Summary
我们提出了一种针对病毒进入前和进入生命周期阶段的抗乙型肝炎病毒（HBV）化合物的协议，使用等温滴定量热法测量与宿主牛磺胆酸钠共转运多肽的结合亲和力（KD）。通过抑制病毒生命周期标志物（cccDNA形成，转录和病毒组装）来确定抗病毒功效。
Abstract
乙型肝炎病毒（HBV）感染被认为是肝细胞癌的关键危险因素。目前的治疗只能减轻病毒载量，但不能完全缓解。HBV感染的有效肝细胞模型将提供真实的病毒生命周期，这对于筛选治疗剂至关重要。大多数可用的抗HBV药物针对病毒进入后的生命周期阶段，而不是病毒进入之前。该协议详细说明了能够筛选针对病毒进入前和病毒进入后生命周期阶段的治疗剂的感受态肝细胞模型的生成。这包括靶向牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）结合，cccDNA形成，转录和基于imHC或HepaRG作为宿主细胞的病毒组装。在这里，HBV进入抑制测定使用姜黄素通过NTCP抑制HBV结合和转运功能。使用等温滴定量热法（ITC）评估抑制剂与NTCP的结合亲和力（KD），ITC是一种基于热力学参数的HBV药物筛选通用工具。
Introduction
乙型肝炎病毒（HBV）感染在世界范围内被认为是一种危及生命的疾病。慢性HBV感染有肝硬化和肝细胞癌的风险1。目前的抗HBV治疗主要集中在使用核苷（酸）类似物（NAs）和干扰素-α（IFN-α）进入病毒后2，3。HBV进入抑制剂Myrcludex B的发现确定了抗HBV药物的新靶点4。与仅靶向病毒复制的抑制剂相比，慢性HBV中进入抑制剂和NAs的组合显着降低了病毒载量5，6。然而，用于筛选HBV进入抑制剂的经典肝细胞模型受到低病毒受体水平（牛磺胆酸钠共转运多肽，NTCP）的限制。hNTCP在肝癌细胞（即HepG2和Huh7）中的过表达可提高HBV感染性7，8。然而，这些细胞系表达低水平的I期和II期药物代谢酶，并表现出遗传不稳定性9。肝细胞模型可以帮助靶向候选抗HBV化合物的不同机制，如病毒前进入，NTCP结合和病毒进入，将加快有效联合方案的鉴定和开发。姜黄素抗HBV活性的研究阐明了抑制病毒进入作为病毒进入后中断的新机制。该协议详细介绍了用于筛选抗HBV进入分子的宿主模型10。
该方法的目标是探索用于抑制病毒进入的候选抗HBV化合物，特别是阻断NTCP结合和转运。由于NTCP表达是HBV进入和感染的关键因素，我们优化了肝细胞成熟方案，以最大限度地提高NTCP水平11。此外，该方案可以将对HBV进入的抑制作用区分为抑制HBV附着与抑制内化。牛磺胆酸（TCA）摄取测定也使用基于ELISA的方法而不是放射性同位素进行修饰，以表示NTCP转运12，13。受体和配体的相互作用通过它们的3D结构14，15得到证实。NTCP功能的抑制可以通过测量TCA摄取活性来评估16。然而，该技术并未提供NTCP与候选抑制剂结合的直接证据。因此，可以使用各种技术来研究结合，例如表面等离子体共振17，ELISA，基于荧光的热移位测定（FTSA）18，FRET19，AlphaScreen和各种其他方法20。在这些技术中，ITC是结合分析的目标标准，因为它几乎可以观察每个反应中的吸热或发射21。使用ITC直接评估NTCP和候选化合物的结合亲和力（KD）;这些亲和力值比使用 计算机 预测模型22获得的值更精确。
该协议涵盖了肝细胞成熟，HBV感染和HBV进入抑制剂筛查的技术。简而言之，基于imHC和HepaRG细胞系开发了肝细胞模型。培养的细胞在2周内分化为成熟的肝细胞。使用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹和流式细胞术检测NTCP水平的上调11。乙型肝炎病毒粒子（HBVcc）是从HepG2.2.15中产生和收集的。分化的imHC或HepaRG（d-imHC，d-HepaRG）在接种HBV病毒粒子前2小时用抗HBV候选物预防性处理。实验的预期结果是鉴定降低细胞HBV和感染性的药物。使用TCA摄取测定法评估抗NTCP活性。NTCP活性可以被特异性结合NTCP的代理抑制。采用ITC技术研究了可以预测抑制剂及其靶蛋白的交互式结合的可行性，通过生物分子复合物23，24的非共价相互作用确定配体对受体的结合亲和力（KD）。例如，K D ≥ 1 × 103 mM代表弱结合，K D ≥ 1 × 10 6 μM代表中等结合，K D ≤ 1 ×10 9 nM代表强结合。ΔG与结合相互作用直接相关。特别是，负ΔG的反应是用力反应，表明结合是一个自发过程。负ΔH的反应表明结合过程取决于氢键和范德华力。TCA摄取和ITC数据都可用于筛查抗HBV进入剂。这些方案的结果不仅可以为抗HBV筛查提供基础，还可以通过结合亲和力和转运功能评估与NTCP的相互作用。本文描述了宿主细胞的制备和表征、实验设计以及抗HBV条目以及NTCP结合亲和力的评估。
