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Neuroscience

विवो में प्रजनन क्षमता को बढ़ावा देने के लिए माउस रेटिना में संवहनी चोट रीडआउट

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63782
Automatic Translation
1, 2, 1, *1, *1,3,4
1Department of Pathology & Cell Biology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Department of Neurology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 4The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम रेटिना वेन रोड़ा (आरवीओ) के अध्ययन में फ्लोरेसिन एंजियोग्राफी (एफए) और ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) छवियों के लिए तीन डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

नेत्र इमेजिंग उपकरणों में प्रगति न्यूरोवास्कुलर चोट के पशु मॉडल के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं तक पहुंच का एक अभूतपूर्व स्तर प्रदान करती है। इस अधिक से अधिक हस्तांतरणीयता का उचित लाभ उठाने के लिए, इन छवियों से मात्रात्मक डेटा खींचने के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों को तैयार करने की आवश्यकता है। ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) इमेजिंग माइक्रोमीटर रिज़ॉल्यूशन पर रेटिना हिस्टोलॉजी को हल कर सकती है और संवहनी रक्त प्रवाह में कार्यात्मक अंतर प्रकट कर सकती है। यहां, हम नॉनइनवेसिव संवहनी रीडआउट को चित्रित करते हैं जिसका उपयोग हम रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ) के अनुकूलित माउस मॉडल में संवहनी अपमान के बाद पैथोलॉजिकल क्षति को चिह्नित करने के लिए करते हैं। इन रीडआउट में रेटिना आकृति विज्ञान का लाइव इमेजिंग विश्लेषण, केशिका इस्किमिया के रेटिना आंतरिक परतों (डीआरआईएल) माप का विघटन, और रेटिना एडिमा और संवहनी घनत्व के फ्लोरेसिन एंजियोग्राफी उपाय शामिल हैं। ये तकनीकें क्लिनिक में रेटिना रोग वाले रोगियों की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों के सीधे अनुरूप हैं। इन विधियों को मानकीकृत करने से नेत्र रोग के नैदानिक फेनोटाइप के साथ पशु मॉडल की प्रत्यक्ष और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तुलना सक्षम होती है, जिससे संवहनी चोट मॉडल की अनुवाद शक्ति बढ़ जाती है।

Introduction

न्यूरोवास्कुलर रोग इस्केमिक स्ट्रोक के लिए जिम्मेदार एक प्रमुख स्वास्थ्य देखभाल समस्या है, जो मृत्यु दर और रुग्णता का एक प्रमुख कारण है, और रेटिना संवहनी रोग जो दृष्टि हानि 1,2 का कारण बनते हैं। न्यूरोवास्कुलर रोग को मॉडल करने के लिए, हम रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ) के एक माउस मॉडल को नियोजित करते हैं। यह मॉडल नॉनइनवेसिव है और नैदानिक सेटिंग में रेटिना संवहनी रोग वाले लोगों की जांच करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विवो इमेजिंग तकनीकों में समान उपयोग करता है। इस मॉडल का उपयोग इस प्रकार इस मॉडल का उपयोग करने वाले अध्ययनों की अनुवाद क्षमता को बढ़ाता है। सभी माउस मॉडल के साथ, मॉडल की प्रजनन क्षमता को अधिकतम करना महत्वपूर्ण है।

रेटिना संवहनी रोग 70 वर्ष से कम उम्र के लोगों में दृष्टि हानि का एक प्रमुख कारण है। मधुमेह रेटिनोपैथी3 के बाद आरवीओ दूसरा सबसे आम रेटिना संवहनी रोग है। आरवीओ की नैदानिक विशेषताओं में न्यूरोनल हानि 3,4 के परिणामस्वरूप इस्केमिक चोट, रेटिना एडिमा और दृष्टि हानि शामिल हैं। प्रमुख जहाजों के लेजर फोटोकोग्यूलेशन का उपयोग करके आरवीओ के माउस मॉडल विकसित किए गए हैं और मानव आरवीओ 5,6,7 में देखे गए प्रमुख नैदानिक विकृति को दोहराने के लिए परिष्कृत किए गए हैं। नेत्र इमेजिंग में प्रगति भी मनुष्यों में उपयोग किए जाने वाले गैर-आक्रामक नैदानिक उपकरणों की प्रतिकृति की अनुमति देती है, अर्थात्, फ्लोरेसिन एंजियोग्राफी (एफए) और ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी)6। फ्लोरेसिन एंजियोग्राफी रक्त-रेटिना बैरियर (बीआरबी) के टूटने के साथ-साथ रेटिना में रक्त प्रवाह की गतिशीलता के कारण रिसाव के अवलोकन की अनुमति देती है, जिसमें रोड़ा की साइटें शामिल हैं, फ्लोरेसिन के इंजेक्शन का उपयोग करके, एक छोटा फ्लोरोसेंट डाई 8,9। ओसीटी इमेजिंग रेटिना की उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रॉस-अनुभागीय छवियों के अधिग्रहण और रेटिना परतों की मोटाई और संगठन के अध्ययन की अनुमतिदेता है। एफए छवियों का विश्लेषण ऐतिहासिक रूप से काफी हद तक गुणात्मक रहा है, जो अध्ययनों के बीच प्रत्यक्ष और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तुलना की क्षमता को सीमित करता है। हाल ही में, ओसीटी इमेजिंग में परत मोटाई की मात्रा का परिमाणीकरण करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, हालांकि वर्तमान में कोई मानकीकृत विश्लेषण प्रोटोकॉल नहीं है और ओसीटी छवि अधिग्रहण की साइट11 भिन्न होती है। इन उपकरणों का ठीक से लाभ उठाने के लिए, मानकीकृत, मात्रात्मक और प्रतिकृति डेटा विश्लेषण पद्धति की आवश्यकता होती है। इस पेपर में, हम आरवीओ-फ्लोरेसिन रिसाव, ओसीटी परत मोटाई और रेटिना परतों के विघटन के माउस मॉडल में पैथोलॉजिकल क्षति का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तीन ऐसे संवहनी रीडआउट प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) बयान का पालन करता है। कृंतक प्रयोगों को कोलंबिया विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित और निगरानी की गई थी।

