 20 i PBS).
- Tilsett sekundært antistoff (1:500 fortynning) til IF-blokkeringsløsningen, inkuber i 1 time ved romtemperatur, og vask cellene 3 x 1 min med vaskeoppløsning.
- Monter prøven med antifademonteringsmedium med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), og dekk med et glassdeksel. Oppdag fluorescenssignalet ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med et DAPI-filter (Ex 352-402 nM og Em 417-477) og et PE-filter (Ex 542-582 og Em 604-644), sammen med en 20x objektivlinse, og bestem anti-HBV-inngangsaktivitet for kandidatforbindelsene.
5. HBV-cellebindende analyse
- Oppretthold 100% konfluent imHC eller HepaRG i 6-brønnsplater i modningsmedium (2% DMSO i Williams 'E medium, 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 5 μg / ml insulin, 50 μM hydrokortison og 2 mM L-glutamin) i 2 uker og bytt medium 2x per uke.
- Aspirer mediet, tilsett deretter curcumin (10-30 μM) eller ciklosporin A (4 μM) fortynnet i Williams E-medium i 2 timer. Aspirer HBV-inngangshemmeren og erstatt den med 1 ml Williams E-medium som inneholder 4% polyetylenglykol.
- Tilsett HBV-partikler til kulturmediet ved en MOI på 100 per brønn og inkuber ved 4 °C i 2 timer for å tillate HBV-binding til hepatocyttene. Kast mediet som inneholder ubundet HBV, tilsett 2 ml kald PBS, og virvle forsiktig for å fjerne spor av det brukte mediet.
- Høst de infiserte cellene ved hjelp av en celleskraper og forstyrre cellene med lysisbuffer. Overfør lysatet til et samlingsrør og trekk ut totalt DNA for å evaluere HBV-DNA ved hjelp av sanntids-PCR med spesifikke primere for HBV (fremoverprimer: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', og omvendt primer: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') ved bruk av PRNP (fremoverprimer: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', omvendt primer: 5'- TTTATGCCTACTACAGCCTCCTA-3') som en intern kontroll.
- Forsterk PCR-produktene i en termisk syklus ved å bruke temperaturforholdene beskrevet i trinn 2.1.
- Beregne relative HBV DNA-nivåer/1 × 106 celler i behandling versus kontroll ved bruk av PRNP som kalibratorgen basert på 2-ΔΔCT-metoden .
6. Taurokolsyre (TCA) opptaksanalyse
- Oppretthold 100% konfluerte imHC- og HepaRG-celler i modningsmedium i 14 dager.
- Aspirer mediet og vask hepatocyttene med 1x PBS. Tilsett curcumin eller ciklosporin A (10-50 μM) fortynnet i Williams E-medium i 2 timer. Bytt ut mediet med natriumtaurokolsyreoppløsningen (0,5 M natriumtaurokolathydrat i 1x HEPES) og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer natrium taurocholsyreoppløsningen, og vask 3x med kald 1x HEPES. Tilsett 300-500 μL kald 1x HEPES og høst cellene med celleskraper på is.
- Homogeniser cellene ved ultralydbehandling med en frekvens på 20 kHz i 20 s og inkuber på is i 5 minutter. Sentrifuge lysatene ved 10.000 × g i 20 minutter for å utfelle celleavfall. Samle supernatanten og evaluer intracellulær taurokolsyrekonsentrasjon ved hjelp av et TCA ELISA-analysesett (se materialtabellen).
7. Bestemmelse av protein-ligand-interaksjoner ved bruk av isotermisk titreringskalorimetri
MERK: Dette analysesystemet ble utviklet basert på MicroCal PEAQ-ITC (ITC-programvaren).
- Forbered bufferen (50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,0).
- Forbered 15 μM NTCP i bufferen.
- Forbered 150 μM kandidat HBV inngangshemmerløsninger i bufferen.
- Vask prøvecellen, referansecellen og sprøyten i ITC-instrumentet ved hjelp av bufferen (trinn 7.1.).
- Start ITC-programvaren ved å dobbeltklikke på programvareikonet i Windows-systemer. Under uthevingsfanen Kjør eksperiment , velg microCal Method for 19 Injection.itcm, og klikk på åpne. Når et nytt vindu åpnes, klikker du på rengjøringsfanen , og i vinduet Rengjøringsmetode velger du Vask-knappen for cellerengjøringsmetode og skylleknappen for sprøyterengjøringsmetode. Klikk på Neste og følg instruksjonene på skjermen.