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Protocol
注意：以下程序必须在II类生物危害流罩或层流罩中执行。乙肝病毒的处理得到了IRB的道德批准（MURA2020/1545）。有关本协议中使用的所有溶液、试剂、设备和细胞系的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 制备宿主细胞（成熟肝细胞）
- 培养肝细胞（3.75 × 105 细胞 HepaRG 或 imHC）并保持在 75 cm2 培养瓶中，培养瓶中装有 10 mL DMEM/F12 培养基，补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、1% L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。等待细胞达到80%-90%汇合（1周内）。
- 从烧瓶中弃去旧培养基，并用4mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。
- 吸出 PBS 并加入 4 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。
- 将烧瓶在37°C培养箱中孵育2-3分钟，并使用带有10倍物镜的倒置显微镜检查贴壁细胞。确保单层已从培养表面分离。
- 通过向烧瓶中加入4mL补充有10%FBS的培养基来抑制胰蛋白酶，并小心地重悬收获的细胞。将细胞悬液转移到15mL锥形管中，并在300× g，25°C下离心3分钟。
- 从细胞沉淀中吸出上清液，并用补充有10%FBS和抗生素的1-2mL预热培养基重悬。
- 混合 10 μL 细胞悬液和台盼蓝，并使用血细胞计数器计数细胞。在进行下一步之前，请确保细胞活力高于90%。
- 在 6 孔板的每个孔中每 2 mL 接种 1 × 10个 6 个细胞，并保持在 DME/F12 完全培养基中，直到细胞达到 100% 汇合。
- 对于肝脏成熟，准备肝成熟培养基（Williams' E 培养基补充有 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、5 μg/mL 胰岛素、50 μM 氢化可的松、2 mM L-谷氨酰胺和 2% DMSO）。
- 每周更换培养基2次。
- 将肝细胞在成熟培养基中维持2周，以获得准备HBV感染的成熟肝细胞。
2. 细胞NTCP的定量
- 使用实时荧光定量 PCR 测量 NTCP 表达
- 通过胰蛋白酶消化收集成熟肝细胞的沉淀（参见步骤1.2-1.5）。
- 使用带有 DNase I 处理的 RNA 提取试剂盒从细胞沉淀中提取总 RNA。
- 按照制造商的说明，使用寡核苷酸-dT 引物和逆转录系统从 200 ng 的总 RNA 合成 cDNA。
- 将 cDNA 稀释至 50 ng/μL，并将其用作 PCR 反应的模板。将 2 μL 稀释的 cDNA 与含有 SYBR 绿色 qRT-PCR 试剂盒溶液的 PCR 预混试剂与 5 μM NTCP 特异性引物（5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' 和 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3'）混合。
- 为了标准化，使用 GAPDH 作为具有特定引物（5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3'和5'-AAATGAGCCCCAGCCTTC-3'）的管家基因。