नोट: इमेजिंग 2 महीने के C57BL / 6J नर चूहों पर किया गया था जिनका वजन लगभग 23 ग्राम था।

1. रेटिना इमेजिंग के लिए अभिकर्मकों की तैयारी

  1. इंजेक्टेबल फ्लोरेसिन समाधान की तैयारी।
    नोट: फ्लोरेसिन बहुत हल्का संवेदनशील है। प्रकाश से बचाएं और तैयारी के तुरंत बाद इसका उपयोग करें।
    1. बाँझ खारा में 1% की एकाग्रता के लिए फ्लोरेसिन को पतला करें।
  2. केटामाइन / Xylazine की तैयारी
    1. निम्नलिखित एकाग्रता के लिए बाँझ खारा में पतला केटामाइन और ज़ाइलज़िन: केटामाइन (80-100 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (5-10 मिलीग्राम / किग्रा)।
  3. बाँझ खारा
    1. बाँझ खारा के साथ 26 ग्राम सुई के साथ 5 एमएल सिरिंज तैयार करें।

2. ओसीटी और फ्लोरेसिन इमेजिंग

  1. रेटिना इमेजिंग माइक्रोस्कोप लाइटबॉक्स, ओसीटी मशीन और गर्म माउस प्लेटफॉर्म चालू करें।
  2. कंप्यूटर चालू करें और इमेजिंग प्रोग्राम खोलें।
  3. प्रत्येक आंख में फेनिलफ्राइन और ट्रॉपिकामाइड की एक बूंद जोड़ें।
  4. एनेस्थीसिया (केटामाइन (80-100 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (5-10 मिलीग्राम / किग्रा)) इंट्रापरिटोनियल (आईपी) के 150 μL इंजेक्ट करें। पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई निर्धारित करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि जानवर अनुत्तरदायी न हो। दोनों आंखों पर नेत्र मरहम या कृत्रिम आँसू लागू करें।
  5. प्लेटफ़ॉर्म पर माउस समायोजित करें।
  6. प्लेटफ़ॉर्म की ऊंचाई और कोण को समायोजित करें जब तक कि रेटिना फंडस का दृश्य स्पष्ट और केंद्रित न हो। फंडस की एक तस्वीर लें।
  7. इमेजिंग और OCT सॉफ्टवेयर खोलें। OCT प्रोग्राम में, 5 पर नज समायोजित करें।
  8. जलने से 75 μm दूर पर एक OCT छवि लें। रेटिना के अन्य तीन चतुर्थांशों के लिए दोहराएं।
  9. 1% फ्लोरेसिन आईपी के 100 μL इंजेक्ट करें।
  10. कैमरे को 488 एनएम फिल्टर पर स्विच करें। कैमरा लाभ को 5 तक बढ़ाएं।
  11. फ्लोरेसिन इंजेक्शन के ठीक 5 मिनट बाद फंडस की एक तस्वीर लें।
    नोट: अधिकतम सेटिंग पर कैमरे की रोशनी के लिए आंख के लंबे समय तक संपर्क से बचें, क्योंकि फ्लोरेसिन रेटिना फोटोडैमेज को बढ़ा सकता है। प्रकाश स्रोत को तब तक बंद रखें जब तक कि 5 मिनट का प्रतीक्षा समय समाप्त न हो जाए और माउस इमेजिंग के लिए तैयार न हो जाए।

3. आफ्टरकेयर

  1. बाँझ खारा आईपी के 1 एमएल इंजेक्ट करें। दोनों आंखों पर स्नेहक आई ड्रॉप लगाएं। दोनों आंखों पर नेत्र मरहम या कृत्रिम आँसू लागू करें।
  2. माउस का निरीक्षण करें क्योंकि यह संज्ञाहरण से ठीक हो जाता है। पूरी तरह से ठीक होने पर ही अन्य जानवरों के साथ पिंजरे में लौटें, आमतौर पर लगभग 40 मिनट के बाद।