MERK: Vasketrinnet kan ta 1,4 time å fullføre.
- Start ITC-programvaren ved å dobbeltklikke på programvareikonet i Windows-systemer. Under uthevingsfanen Kjør eksperiment , velg microCal Method for 19 Injection.itcm, og klikk på åpne. Når et nytt vindu åpnes, klikker du på rengjøringsfanen , og i vinduet Rengjøringsmetode velger du Vask-knappen for cellerengjøringsmetode og skylleknappen for sprøyterengjøringsmetode. Klikk på Neste og følg instruksjonene på skjermen.
- Last prøven inn i ITC; under kategorien Kjør eksperiment , klikk på Last inn-knappen og les instruksjonene på skjermen. Klikk på neste og følg videoinstruksjonene til dette lastetrinnet er fullført.
- Fyll referansecellen med oppløsningsbuffer ved hjelp av en sprøyte. Fyll prøvecellen med 15 μM NTCP i buffer ved hjelp av en sprøyte og fjern overflødig NTCP-løsning over prøvecellen. Fyll sprøyten med 150 μM oppløsning av curcumin (ligand), unngå luftbobler i sprøyten.
- Kjør prøven, og under kategorien Kjør eksperiment klikker du på Kjør-knappen . Observer vinduene på venstre side som viser eksperimentell informasjon og eksperimentell innstilling. Angi ligand- og proteinkonsentrasjonene som 150 μM i [ Syr], 15 μM i [Celle] og 25 ° C i temperatur.
- I programvaren klikker du på start for å utføre injeksjonsprosessen og venter i 1,4 time på at protein-ligandinteraksjonen skal fullføres.
MERK: Den falmede analyseknappen vises under programvarevinduene. - Vær oppmerksom på at analyseknappen lyser etter at injeksjonen er fullført. Klikk på analyseknappen i kontrollprogramvaren for å analysere rådataene ved hjelp av analyseprogramvaren . Klikk på oversikten for å vise rådataene og velg tilpasningsmodellen som ett sett med bindingssted.
- Kontroller at bindingsstatusen viser eksperimentelle data (binding, ingen binding, kontroll- eller kontrolldata) og at eksperimentverdiene (KD, ΔG, ΔH, TΔS og N) presenteres på programvarepanelet.
- Eksporter de termodynamiske parametrene som forutsier interaksjonsbindingen, inkludert hydrogenbinding, van der Waals-binding og hydrofob interaksjon til tif- eller jpeg-format.
- Når eksperimentet er fullført, vasker du prøvecellen etter trinn 7.4.
8. Statistisk analyse
- Utfør alle eksperimenter i tre uavhengige repliker (n = 3).
- Presentere eksperimentelle data som middel ± SD, og utføre statistisk analyse ved hjelp av ønsket statistisk analyseprogramvare.
- Bruk en tosidig uparet Student t-test for å sammenligne mellom to gjennomsnittsverdier eller bruke enveis variansanalyse (ANOVA) med Dunnett for flere sammenligninger mellom flere verdier til en kontrollverdi. Sett signifikansnivået til p ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatiske modningsegenskaper ble observert, inkludert binukleerte celler og polygonalformet morfologi (figur 1), spesielt i det differensierte stadiet av imHC (figur 1A). En stor økning i NTCP-ekspresjon ble målt i d-HepaRG og d-imHC ved henholdsvis 7 ganger og 40 ganger (figur 1B). Den svært glykosylerte formen for NTCP, postulert for å gi følsomhet for HBV-oppføring, ble påvist mer i d-imHC enn i d-HepaRG (figur 1C). Den differensierte imHC inneholdt 65,9% høyere NTCP-nivåer enn de udifferensierte cellene (figur 1D).
Figur 2A viser en oppsummering av den forebyggende behandlingen. Figur 2B viser HBV-immunfluorescensfarging utført for å evaluere anti-HBV-inngangsaktivitetene på dag 7 etter infeksjon, mens figur 2C skisserer HBV-bindingsanalyseprotokollen. Nivået av HBV-binding på celleoverflatereseptoren ble evaluert ved sanntids-PCR (figur 2D). For å avgjøre om NTCP var reseptor for HBV-tilknytning, ble TCA-opptak bestemt for kandidatbindende hemmere (figur 2E). Basert på denne modellen reduserte den antatte hemmende aktiviteten til kandidatforbindelser HBV-binding gjennom NTCP.