- 在以下温度条件下使用热循环仪扩增cDNA样品：在95°C下1个3分钟的循环（初始变性）;95°C（变性）下40个周期，30秒，60°C至65°C（退火）30秒，72°C下30秒（延伸）;在72°C下1个循环5分钟（最终延伸）。
- 使用 GAPDH 作为基于 2-ΔΔCT 方法的校准基因计算成熟肝细胞在未分化细胞上的 NTCP 倍数变化。
- 使用蛋白质印迹分析定量NTCP
- 使用细胞刮刀收获肝细胞，并在300× g，25°C下离心5分钟以收集细胞沉淀。
- 按照 RIPA 缓冲液制造商的说明，使用含有 1x 蛋白酶抑制剂的 100 μL RIPA 缓冲液提取细胞蛋白。
- 使用二辛可宁酸（BCA）方法测量总蛋白质浓度。
- 将 12.5 μL 蛋白质与 2x 上样染料以 1：1 体积比混合。
- 将蛋白质混合物和标准分子量标准品在95°C下煮沸5分钟。
- 向电泳室中加入1x电泳缓冲液。
- 在 10% （w/v） 聚丙烯酰胺凝胶中上样 5 μL 蛋白质标准品或 20 μL 煮沸的蛋白质混合物。
- 进行凝胶电泳：50 V30分钟，然后在室温下90 V持续1小时。
- 通过将PVDF膜浸泡在甲醇中30秒来制备PVDF膜，用双蒸水洗涤1-2分钟，然后将其与两张滤纸一起浸泡在转印缓冲液中10分钟或直到使用。
- 将滤纸放在半干式转移电池的阳极板上;然后，按该顺序将PVDF膜，凝胶和滤纸放在顶部。
- 在室温下，将蛋白质从凝胶转移到10V的PVDF膜上25分钟。
- 在室温下用WB封闭溶液封闭膜1小时。
- 将膜与抗牛磺胆酸钠共转运多肽（抗NTCP）（1：100稀释）在4°C孵育过夜。
- 用TBST洗涤膜3 x 10分钟。
- 将膜与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗兔抗体（1：10，000稀释）在室温下孵育1小时。
- 用TBST洗涤膜3 x 10分钟，然后用TBS洗涤膜1 x 5分钟。
- 使用HRP底物检测NTCP（参见 材料表）。
- 加入至少0.1mL的HRP底物溶液/ cm2 的膜，并在黑暗中孵育膜3-5分钟。
- 使用凝胶记录系统在化学发光模式下可视化NTCP，选择膜的标记选项，每1分钟以累积模式调整曝光时间，并以不同的曝光时间拍摄5分钟的照片。
- 用小鼠抗 GAPDH 抗体（1：200，000 稀释液）和 HRP 偶联山羊抗小鼠二抗（1：10，000 稀释度）剥离并探测印迹。
- 使用流式细胞术测量NTCP水平
- 通过将细胞与8mM EDTA孵育15分钟来收集成熟肝细胞的细胞沉淀。
注意：避免使用胰蛋白酶或其他可能破坏细胞表面受体的蛋白酶。由于NTCP是一种细胞表面受体蛋白，胰蛋白酶消化引起的损伤会产生阴性结果。 - 用 300 μL 3.7% 多聚甲醛在 1x PBS 中固定肝细胞 15 分钟。将细胞悬液转移到1.5mL微量离心管中，并在300× g，25°C下离心10分钟。
- 用 700 μL 1x PBS 和 1% FBS （v/v） 洗涤细胞 2 次，在 300 × g、25 °C 下离心 10 分钟，向细胞沉淀中加入 300 μL 0.05% Triton X-100 在 PBS 中，并将细胞在室温下孵育 20 分钟以透化它们。
- 在300× g，25°C下离心10分钟，用含有1%FBS（v / v）的700μLPBS洗涤细胞沉淀3 x 1分钟。将细胞与针对NTCP的一抗（1：100稀释）在4°C孵育30分钟。用Perm / Wash缓冲液洗涤细胞3 x 1分钟，并在300× g，25°C下离心10分钟。
- 用与Alexa Fluor 488偶联的二抗在4°C下染色细胞30分钟。用Perm / Wash缓冲液洗涤细胞3 x 1分钟，并在300× g，25°C下离心10分钟。 用 200 μL PBS 和 1% FBS （v/v） 重悬细胞沉淀。
- 打开流式细胞仪，预热激光15分钟，然后进行常规清洁。
- 选择测量参数，包括前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）和异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE），并通过软件设置 自动补偿调整 。包括补偿对照样品：未染色对照、FITC染色对照和PE染色对照。