4. बहिष्करण मानदंड के लिए मूल्यांकन

  1. बहिष्करण मानदंडों का आकलन करने के लिए प्रक्रिया के बाद 24 घंटे में ली गई फंडस छवि खोलें। आंख को बाहर रखें यदि निम्नलिखित मानदंडों में से किसी की पहचान की जाती है।
  2. आकलन करें कि क्या छवि में शून्य रोड़ा है
    1. अवरुद्ध जहाजों की संख्या के लिए छवि का मूल्यांकन करें।
      नोट: एक सफल रोड़ा में आमतौर पर जलने पर या उसके आसपास कुछ बैंगनी रंजकता होती है, जलने के माध्यम से बहुत पतली या असंतुलित वाहिका, जलने वाले क्षेत्र के बाहर बेहोश या गैर-मौजूद वाहिका उपस्थिति, और हाइपोक्सिया से रेटिना मलिनकिरण होता है। यदि पूरे पोत को लेजर द्वारा सफेद जलने के माध्यम से देखा जा सकता है, तो पोत अवरुद्ध होने में विफल रहा। कभी-कभी पोत आंशिक रूप से बाधित दिखाई देगा, लेकिन अगर यह जलने के बाहर निर्बाध दिखता है, तो जहाज संभवतः अवरुद्ध नहीं हुआ।
    2. अस्पष्ट मामलों के लिए, रोड़ा का मूल्यांकन करने के लिए एक ही समय बिंदु पर एफए इमेजिंग का उपयोग करें। इन छवियों में, एक रोड़ा एक पोत की निरंतरता में एक ब्रेक के रूप में दिखाई देगा, अक्सर आसपास के पोत के टेपरिंग के साथ।
    3. यदि शून्य रोड़ा की पहचान की जाती है, तो आंख को विश्लेषण से बाहर रखें, क्योंकि आरवीओ को अप्रभावी माना जाता है।
      नोट: रोड़ा आम तौर पर आरवीओ के बाद 48-72 घंटे तक हल होता है, और रोड़ा की उपस्थिति को अब इन समय बिंदुओं पर बहिष्करण मानदंड के रूप में उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।
  3. अत्यधिक रेटिना डिटेचमेंट के लिए फंडस और ओसीटी छवियों का आकलन करें
    नोट: आरवीओ के प्रेरण के बाद सबरेटिनल द्रव संचय आम है, और आरपीई से तंत्रिका रेटिना के पृथक्करण का कारण बनता है। अत्यधिक रेटिना डिटेचमेंट के लिए बहिष्करण मानदंड निम्नानुसार परिभाषित किए गए हैं: ओसीटी या तो पूरी तरह से अदृष्टि योग्य होगा, या कुछ परतें अविश्वसनीय रूप से विकृत दिखाई देंगी। बाहरी प्लेक्सीफॉर्म और आरपीई परतों के रिज़ॉल्यूशन के नुकसान के साथ छवि की गुणवत्ता खराब है। तंत्रिका रेटिना और कोरॉइड के बीच अलगाव ओसीटी क्षेत्र की अनुमति से अधिक है। फंडस छवि पर, रेटिना टोन लगभग पूरी तरह से सफेद होगा, जिसमें कुछ बैंगनी धब्बे होंगे। रेटिना का हिस्सा विकृत और फोकस से बाहर दिखाई दे सकता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि यह अलग हो गया है और रेटिना के बाकी हिस्सों की तुलना में एक अलग फोकल दूरी पर है।
    1. यदि आंख से छवियों का आकलन रेटिना के परिधीय या पूर्ण अलगाव को निर्धारित करता है, तो विश्लेषण से आंख को बाहर रखें।
  4. कॉर्नियल मोतियाबिंद के सबूत के साथ छवियों को बाहर रखें
    नोट: एक कॉर्नियल मोतियाबिंद माउस के कॉर्निया पर एक अपारदर्शी सफेद बिंदु के रूप में दिखाई देता है। मोतियाबिंद आमतौर पर आंखों के अपर्याप्त स्नेहन के कारण होता है जबकि जानवर को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और आंखों के मलहम को उदारता से लागू करने की देखभाल करके काफी हद तक बचा जा सकता है। मोतियाबिंद को आम तौर पर जानवर का निरीक्षण करके इमेजिंग से पहले पहचाना जा सकता है। जिन चूहों ने मोतियाबिंद विकसित किया है, उन्हें इमेजिंग प्रक्रिया से गुजरने की आवश्यकता के बिना डेटासेट से बाहर रखा जाना चाहिए। इमेजिंग में, मोतियाबिंद कैमरे से रेटिना को अस्पष्ट कर देगा, और ओसीटी विकृत दिखाई देगा।
  5. अत्यधिक रक्तस्राव के लिए छवि का आकलन करें
    नोट: अत्यधिक रक्तस्राव को छवि में लाल तरल पदार्थ की मात्रा के रूप में पहचाना जा सकता है, आमतौर पर रेटिना पृष्ठभूमि, पोत और जलने को रोकता है। लाल द्रव के ये क्षेत्र बैंगनी स्प्लॉच की तुलना में एक उज्ज्वल, अपारदर्शी लाल होंगे जो सफल आरवीओ में सामान्य हैं। रक्तस्राव ओसीटी इमेजिंग पर गैंग्लियन सेल परत पर दिखाई देते हैं और रक्तस्राव के नीचे अन्य रेटिना परतों की कल्पना करने की क्षमता में हस्तक्षेप करते हैं।
    1. यदि छवि को अत्यधिक रक्तस्राव के लिए निर्धारित किया जाता है, तो विश्लेषण से आंख को बाहर रखें।