Den kalorimetriske endringen ble påvist ved kontinuerlige injeksjoner i prøvecellen (figur 3). En standard ikke-lineær minste kvadraters regresjon ble plottet basert på ett bindingssted som passet godt til dataene. Den heltrukne linjen indikerte den beste tilpasningen til de eksperimentelle verdiene (figur 3A, B). Tabell 1 viser termodynamiske parametere korrelert med bindingen av NTCP med ciklosporin A (CsA) eller en kandidatforbindelse.
Figur 1: Hepatisk modning av HepaRG og imHC med NTCP-karakterisering. Begge cellelinjene ble dyrket i levermodningsmedium i 2 uker. (A) Hepatocyttegenskaper som binukleerte celler og polygonalformet morfologi ble utelukkende observert i modningsstadiet av imHC. Skalastenger = 50 μm. (B) Uttrykket av NTCP ble oppregulert i både HepaRG og imHC. NTCP normalisert med GAPDH var høyere i imHC enn i HepaRG. (C) En svært glykosylert form for NTCP ble observert etter modning. (D) Prosentandel av NTCP-økning i d-imHC ble evaluert ved bruk av flowcytometri. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. *, ** og *** representerer statistisk forskjell med henholdsvis p < 0,05, p < 0,01 og p < 0,001. Forkortelser: NTCP = natriumtaurokolat som transporterer polypeptid; GAPDH = glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase; NTCP-FITC = fluoresceinisotiocyanat-merket NTCP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Profylaktisk CCM-behandling reduserte virusinngang, intracellulært HBV DNA og TCA-opptaksaktivitet. (A) d-imHC ble forbehandlet med CCM i 2 timer før inokuleringen med HBV. (B) Anti-HBV-inngangsaktivitet ble bestemt ved immunfluorescensfarging på dag 7 etter infeksjon. (C) En skjematisk tidsplan for HBV-bindingsprotokoll presenteres. (D) Nivået av bundet HBV-DNA på hepatocytter ble evaluert og sammenlignet med 4 μM CsA og den klassiske HBV-inngangshemmeren 25 enheter/ml heparin. (E) Effekten av 10-30 μM CCM på TCA-opptakshemming ble mediert gjennom NTCP-reseptoren. Forkortelser: CCM = curcumin; HBV = hepatitt B-virus; TCA = taurocholsyre; d-imHC = differensiert imHC; CsA = ciklosporin A; HP = heparin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: NTCPs affinitet til individuelle molekyler (CsA eller kandidatforbindelse) ble demonstrert ved bruk av ITC. ITC-profilen for kombinasjonen av NTCP med enten (A) CsA eller (B) curcumin ble generert fra sekvensiell injeksjon av en forbindelse (150 μM CsA eller kandidat) i NTCP-løsningen (15 μM NTCP, pH 7,0, 25 °C). De kalorimetriske rådataene mellom differensialeffekt (μcal/s) og tid (min) ble plottet. Data ble analysert basert på en en-steds bindingsmodell der de heltrukne linjene indikerte de beste resultatene. Under injeksjon av ligander (CSA eller curcumin) i NTCP-løsningen endret entalpien (ΔH) etter en økning i ligandkonsentrasjonen i prøvecellen. Disse dataene indikerer at bindingsreaksjonen oppstod. Forkortelser: CsA = ciklosporin A; NTCP = natriumtaurokolat som transporterer polypeptid; ITC = isotermisk titreringskalorimetri; DP = differensiell effekt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protein | Ligand | Bindingskonstant (KD) | Entalpiendring (ΔH) | Entropi endring (ΔTΔS) | Gibbs fri energiendring (ΔG) | Type binding |
| (M-1) | (kcal / mol) | (kcal / mol) | (kcal / mol) | |||
| Menneskelig NTCP (SLA10A1) | CCM | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | Hydrogenbinding |
| Menneskelig NTCP (SLA10A1) | TCA | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | Hydrofob interaksjon |
Tabell 1: Termodynamiske parametere som følge av samspillet mellom NTCP og individuelle forbindelser (CCM og TCA) ved bruk av ITC. Forkortelser: NTCP = natriumtaurokolat som transporterer polypeptid; CCM = curcumin; TCA = taurocholsyre; ITC = isotermisk titreringskalorimetri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HBV-infeksjon initieres via lavaffinitetsbinding til heparansulfatproteoglykaner (HSPG) på hepatocytter25, etterfulgt av binding til NTCP med påfølgende internalisering gjennom endocytose26. Siden NTCP er en avgjørende reseptor for HBV-oppføring, kan målretting av HBV-oppføring klinisk oversettes for å redusere de novo-infeksjon , mor-til-barn-overføring (MTCT) og tilbakefall etter levertransplantasjon. Avbryte viral oppføring ville være et mulig alternativ kur for kronisk HBV-infeksjon.