注意： FSC 和 SSC 参数用于确定单个细胞的大小和粒度，以选择用于门控分析的细胞群。荧光通道检测器具有 FITC 和 PE 通道。对于此协议，请选择 FITC 通道以检测 Alexa Fluor 488。 - 以中等流速（60μL/min）运行未染色的样品，调整FSC和SSC的阈值，直到它们覆盖感兴趣的细胞群，标记该区域的门区域，并应用于所有补偿对照。
- 使用未染色对照设置荧光光电倍增管（PMT），并在负象限中调节FITC或PE的PMT电压。运行阳性染色样品并在阳性象限刻度中调整 FITC 或 PE。运行未染色、FITC染色或PE染色的对照，计算补偿，并将其应用于样品设置。运行肝细胞样本以测量NTCP水平。
- 使用流式细胞仪软件分析染色的肝细胞（参见 材料表）。
- 在BD FACSuite窗口下，单击“数据源”选项卡中的控制管，然后等待原始数据出现。
- 在右侧的 工作表 选项卡中，单击椭圆 门 按钮，使用鼠标光标选择 SSC 中的细胞群 和 FSC 点图 ，然后等待圆圈 P1 出现。
- 单击 间隔门 按钮并在FITC直方图中标记区域，从最高荧光强度值开始到右侧。观察出现的行 P2。
- 单击 实验管 并观察 工作表选项卡中的数据 是否发生变化。单击“ 统计信息 ”按钮，然后单击工作表中的空白区域。观察出现的 NTCP 总体的统计值。
- 通过将细胞与8mM EDTA孵育15分钟来收集成熟肝细胞的细胞沉淀。
3. 生产细胞培养衍生的HBV颗粒（HBVcc）
- 在完全培养基（DMEM补充有10%FBS，100U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素）中培养HepG2.2.15在10cm培养皿中培养24小时。
- 当HepG2.2.15达到60%-70%汇合时，更换补充有380μg/mL遗传素（G418）的完整培养基。每2天收获一次有条件的培养基;将含有HBV的培养基储存在4°C。
- 通过将上清液在5，000× g，4°C下离心20分钟来除去细胞碎片。使用 20 mL 注射器收集条件培养基，并通过 0.45 μm 低蛋白结合过滤器过滤以去除细胞碎片。
- 为了浓缩HBV，在锥形离心管中用步骤3.3中的3体积过滤上清液稀释1体积的浓缩器，并通过管倒置小心地混合溶液。将混合物置于4°C下1小时。将溶液在1，500× g，4°C下离心1小时，并确保可见灰白色沉淀。
注意：对于步骤 3.3 中每 30 mL 过滤上清液，加入 10 mL 浓缩器以达到总体积的 40 mL。 - 使用绝对实时荧光定量 PCR 评估 HBV 滴度（基因组当量）与 HBV 1.3-mer WT 复制子作为标准曲线，范围从 1 × 102 到 1 × 1010 ，如前所述11。
- 在FBS中轻轻地重建沉淀，并在-80°C下以一次性等分试样储存长达1年。
4. 抗乙肝病毒进入检测
- 在成熟培养基（Williams's E 培养基中的 2% DMSO、10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、5 μg/mL 胰岛素、50 μM 氢化可的松和 2 mM L-谷氨酰胺）的 6 孔板中保持 100% 汇合 imHC 或 HepaRG 2 周，每周更换培养基 2 次。
- 吸出培养基，然后加入用威廉E培养基稀释的姜黄素（10-30μM）或4μM环孢菌素A（CsA）2小时。吸出候选HBV进入抑制剂，并用含有4%聚乙二醇的1mL威廉E培养基代替。
- 以每孔100的感染多重性（MOI）向培养基中加入HBV颗粒，并在37°C下孵育18小时。弃去上清液，加入 2 mL 冷 PBS，轻轻旋转以用未结合的 HBV 冲洗掉旧培养基。
- 加入 2 mL 完整的威廉 E 培养基并培养 7 天。吸出培养基，用1x PBS洗涤细胞，并在室温下用3.7%多聚甲醛在PBS中固定细胞15分钟。用IF封闭溶液（PBS中的0.2%Triton X-100和3%牛血清白蛋白）透化并封闭感染的细胞，并在室温下孵育60分钟。