5. फ्लोरेसिन छवि प्रसंस्करण

  1. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में फ्लोरेसिन छवि खोलें।
  2. छवि को डुप्लिकेट करें
  3. एक चयन उपकरण का उपयोग करके, प्रमुख जहाजों का सावधानीपूर्वक पता लगाएं।
    1. प्रमुख वाहिकाएं ऑप्टिक डिस्क से निकलने वाली मोटी नसें और धमनियां हैं। इन जहाजों से बाहर निकलने वाले किसी भी जहाज को अनदेखा करें।
    2. यदि रिसाव जहाज की रूपरेखा को रोड़ा स्थल के पास देखने से रोकता है, तो पोत के अनुमानित स्थान में रिसाव के माध्यम से पता लगाएं (मोटाई बनाए रखें, अंतिम दृश्य बिंदु को अगले दृश्यमान बिंदु से जोड़ें)।
  4. पहली छवि में, केवल पृष्ठभूमि को छोड़कर, चयन हटा दें। इस नकाबपोश छवि को सहेजें.
  5. चयन को दूसरी छवि में ले जाएं, चयन को उलट दें और जहाजों को अलग-थलग करके हटा दें। इस नकाबपोश छवि को सहेजें.
  6. ImageJ में दो छवियों को खोलें। पृष्ठभूमि छवि खोलें और एकीकृत घनत्व को मापें।
  7. पोत की छवि खोलें, जहाजों की रूपरेखा का चयन करें, और फिर औसत तीव्रता को मापें।
  8. पृष्ठभूमि के एकीकृत घनत्व को वाहिकाओं की औसत तीव्रता से विभाजित करें, जिससे आंख के लिए रिसाव अनुपात उत्पन्न होता है।
  9. एक प्रयोगात्मक समूह में प्रत्येक आंख के लिए इस रिसाव अनुपात को रिकॉर्ड करें।
  10. पृष्ठभूमि के लिए और नियंत्रण के लिए, प्रयोगात्मक आंखों को अघायल नियंत्रण आंखों के औसत रिसाव अनुपात में सामान्य करें।
    नोट: एफए छवि में फ्लोरेसिन रिसाव का एक मानकीकृत परिमाणीकरण बनाने के लिए, यह गणना प्रमुख जहाजों की चमक के साथ पृष्ठभूमि घनत्व (जहां रिसाव मौजूद होगा) के अनुपात का उपयोग करती है ताकि परिणाम बनाए जा सकें जो छवि से छवि तक चमक में भिन्नता को नियंत्रित करते हैं और मज़बूती से परिमाणित किए जा सकते हैं। जो आंखें क्षतिग्रस्त नहीं होती हैं, उनमें कोई रिसाव नहीं होता है और सैद्धांतिक रूप से शून्य का अनुपात होना चाहिए। इन क्षतिग्रस्त नियंत्रण आंखों से गणना किए गए अनुपात, इसलिए, पृष्ठभूमि शोर का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इस मान का उपयोग प्रयोगात्मक मूल्यों को और सामान्य करने के लिए किया जाता है।

6. रेटिना परत मोटाई

  1. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में OCT छवि खोलें।
  2. गैंग्लियन सेल परत, आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परत, आंतरिक परमाणु परत, बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत, फोटोरिसेप्टर परत और आरपीई परत की सीमाओं का पता लगाएं। प्रत्येक परत की औसत मोटाई को मापें।
  3. रेटिना के अन्य तीन चतुर्थांशों से ओसीटी छवियों के लिए दोहराएं। आंख के लिए प्रत्येक रेटिना परत की औसत मोटाई प्राप्त करने के लिए चार चतुर्थांशों में औसत परत मोटाई का औसत लें।
  4. प्रयोगात्मक समूह में प्रत्येक आंख के लिए दोहराएं।

7. रेटिना आंतरिक परतों का विघटन (डीआरआईएल)

  1. ImageJ में OCT छवि खोलें।
  2. लाइन टूल का उपयोग करके, उस दूरी को मापें जहां बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत की ऊपरी सीमा अस्पष्ट है।
    नोट: डीआरआईएल और इमेजिंग कलाकृतियों के कारण खराब परत दृश्यता के क्षेत्रों के बीच अंतर करना महत्वपूर्ण है। यदि पर्याप्त छवि रिज़ॉल्यूशन संभव नहीं है तो खराब ओसीटी छवि गुणवत्ता डीआरआईएल विश्लेषण के लिए एक आंख को अमान्य कर सकती है। डीआरआईएल के साथ छवियों में आमतौर पर अन्य क्षेत्र या रेटिना परतें होंगी जो स्पष्ट रूप से हल और व्यवस्थित होती हैं, जो पर्याप्त छवि गुणवत्ता का एक अच्छा संकेतक हो सकती हैं।
    1. अक्षांश से क्षैतिज रूप से मापें जहां विघटन अक्षांश से शुरू होता है जहां बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत की ऊपरी सीमा फिर से दिखाई देती है, यदि बिल्कुल भी हो। यहां तक कि अगर बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत लंबवत ऊपर या नीचे की ओर बदलती है, तो पूरी तरह से क्षैतिज रूप से मापें।
    2. बिना किसी विघटन वाले क्षेत्रों द्वारा अलग किए गए विघटन के कई क्षेत्र हो सकते हैं। इन्हें व्यक्तिगत रूप से मापें और दूरियों के योग की गणना करें।
  3. छवि के लिए विघटन का अनुपात प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ओसीटी छवि में दिखाई देने वाले रेटिना की कुल लंबाई से विघटन की लंबाई को विभाजित करें।
  4. रेटिना के अन्य तीन चतुर्थांशों से ओसीटी छवियों के लिए माप और गणना दोहराएं।
  5. चार ओसीटी छवियों से विघटन के अनुपात का औसत लें। यह संख्या पूरे रेटिना के लिए औसत विघटन का प्रतिनिधित्व करती है। प्रयोगात्मक समूह में प्रत्येक आंख के लिए दोहराएं।