Noen kritiske trinn i ovennevnte protokoll er oppsummert her. Mens du forbereder vertsceller, må du sørge for at hepatocytter når 100% konfluens før du legger til modningsmediet med 2% DMSO. Dyrking av subkonfluente hepatocytter i 2% DMSO vil føre til celledød og løsrivelse. Modningsperioden kan forlenges opptil 4 uker for å maksimere NTCP-uttrykket27,28, selv om en 2 ukers modningsperiode anbefales.
Tre teknikker har blitt foreslått for kvantifisering av cellulært NTCP-uttrykk. Det anbefales at brukerne velger teknikken de er mest kjent med; Her foretrakk vi flowcytometri fremfor Western Blot-analyse fordi det er praktisk, raskt og enkelt.
For produksjon av cellekulturavledede HBV-partikler (HBVcc) ble HepG2.2.15 avledet fra HepG2 ved forbigående transfeksjon med HBV fulllengdegenom sammen med genetisk (G418) resistensgen29. Dyrkningsmediet skal inneholde 380-500 μg/ml genetin, ellers vil ikke cellene produsere HBVcc. Det proteinbindende filteret på 0,45 μm bør brukes til å klargjøre supernatanten for å unngå å miste HBV-utbyttet. For å konsentrere HBV ble polyetylenglykol (PEG) brukt med en standard sentrifuge. HBV-partikler kan også konsentreres ved hjelp av en sukrosegradient og ultrasentrifugering. Flere fryse- og tinesykluser bør unngås siden smittsomheten vil bli redusert.
I anti-HBV-inngangsanalysen må hepatocyttene nå 100% sammenløp før modningsinduksjon. Denne protokollen ble utviklet basert på profylaktisk behandling. Vertsceller ble utsatt for kandidatforbindelsene i 2 timer før infeksjon med HBV12. Etter 7 dager etter infeksjon ble HBV-infeksiøsitet evaluert ved hjelp av immunfluorescens. Alle komponenter, konsentrasjoner av blokkeringsløsningen, primære og sekundære antistoffer og vasketrinn må optimaliseres for å oppnå det beste resultatet med minimal, ikke-spesifikk farging. Her har vi gitt optimaliserte konsentrasjoner og teknikker.
TCA-opptaksanalyseprotokollen beskriver gullstandarden for hemming av NTCP-transport. Vi endret protokollen for å unngå radioaktiv TCA. De kritiske trinnene for TCA-opptaksanalysen er cellevask og høsting. Alle disse prosedyrene må utføres på is hele tiden for å forhindre ytterligere cellulær aktivitet-internalisering av forbindelsen. Etter homogenisering av cellene og pelletering av celleavfall, må supernatanten aspireres forsiktig uten å forstyrre pelleten. Hvis brukerens anlegg tillater bruk av flytende scintillasjonsteknikk, brukes 3H-taurokolsyre ofte i TCA-transport- og opptaksstudier. Da vi validerte TCA-opptak ved hjelp av ELISA, kan denne alternative teknikken erstatte bruken av den radioaktive forbindelsen.
ITC er en biofysisk metode som er mye brukt til å bestemme de termodynamiske parametrene knyttet til samspillet mellom oppløselige proteiner og små molekylvektligander30,31. Denne teknikken kan brukes til å undersøke samspillet mellom forskjellige ligander med et lite molekyl eller protein. ITC er en direkte og ikke-invasiv metode uten ekstra trinn for signaldeteksjon, ingen molekylvektbegrensninger, og ingen merking, immobilisering eller annen kjemisk modifikasjon. Begrensningen av ITC er forutsetningen for høye konsentrasjoner av de samvirkende materialene. Protein og ligand må være høyt renset og tilstrekkelig løselig i vann (10-100 μM) ved 25 °C i 1 time under omrøring. Den ustabile proteinløsningen kan detekteres gjennom varmesignalendring som en funksjon av tid.