- 在封闭溶液中以1：200稀释度加入一抗（抗HBV核心抗原），并在4°C孵育过夜。 用洗涤溶液（PBS中的0.5%吐温20）洗涤细胞3 x 1分钟。
- 将二抗（1：500稀释度）加入IF封闭溶液中，在室温下孵育1小时，并用洗涤溶液洗涤细胞3 x 1分钟。
- 用含有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗淬灭封片剂安装样品，并用玻璃盖玻片盖住。使用配备DAPI滤光片（Ex 352-402 nM和Em 417-477）和PE滤光片（Ex 542-582和Em 604-644）以及20倍物镜的荧光显微镜检测荧光信号，并确定候选化合物的抗HBV进入活性。
5. HBV细胞结合试验
- 在成熟培养基（Williams's E 培养基中的 2% DMSO、10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、5 μg/mL 胰岛素、50 μM 氢化可的松和 2 mM L-谷氨酰胺）的 6 孔板中保持 100% 汇合 imHC 或 HepaRG 2 周，每周更换培养基 2 次。
- 吸出培养基，然后加入在威廉E培养基中稀释的姜黄素（10-30μM）或环孢菌素A（4μM）2小时。吸出HBV进入抑制剂，并用含有4%聚乙二醇的1mL威廉E培养基代替。
- 以每孔100的MOI向培养基中加入HBV颗粒，并在4°C下孵育2小时以使HBV与肝细胞结合。丢弃含有未结合HBV的培养基，加入2 mL冷PBS，轻轻旋转以去除用过的培养基的痕迹。
- 使用细胞刮刀收获感染的细胞，并用裂解缓冲液破坏细胞。将裂解物转移到收集管中并提取总DNA，使用实时荧光定量PCR和HBV特异性引物（正向引物：5'-GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3'）和反向引物：5'-GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3' ）作为内 控。
- 使用步骤2.1中所述的温度条件在热循环仪中扩增PCR产物。
- 计算治疗中相对HBV DNA水平/ 1×106 个细胞与对照组使用 PRNP 作为基于2-ΔΔCT 方法的校准基因。
6. 牛磺胆酸 （TCA） 摄取测定
- 在成熟培养基中保持 100% 汇合的 imHC 和 HepaRG 细胞 14 天。
- 吸出培养基并用1x PBS洗涤肝细胞。加入姜黄素或环孢菌素A（10-50μM）在威廉的E培养基中稀释2小时。用牛磺胆酸钠溶液（1x HEPES中的0.5M牛磺胆酸钠水合物）替换培养基，并在室温下孵育15分钟。
- 吸出牛磺胆酸钠溶液，用冷的1x HEPES洗涤3次。加入 300-500 μL 冷的 1x HEPES，并在冰上用细胞刮刀收获细胞。
- 通过超声处理以20kHz的频率匀浆细胞20秒，并在冰上孵育5分钟。将裂解物以10，000× g 离心20分钟以沉淀细胞碎片。收集上清液并使用TCA ELISA测定试剂盒评估细胞内牛磺胆酸浓度（参见 材料表）。
7. 使用等温滴定量热法测定蛋白质-配体相互作用
注意：该检测系统是基于MicroCal PEAQ-ITC（ITC软件）开发的。
- 制备缓冲液（50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.0）。
- 在缓冲液中制备15μMNTCP。
- 在缓冲液中制备150μM候选HBV进入抑制剂溶液。
- 使用缓冲液清洗ITC仪器中的样品池，参比池和注射器（步骤7.1）。
- 通过双击Windows系统中的软件图标来启动ITC软件。在“运行实验突出显示”选项卡下，为19 Injection.itcm选择microCal方法，然后单击“打开”。当新窗口打开时，单击清洁选项卡，然后在清洁方法窗口中，选择用于细胞清洁方法的“清洗”按钮和用于注射器清洁方法的“冲洗”按钮。 单击下一步，然后按照屏幕上的说明进行操作。
注意：洗涤步骤可能需要1.4小时才能完成。