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Representative Results

ये विश्लेषण विधियां एफए और ओसीटी इमेजिंग द्वारा कैप्चर किए गए रेटिना पैथोलॉजी की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देती हैं। जिन प्रयोगों से प्रतिनिधि डेटा निकाला जाता है, उनमें C57BL/6J नर चूहों का उपयोग किया गया था, जिन्होंने या तो अघायल नियंत्रण के रूप में कार्य किया या RVO प्रक्रिया से गुजरना पड़ा और या तो Pen1-XBir3 उपचार आईड्रॉप या पेन 1-खारा वाहन आईड्रॉप प्राप्त किया। आरवीओ चोट मॉडल में गुलाब बंगाल, एक फोटोएक्टिवेटर डाई12 के पूंछ-नस इंजेक्शन के बाद एक एनेस्थेटाइज्ड माउस की प्रत्येक आंख में प्रमुख नसों के लेजर विकिरण (532 एनएम) शामिल थे। फोटोकोग्यूलेशन को प्रेरित करने और वाहिकाओं को अवरुद्ध करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका केंद्र से 375 μm की औसत दूरी पर तीन लेजर पल्स वितरितकिए गए थे। आरवीओ प्रक्रिया का प्रभावी उपयोग एवरुत्स्की एट अल.12 में प्रदर्शित किया गया है, और आरवीओ विधि अनुकूलन पर अधिक विवरण कोलोन ऑर्टिज़ एट अल.13 में विस्तृत हैं। चित्रा 1 ए दोनों समूहों से एफए और ओसीटी छवियों के उदाहरण दिखाता है। फोटोकोग्यूलेशन प्रक्रिया के माध्यम से रोड़ा गठन और स्थिरीकरण की परिवर्तनशील प्रकृति के कारण, क्षति की अलग-अलग डिग्री देखी जा सकती है। कुछ रेटिना में, आरवीओ प्रक्रिया द्वारा प्रेरित क्षति नेत्र विकृति का परिचय देती है जो रेटिना छवियों को विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त बनाती है। अधिग्रहण के बाद, इष्टतम विश्लेषण और विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए बहिष्करण मानदंडों के लिए छवियों का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। चित्रा 1 बी में चित्रित इन बहिष्करण मानदंडों में रेटिना डिटेचमेंट, रक्तस्राव और मोतियाबिंद शामिल हैं। जैसा कि उदाहरण फंडस और ओसीटी छवियों में देखा जा सकता है, ये विकृति स्पष्ट ओसीटी इमेजिंग को रोकती है, जिससे रेटिना डेटा विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त हो जाते हैं। इसके अतिरिक्त, यह संभव है कि कुछ रेटिना में कोई स्थिर रोड़ा नहीं होगा; ये छवियां इस्केमिक-हाइपोक्सिक क्षति को सटीक रूप से मॉडल नहीं करती हैं और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।

रक्त-रेटिना बाधा का टूटना आरवीओ14,15 के रोगजनन में योगदान देता है। जहाजों से रिसाव की मात्रा का मूल्यांकन चोट-प्रेरित पोत पारगम्यता का एक उपयोगी संकेतक है। एफए इमेजिंग इस रिसाव के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, लेकिन कई कारक, जैसे कि परिसंचरण की दर में अंतर, एफए छवियों की कच्ची तीव्रता को प्रभावित करते हैं और लगातार परिमाणीकरण16,17 करते हैं। हमारी विधि रेटिना में देखी गई तीव्रता को प्रमुख वाहिका की औसत तीव्रता तक सामान्य करके इस परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करती है। यह प्रत्येक रेटिना छवि के लिए रिसाव का अनुपात प्रदान करता है जिसकी तुलना दूसरों से की जा सकती है और विश्लेषण किया जा सकता है। चित्रा 2 ए इस गणना के लिए उपयोग की जाने वाली नकाबपोश छवियों को प्रदर्शित करता है, जो रेटिना के अन्य क्षेत्रों से प्रमुख वाहिका को अलग करता है। फ्लोरेसिन को मापने की क्षमता चोट की गंभीरता और उपचार प्रभावकारिता की तुलना के साथ-साथ चोट के समय पाठ्यक्रम (चित्रा 2 बी) में रिसाव में परिवर्तन के अध्ययन की अनुमति देती है, जो अकेले गुणात्मक रिपोर्टिंग के साथ प्रदर्शित करने के लिए बहुत सूक्ष्म प्रभाव हो सकता है।

ओसीटी इमेजिंग व्यक्तिगत रेटिना परतों और समग्र रेटिना मोटाई पर आरवीओ के प्रभाव के विश्लेषण की अनुमति देता है। चित्रा 3 ए एक ओसीटी छवि में रेटिना की परतों का चित्रण दिखाता है। प्रत्येक परत की सीमाओं का पता लगाना (चित्रा 3 बी) विश्लेषण के कई रास्ते खोजने की अनुमति देता है। प्रत्येक रेटिना परत के लिए मोटाई का परिमाणीकरण उपयोगी साबित होता है, क्योंकि प्रारंभिक एडेमेटस प्रतिक्रिया का आंतरिक रेटिना परतों पर अधिक गहरा प्रभाव पड़ता है। निशान कुल रेटिना मोटाई के अध्ययन और आंतरिक बनाम बाहरी रेटिना परतों के अलग-अलग विश्लेषण के लिए भी अनुमति देते हैं। चित्रा 3 सी आरवीओ क्षति के समय पाठ्यक्रम का विश्लेषण प्रदान करता है, जहां रेटिना परतों की प्रारंभिक भड़काऊ सूजन और अंततः अपक्षयी पतलापन देखा जा सकता है। समय के साथ प्रत्येक परत की मोटाई को प्लॉट करने से आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म और आंतरिक परमाणु परतों के लिए अलग-अलग गतिशीलता का पता चलता है, जहां आंतरिक परमाणु परत प्रारंभिक चोट के लिए बहुत अधिक प्रतिक्रिया का अनुभव करती है, लेकिन प्रारंभिक एडिमा को स्थिर करने और बेसलाइन पर लौटने के बाद आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परत अधिक गंभीर पतलेपन को प्रदर्शित करती है (चित्रा 3 डी) ). यह विभिन्न समय बिंदुओं पर प्रतिक्रिया के ड्राइवरों की अधिक सटीक समझ प्रदान करता है। हमने सूजन को कम करने और अंतिम अध: पतन से बचाने में एक कैसपेस अवरोधक की प्रभावशीलता का भी परीक्षण किया, विश्लेषण के साथ व्यक्तिगत परतों में अलग-अलग प्रभावों का खुलासा किया।