Humane forsterkede NTCP-hepatocytter gir en alternativ modell for in vitro-studien av HBV-infeksjon, men ligner på HepaRG og primære humane hepatocytter. Disse vertsmodellene hindres av deres begrensede pålitelighet og følsomhet 8,33. Den ineffektive HBV-forplantningen i HepG2-NTCP- eller Huh7-NTCP-celler ble påvist av lavt HBV-inokulum avledet fra HBVcc-produserende celler. I flere studier ble HBV brukt til å infisere målcellene ved en MOI på 100033,34. De subvirale partiklene i HBVcc inneholder HBV-konvoluttprotein (L / M / S) og binder NTCP konkurransedyktig, noe som resulterer i redusert smittsomhet35. For å overvinne denne begrensningen modifiserte denne protokollen HepaRG- eller imHC-kulturen med en modningsprotokoll for å maksimere NTCP-nivåene. HBVcc avledet fra HepG2.2.15 ble konsentrert før den ble brukt som inokulum. HBV-infeksjonsevnen var høyere enn 80 % i differensiert imHC basert på måling av HBV-kjerneantigenet11.
Vi har beskrevet identifisering av anti-HBV-forbindelser rettet mot NTCP for å avbryte viral oppføring og vedtatt en hepatisk modningsprosedyre for å øke NTCP-nivåene. For å identifisere inngangshemmere ble hepatocytter forbehandlet med kandidatforbindelser i 2 timer før infeksjonen med HBV ved 4 ° C for å tillate viral binding, men ikke oppføring. Reduksjonen i HBV-infeksiøsitet ble evaluert på dag 7 etter infeksjon. De representative dataene inkluderte ciklosporin A, en klassisk NTCP-hemmer, som en positiv kontroll for å validere modellen.
Siden NTCP letter både transportør- og reseptormedierte endocytosefunksjoner, kan HBV-inngangshemmere målrette mot minst en av disse mekanismene. Hemmingen av NTCP-transport kan evalueres ved hjelp av en TCA-opptaksanalyse basert på ELISA, og eliminerer den radioaktive TCA fra den klassiske protokollen36. Affiniteten mellom NTCP og inngangshemmeren ble målt ved hjelp av ITC. Denne teknikken ga viktige termodynamiske parametere, inkludert støkiometri (n), dissosiasjonskonstant (KD), endring i fri energi (ΔG), entalpi (ΔH), entropi (ΔS) og varmekapasitet for binding (ΔCp). Ulike anti-HBV-midler har blitt identifisert ved molekylær docking, som quercetin, rutin, hesperidin og luperol, som spesifikt kan binde HBV revers transkriptase som kan sammenlignes med lamivudin, en nukleosidanalog. Forbindelsene ble undersøkt ved hjelp av ITC og viste negativ Gibb-energi (−ΔG) fra −9,3 til −5,2 kcal/mol og KD på 1 × 10-6 til 1 × 10-3 M med HBV-polymerase 37. Samlet sett vil dataene hentet fra disse nevnte analysene bidra til å skjerme den antivirale effekten av kandidatforbindelser som fungerer som HBV-inngangshemmere. Den etablerte protokollen vil være nyttig for å oppdage nye NTCP-antagonister / hemmere. Undertrykkelsen av viral oppføring kan være nyttig i profylaktisk og terapeutisk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette forskningsprosjektet er støttet av Mahidol University og Thailand Science Research and Innovation (TSRI) separat tildelt A. Wongkajornsilp og K. Sa-ngiamsuntorn. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council gjennom Program Management Unit for Competitiveness (tilskuddsnummer C10F630093). A. Wongkajornsilp er mottaker av et Chalermprakiat-stipend fra Det medisinske fakultet Siriraj Hospital, Mahidol University. Forfatterne vil gjerne takke Miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Fakultet for naturvitenskap, Mahidol University) for hennes hjelp med ITC-teknikken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J.
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
- Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
- Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
- Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
- Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
- Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
- Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
- Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
- Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
- Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
- Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
- Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
- Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
- Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
- Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
- Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
- Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
- Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
- Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
- Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
- Srivastava, V. K., Yadav, R. Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).
- Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
- Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
- Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
- Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).