- 通过双击Windows系统中的软件图标来启动ITC软件。在“运行实验突出显示”选项卡下，为19 Injection.itcm选择microCal方法，然后单击“打开”。当新窗口打开时，单击清洁选项卡，然后在清洁方法窗口中，选择用于细胞清洁方法的“清洗”按钮和用于注射器清洁方法的“冲洗”按钮。 单击下一步，然后按照屏幕上的说明进行操作。
- 将样品装入ITC;在 “运行实验 ”选项卡下，单击“ 加载 ”按钮，然后阅读屏幕上的说明。单击 下一步 并按照视频说明进行操作，直到完成此加载步骤。
- 使用注射器用溶液缓冲液填充参比细胞。使用注射器在缓冲液中用15μM NTCP填充样品池，并除去样品池上多余的NTCP溶液。用150μM的姜黄素（配体）溶液填充注射器，避免注射器中的气泡。
- 运行示例，然后在“运行试验”选项卡下，单击“运行”按钮。观察左侧显示实验信息和实验设置的窗口。输入配体和蛋白质浓度，在[糖浆]中为150μM，在[细胞]中为15μM，在温度中为25°C。
- 在软件中，单击 开始 执行注射过程并等待1.4小时以完成蛋白质 - 配体相互作用。
注：淡出 的分析 按钮显示在软件窗口下方。 - 观察注射 完成后分析按钮 变亮。点击控制软件中的分析按钮，使用 分析 软件分析原始数据。单击 概览 以显示原始数据，并选择拟合模型作为 一组结合位点。
- 确保结合状态显示实验数据（结合、无结合、对照或检查数据），并且实验值（KD、ΔG、ΔH、TΔS 和 N）显示在软件面板上。
- 将预测相互作用结合的热力学参数（包括氢键、范德华键和疏水相互作用）导出为 tif 或 jpeg 格式。
- 实验完成后，按照步骤7.4洗涤样品池。
8. 统计分析
- 在三个独立的重复中执行所有实验（n = 3）。
- 将实验数据作为SD±手段，并使用所需的统计分析软件进行统计分析。
- 使用双尾未配对学生 t 检验比较两个平均值，或使用 Dunnett 应用单因素方差分析 （ANOVA） 对多个值与控制值进行多重比较。将显著性水平设置为 p ≤ 0.05。
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Representative Results
观察到肝脏成熟特征，包括双核细胞和多边形形态（图1），特别是在imHC的分化阶段（图1A）。在d-HepaRG和d-imHC中分别以7倍和40倍测量NTCP表达的大幅增加（图1B）。高度糖基化的NTCP形式，假设赋予HBV进入的敏感性，在d-imHC中检测到的比在d-HepaRG中检测到的更多（图1C）。分化的imHC含有比未分化细胞高65.9%的NTCP水平（图1D）。
图2A 显示了预防性治疗的摘要。图 2B 显示了HBV免疫荧光染色，用于评估感染后第7天的抗HBV进入活性，而 图2C 概述了HBV结合测定方案。通过实时荧光定量PCR评估HBV在细胞表面受体上的结合水平（图2D）。为了确定NTCP是否是HBV附着的受体，确定了候选结合抑制剂的TCA摄取（图2E）。基于该模型，候选化合物的假定抑制活性降低了通过NTCP的HBV结合。
通过连续向样品池进样来检测量热变化（图3）。基于一个与数据拟合良好的结合位点绘制标准非线性最小二乘回归。实线表示最适合实验值（图3A，B）。 表1 显示了与NTCP与环孢菌素A（CsA）或候选化合物结合相关的热力学参数。
图 1：具有 NTCP 表征的 HepaRG 和 imHC 的肝脏成熟。两种细胞系均在肝成熟培养基中培养2周。（A）在imHC的成熟阶段仅观察到肝细胞特征，例如双核细胞和多边形形态。比例尺 = 50 μm. （B）NTCP的表达在HepaRG和imHC中均上调。使用GAPDH标准化的NTCP在imHC中高于HepaRG。（C）成熟后观察到高度糖基化的NTCP形式。（D）使用流式细胞术评估d-imHC中NTCP升高的百分比。数据以平均值表示，±标准偏差*、**和***分别表示p<0.05、p <0.01和p <0.001 的统计差异。缩写：NTCP =牛磺胆酸钠共转运多肽;GAPDH = 甘油醛 3-磷酸脱氢酶;NTCP-FITC = 异硫氰酸荧光素标记的 NTCP。请点击此处查看此图的大图。