आंतरिक रेटिना परतों (डीआरआईएल) का विघटन एक और ओसीटी विशेषता है जिसका उपयोग मधुमेह रेटिनोपैथी में इस्केमिया के नैदानिक उपाय के रूप में किया जाता है, साथ ही आरवीओ18,19 में दृश्य तीक्ष्णता का पूर्वानुमानित उपाय भी है। ओसीटी इमेजिंग में, डीआरआईएल बाहरी-प्लेक्सीफॉर्म परत12 की ऊपरी सीमा के गायब होने के रूप में प्रकट होता है, बाहरी-प्लेक्सीफॉर्म और आंतरिक परमाणु परतों को एक साथ मिश्रित करता है (चित्रा 4 ए)। चित्रा 4 बी डीआरआईएल के हाइलाइट किए गए क्षेत्रों के साथ ओसीटी छवियों के दो उदाहरण दिखाता है। हम डीआरआईएल को कुल रेटिना लंबाई के अनुपात के रूप में व्यक्त करते हैं, जो चार ओसीटी क्रॉस-सेक्शन में औसत है। यह उपाय हमें मात्रात्मक रूप से प्रयोगात्मक समूहों की तुलना करने की अनुमति देता है; चित्रा 4 सी एक उदाहरण विश्लेषण प्रस्तुत करता है, जहां आरवीओ में रेटिना क्षति को कम करने में एक अवरोधक की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए दो प्रयोगात्मक समूहों के रेटिना विघटन की तुलना की गई थी।

Figure 1
चित्र 1: फ्लोरेसिन एंजियोग्राफी (एफए) और ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) इमेजिंग से प्राप्त छवियां। (ए) रेटिना 24 घंटे पोस्ट-आरवीओ और अघायल नियंत्रण से एफए और ओसीटी छवियों के उदाहरण। (बी) विभिन्न बहिष्करण मानदंडों की फंडस और ओसीटी इमेजिंग: अत्यधिक रेटिना डिटेचमेंट, रक्तस्राव, कॉर्नियल मोतियाबिंद, और कोई अवरोधन नहीं। ओसीटी अधिग्रहण की दूरी ग्रीन गाइडलाइन द्वारा इंगित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: फ्लोरेसिन रिसाव का परिमाणीकरण। (ए) विश्लेषण के लिए वाहिकाओं और पृष्ठभूमि में एफए छवि का पृथक्करण (बी) सी 57बीएल / 6 जे रेटिना नस (आरवीओ) चूहों की आंखों से फ्लोरेसिन रिसाव का परिमाणीकरण या तो 10 मिलीग्राम पेन 1-एक्सबीईआर 3 अवरोधक आईड्रॉप्स (एन = 17) या पेन 1-खारा वाहन आईड्रॉप्स (एन = 13) 24 घंटे और 48 घंटे की प्रक्रिया के बाद प्राप्त होता है। पृष्ठभूमि छवि की तीव्रता पढ़ने को पोत की छवि से औसत तीव्रता पढ़ने के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। आरवीओ चूहों के लिए तीव्रता पढ़ने का औसत आगे सामान्यीकृत नियंत्रण ों के लिए सामान्यीकृत है। त्रुटि पट्टियाँ SEM के साथ माध्य दिखाती हैं. कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ओसीटी छवियों में रेटिना परत की मोटाई का परिमाणीकरण। (ए) लेबल की गई व्यक्तिगत रेटिना परतों के साथ अघायल रेटिना: गैंग्लियन सेल लेयर, इनर प्लेक्सीफॉर्म लेयर, इनर न्यूक्लियर लेयर, आउटर प्लेक्सीफॉर्म लेयर, फोटोरिसेप्टर लेयर, आरपीई और कोरॉइड। (बी) अघायल नियंत्रण और 24 घंटे के बाद आरवीओ सी 57/बीएल 6 चूहों से ली गई ओसीटी छवियों की परत के निशान का उदाहरण। (ग) आरवीओ के बाद 4 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे, 72 घंटे और 8 दिनों में सी57बीएल/6जे चूहों रेटिना की ओसीटी इमेजिंग में कुल रेटिना मोटाई और इंट्रारेटिनल मोटाई में परिवर्तन का परिमाणीकरण। (घ) सी57बीएल/6जे चूहों के रेटिना के आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म और आंतरिक परमाणु परतों में मोटाई परिवर्तन का परिमाणन 24 घंटे, 48 घंटे और 8 दिन बाद आरवीओ प्राप्त करने वाले सी57बीएल/6जे चूहों के लिए या तो 10 मिलीग्राम पेन1-एक्सबीईआर3 अवरोधक आईड्रॉप्स (एन = 14) या पेन1-सेलाइन वाहन आईड्रॉप्स (एन = 15) आरवीओ प्रक्रिया के तुरंत बाद और 24-एच पोस्ट-आरवीओ प्राप्त करते हैं। त्रुटि पट्टियाँ SEM के साथ माध्य दिखाती हैं. कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आरवीओ के बाद ओसीटी छवियों में देखे गए आंतरिक रेटिना परतों (डीआरआईएल) के विघटन का परिमाणीकरण। ओसीटी छवियों में, डीआरआईएल को आंतरिक परमाणु और बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परतों के बीच एक स्पष्ट चित्रण के नुकसान से इंगित किया गया है। (ए) ओसीटी इमेजिंग में डीआरआईएल के साथ और बिना रेटिना के वर्गों के उदाहरण। (बी) सी 57बीएल/6जे माउस 24 एच पोस्ट-आरवीओ में दो क्षेत्रों की ओसीटी इमेजिंग में डीआरआईएल के क्षेत्र, सफेद रेखाओं द्वारा इंगित किए गए हैं। डीआरआईएल को रेटिना के आकार का पालन करने के बजाय छवि में क्षैतिज रूप से मापा जाता है। (ग) आरवीओ प्रक्रिया के बाद 25 मिलीग्राम पेन1-एक्सबीईआर3 इनहिबिटर आईड्रॉप्स (एन = 19) या पेन1-सेलाइन व्हीकल आईड्रॉप्स (एन = 21) प्राप्त करने वाले सी57बीएल/6जे चूहों की आंखों के लिए रेटिना लंबाई के अनुपात का परिमाणीकरण जहां डीआरआईएल 24 घंटे और 48 घंटे के बाद आरवीओ देखा गया था। त्रुटि पट्टियाँ SEM के साथ माध्य दिखाती हैं. कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

नॉनविनसिव कृंतक रेटिना इमेजिंग पैथोलॉजी का अध्ययन करने और हस्तक्षेप विकसित करने के लिए एक एवेन्यू प्रस्तुत करता है। पिछले अध्ययनों ने आरवीओ के एक माउस मॉडल को विकसित और अनुकूलित किया है, परिवर्तनशीलता को सीमित किया है और मुराइन रेटिना 5,7,13 में सामान्य नैदानिक विकृति के विश्वसनीय अनुवाद की अनुमति दी है। नेत्र इमेजिंग तकनीक में विकास आगे प्रयोगात्मक जानवरों में एफए और ओसीटी जैसे विवो इमेजिंग तकनीकों में नैदानिक के उपयोग की अनुमति देता है, जिससे मानव रोग 6,12,15 के प्रोफाइल के साथ माउस मॉडल की तुलना करने की क्षमता मिलती है। हालांकि, इन छवियों से निकाली जा सकने वाली जानकारी और मॉडल की समग्र ट्रांसलेशनल क्षमता को अधिकतम करने के लिए, छवियों का विश्लेषण करने के लिए मानकीकृत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कठोर मात्रात्मक तरीकों की आवश्यकता है। यहां हम विश्लेषण विधियों को प्रस्तुत करते हैं जो क्षति की गंभीरता के मात्रात्मक प्रतिनिधित्व की अनुमति देते हैं, जिससे चूहों और प्रयोगात्मक समूहों के बीच अधिक सटीक और विश्वसनीय तुलना की अनुमति मिलती है। इन विश्लेषणों में एफए छवियों में रिसाव परिमाणीकरण, औसत परत मोटाई का परिमाणीकरण और ओसीटी छवियों में डीआरआईएल के क्षेत्र शामिल हैं।

सफल विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कारक अधिग्रहित छवियों की गुणवत्ता में निहित है। खराब तरीके से हल किए गए ओसीटी छवियों से व्यक्तिगत परतों का पता लगाने में कठिनाई हो सकती है और खराब छवि गुणवत्ता से आंतरिक रेटिना विघटन को अलग करने में असमर्थता हो सकती है। इमेजिंग करते समय, प्लेटफ़ॉर्म पर माउस की स्थिति में ध्यान रखना महत्वपूर्ण है, यह सुनिश्चित करना कि फंडस छवि फोकस में है, ऑप्टिक तंत्रिका अपेक्षाकृत केंद्रित है, और रेटिना क्रॉस-सेक्शन छवि में क्षैतिज है। जानवर को एनेस्थेटाइज्ड करते समय आंखों का लगातार स्नेहन भी महत्वपूर्ण है, खासकर जब एक ही जानवर को कई दिनों तक चित्रित किया जाता है। अपर्याप्त स्नेहन के परिणामस्वरूप कॉर्नियल मोतियाबिंद हो सकता है, जो रेटिना को अस्पष्ट कर देगा और इसे इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त बना देगा। आरवीओ इमेजिंग में विभिन्न रेटिना विकृति हो सकती है, जिससे छवियां विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त हो जाती हैं। इनमें अत्यधिक रेटिना डिटेचमेंट और अत्यधिक रक्तस्राव शामिल हैं, जो इमेजिंग की गुणवत्ता से बहुत समझौता करने के साथ-साथ क्षति की एक डिग्री का भी प्रतिनिधित्व करते हैं जो आरवीओ के मॉडल के रूप में उपयोग करने के लिए बहुत गंभीर है। चोट लगने के तुरंत बाद सभी अवरुद्ध जहाजों के लिए पूरी तरह से पुन: उत्पन्न करना भी संभव है, जो आरवीओ क्षति को सटीक रूप से मॉडल नहीं करेगा और इसे बहिष्करण मानदंड के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सफल रोड़ा स्वाभाविक रूप से चोट के बाद 48-72 घंटे तक हल हो जाएगा, और बहिष्करण मानदंड के रूप में रोड़ा की उपस्थिति 24 घंटे की प्रक्रिया के बाद या उससे पहले सबसे अच्छा उपयोग की जाती है। कोलोन ऑर्टिज़ एट अल.13 आरवीओ प्रक्रिया के लिए एक अनुकूलित मॉडल में परिवर्तनशीलता को सीमित करने और चोट को कैलिब्रेट करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का विवरण देता है। बहिष्करण मानदंड की पहचान और निर्णय भी छवि विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। चूंकि यह काफी हद तक मूल्यांकनकर्ता के विवेक पर निर्भर करता है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि मूल्यांकनकर्ता उपचार समूहों से अंधे हो जाएं और पैथोलॉजी गंभीरता के निर्णय में स्थिरता का अभ्यास करें। इन विधियों के आवेदन में कुछ सीमाएं मौजूद हैं, विशेष रूप से कई समय बिंदुओं पर एक ही माउस की इमेजिंग के अभ्यास में। आवृत्ति की एक सीमा है जिस पर एक माउस को इमेजिंग के लिए एनेस्थेटाइज किया जा सकता है, इष्टतम समय पाठ्यक्रम निर्धारित करने के लिए समय बिंदुओं के परीक्षण और समायोजन की आवश्यकता होती है। हमारे अध्ययन 4 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे और 8 दिनों में इमेजिंग समय बिंदुओं को नियोजित करते हैं, जिसे हमने प्रारंभिक चोट, तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया और दीर्घकालिक चोट 12 के कैप्चरचरणों को पाया है। इसके अतिरिक्त, कुछ माउस उपभेदों को कॉर्नियल मोतियाबिंद के विकास के लिए अधिक प्रवण किया जाता है, जिसमें विभिन्न मधुमेह माउस मॉडल शामिल होते हैं, जिससे बड़ी संख्या में बहिष्करण या अपूर्ण समय पाठ्यक्रम20,21 हो सकते हैं। ऐसी माउस लाइनों का उपयोग करने वाले अध्ययनों को कॉर्निया की संवेदनशीलता के आधार पर प्रयोगात्मक समूह आकार या इमेजिंग समय बिंदुओं को तैयार करने की आवश्यकता हो सकती है।