图 2：预防性 CCM 治疗可降低病毒进入、细胞内 HBV DNA 和 TCA 摄取活性 。 （A）d-imHC在接种HBV之前用CCM预处理2小时。（B）在感染后第7天通过免疫荧光染色测定抗HBV进入活性。（C）给出了HBV结合方案的示意图。（D）评估肝细胞上结合的HBV DNA水平，并与4μM CsA和经典HBV进入抑制剂25单位/mL肝素进行比较。（E）10-30μM CCM对TCA摄取抑制的影响是通过NTCP受体介导的。缩写：CCM = 姜黄素;HBV = 乙型肝炎病毒;TCA = 牛磺胆酸;d-imHC = 分化 imHC;CsA = 环孢素 A;HP=肝素。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：使用 ITC 证明了 NTCP 对单个分子（CsA 或候选化合物）的亲和力。 NTCP与（A）CsA或（B）姜黄素组合的ITC曲线是通过将化合物（150μM CsA或候选化合物）顺序注入NTCP溶液（15μMNTCP，pH 7.0，25°C）中产生的。绘制了差分功率（μcal/s）和时间（min）之间的量热原始数据。基于单位点结合模型分析数据，其中实线表示最佳拟合结果。在将配体（CSA或姜黄素）注入NTCP溶液期间，样品池中配体浓度增加后焓（ΔH）发生变化。这些数据表明发生了结合反应。缩写：CsA = 环孢菌素 A;NTCP = 牛磺胆酸钠共转运多肽;ITC = 等温滴定量热法;DP = 差分功率。 请点击此处查看此图的大图。
| 蛋白 | 配体 | 结合常数 （KD） | 焓变 （ΔH） | 熵变化 （ΔTΔS） | 吉布斯自由能变化 （ΔG） | 装订类型 |
| （M-1） | （千卡/摩尔） | （千卡/摩尔） | （千卡/摩尔） | |||
| 人类NTCP （SLA10A1） | CCM | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | 氢键 |
| 人类NTCP （SLA10A1） | 三甲酸 | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | 疏水相互作用 |
表1：使用ITC的NTCP与单个化合物（CCM和TCA）相互作用产生的热力学参数。 缩写：NTCP =牛磺胆酸钠共转运多肽;CCM = 姜黄素;TCA = 牛磺胆酸;ITC = 等温滴定量热法。
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Discussion
HBV感染通过与肝细胞25上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）的低亲和力结合而引发，然后与NTCP结合，随后通过内吞作用26内化。由于NTCP是HBV进入的关键受体，因此靶向HBV进入可以在临床上转化为减少 新发 感染，母婴传播（MTCT）和肝移植后的复发。阻断病毒进入将是慢性HBV感染的可行替代疗法。
这里总结了上述协议中的一些关键步骤。在制备宿主细胞时，在加入含有2%DMSO的成熟培养基之前，确保肝细胞达到100%汇合。在2%DMSO中培养亚融合肝细胞将导致细胞死亡和脱离。成熟期可以延长至4周，以最大限度地提高NTCP表达27，28，但建议成熟期为2周。
已经提出了三种技术来量化细胞NTCP表达。建议用户选择他们最熟悉的技术;在这里，我们更喜欢流式细胞术而不是蛋白质印迹分析，因为它方便、快速且简单。
为了生产细胞培养来源的HBV颗粒（HBVcc），HepG2.2.15通过瞬时转染与HBV全长基因组和遗传素（G418）抗性基因29一起来源于HepG2。培养基应含有380-500μg/mL的遗传素，否则细胞不会产生HBVcc。应使用低蛋白结合的0.45μm过滤器澄清上清液，以避免HBV产量损失。为了浓缩HBV，聚乙二醇（PEG）与标准离心机一起使用。HBV颗粒也可以使用蔗糖梯度和超速离心进行浓缩。应避免多次冻融循环，因为传染性会降低。
在抗HBV进入测定中，肝细胞在诱导成熟之前必须达到100%汇合。该方案是基于预防性治疗开发的。在感染HBV12之前，将宿主细胞暴露于候选化合物2小时。感染后7天后，使用免疫荧光评估HBV感染性。必须优化所有组分、封闭溶液浓度、一抗和二抗以及洗涤步骤，以尽量减少非特异性染色获得最佳结果。在这里，我们提供了优化的浓度和技术。
TCA摄取测定方案描述了抑制NTCP转运的金标准。我们修改了协议以避免放射性TCA。TCA摄取测定的关键步骤是细胞洗涤和收获。所有这些程序必须始终在冰上进行，以防止化合物的进一步细胞活性内化。在均质化细胞和沉淀细胞碎片后，必须在不破坏沉淀的情况下轻轻吸出上清液。如果用户的设施允许使用液体闪烁 技术，则3 H-牛磺胆酸通常用于TCA转运和摄取研究。当我们使用ELISA验证TCA吸收时，这种替代技术可以替代放射性化合物的使用。
ITC是一种生物物理方法，广泛用于确定与可溶性蛋白质和小分子量配体30，31之间的相互作用相关的热力学参数。该技术可用于研究各种配体与小分子或蛋白质的相互作用。ITC是一种直接且无创的方法，无需额外的信号检测步骤，没有分子量限制，也没有标记，固定或任何其他化学修饰。ITC的局限性是高浓度相互作用材料的先决条件。蛋白质和配体必须高度纯化，并在25°C下搅拌下充分溶于水（10-100μM）1小时。不稳定的蛋白质溶液可以通过热信号随时间的变化来检测。
人增强NTCP肝细胞为HBV感染的 体外 研究提供了另一种模型，但与HepaRG和原代人肝细胞相似。这些主机模型受到其有限的可靠性和敏感性的阻碍8，33.HBV在HepG2-NTCP或Huh7-NTCP细胞中的低效繁殖由来自HBVcc产生细胞的低HBV接种物证明。在几项研究中，HBV用于感染靶细胞，MOI为1，00033，34。HBVcc中的亚病毒颗粒含有HBV包膜蛋白（L/M/S）并竞争性结合NTCP，导致感染性降低35。为了克服这一限制，该协议用成熟方案修改了HepaRG或imHC培养物，以最大限度地提高NTCP水平。来源于HepG2.2.15的HBVcc在用作接种物之前被浓缩。根据HBV核心抗原11的测量，分化imHC的HBV感染率高于80%。
我们已经描述了靶向NTCP的抗HBV化合物的鉴定，以中断病毒进入，并采用了肝脏成熟程序来提高NTCP水平。为了鉴定进入抑制剂，在4°C下用HBV感染之前，用候选化合物预处理肝细胞2小时，以允许病毒结合但不能进入。在感染后第7天评估HBV感染性的降低。代表性数据包括环孢素A，一种经典的NTCP抑制剂，作为阳性对照来验证模型。
由于NTCP促进转运蛋白和受体介导的内吞功能，HBV进入抑制剂可以靶向这些机制中的至少一种。NTCP转运的抑制可以使用基于ELISA的TCA摄取测定来评估，从而从经典方案中消除放射性TCA36。使用ITC测量NTCP与进入抑制剂之间的亲和力。该技术提供了基本的热力学参数，包括化学计量（n），解离常数（KD），自由能（ΔG），焓（ΔH），熵（ΔS）和结合热容（ΔCp）。通过分子对接已经鉴定出各种抗HBV药物，如槲皮素、芦丁、橙皮苷和羽哌罗尔，它们可以特异性结合HBV逆转录酶，可与核苷类似物拉米夫定相媲美。使用ITC研究了这些化合物，其吉布负能量（−ΔG）范围为-9.3至-5.2 kcal/mol，KD为1 × 10-6至1 × 10-3 M，HBV聚合酶37。综上所述，从上述测定中获得的数据将有助于筛选作为HBV进入抑制剂的候选化合物的抗病毒功效。已建立的方案将有助于发现新的NTCP拮抗剂/抑制剂。抑制病毒进入可能有助于预防和治疗。
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Disclosures
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可以解释为潜在的利益冲突。
Acknowledgments
该研究项目由玛希隆大学和泰国科学研究与创新（TSRI）分别授予A. Wongkajornsilp和K. Sa-ngiamsuntorn。这项工作由国家高等教育科学研究和创新政策委员会办公室通过竞争力项目管理单位（批准号C10F630093）提供财政支持。A. Wongkajornsilp是玛希隆大学医学院Siriraj医院Chalermprakiat赠款的获得者。作者要感谢Sawinee Seemakan小姐（玛希隆大学理学院药物发现优秀中心）对ITC技术的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
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