फ्लोरेसिन एंजियोग्राफी इमेजिंग का उपयोग बड़े पैमाने पर गुणात्मक रूप से रिसाव जैसे रेटिना विकृति, साथ ही परिवर्तित रक्त प्रवाह आरवीओ 6 के पैटर्न का निरीक्षण और ग्रेड करने के लिए किया गयाहै। हाल ही में, पशु मॉडल में एफए का मात्रात्मक विश्लेषण विकसित करने के प्रयास किए गए हैं, जैसे कि संवहनी क्षेत्र की गणना और टॉर्टुओसिटी16 और छवि तीव्रता अस्थायीता17 का रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण। फंडस पृष्ठभूमि से प्रमुख जहाजों के विभाजन का उपयोग पहले किया गया है, लेकिन भरण और क्षय गतिशीलता के पिक्सेल विश्लेषण में, विभिन्न चूहों में छवि तीव्रता में परिवर्तनशीलता की गवाहीदेता है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरेसिन पूलिंग17 की व्याख्या में पूर्वाग्रह की क्षमता का उल्लेख किया गया था। यहां चर्चा की गई मात्रात्मक विधि प्रमुख रेटिना वाहिका से फ्लोरेसिन के रिसाव को लक्षित करती है, जो बीआरबी के टूटने का संकेत है, जिसे आरवीओ चोट 11,12,14 में भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शित किया गया है। रिसाव का एक वैकल्पिक विश्लेषण रेटिना फ्लैट माउंट22 पर डाई रिसाव को निर्धारित करता है। हालांकि, आक्रामक पोस्टमार्टम विश्लेषण एक माउस के भीतर आरवीओ चोट की समयरेखा के अध्ययन के लिए कम उपयुक्त हैं, जहां रिसाव का अध्ययन कई समय बिंदुओं पर किया जाता है। रेटिना रोग के विभिन्न चरणों में फ्लोरेसिन रिसाव क्षेत्र का विश्लेषण पहले नैदानिक अध्ययनों में उपयोग किया गया है और अन्य देखे गए रोग विकृति के साथसहसंबद्ध है। यह विधि विवो में पोत रिसाव का अध्ययन करने के लिए एफए छवियों के समान लाभ उठाने की अनुमति देती है, जिससे आरवीओ चोट की समयरेखा के भीतर रिसाव गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति मिलती है। चूंकि रिसाव क्षेत्र का चयन एक क्षेत्र के मूल्यांकनकर्ता चयन पर निर्भर करता है, इसलिए यह संभावित रूप से व्यक्तिपरकता के माध्यम से अधिक मात्रा में परिवर्तनशीलता का परिचय देता है। इसके अलावा, चूंकि यहां चर्चा किए गए आरवीओ चोट मॉडल के अध्ययन पूरे रेटिना में रिसाव की जांच करते हैं, इसलिए हमने इसके बजाय गणना के लिए मास्किंग तकनीक का उपयोग करने का विकल्प चुना है। यह रिसाव विधि डीआरआईएल और ओसीटी परत अनुरेखण विश्लेषण द्वारा प्रकट किए गए आरवीओ क्षति के एक अलग पहलू को दर्शाती है, और इन उपायों के साथ सहसंबंध अधिक सटीक रोग प्रोफ़ाइल के निर्माण की अनुमति देता है।

हम ओसीटी छवियों के मूल्यांकन के लिए दो तरीके प्रस्तुत करते हैं। रेटिना परतों की तीव्र सूजन और बाद में अध: पतन आरवीओ चोट 6,12 की पहचान है। यहां विस्तृत ओसीटी परत अनुरेखण पद्धति व्यक्तिगत परतों के सटीक अध्ययन की अनुमति देती है और रेटिना के विभिन्न क्षेत्रों में गतिशीलता में अधिक सूक्ष्म प्रभाव और अंतर प्रकट करती है। यह विश्लेषण तकनीक ओसीटी इमेजिंग में रेटिना परत मोटाई की मात्रा का परिमाणीकरण करने के लिए अन्य सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल पर आधारित है। यह विधि परत मोटाई का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्षेत्र में प्रोटोकॉल में भिन्नता को संबोधित करती है, साथ ही छवि11 में लिए गए मापों की संख्या भी। चूंकि पतलापन प्रत्येक रेटिना परत के भीतर समान नहीं है, इसलिए कम बिंदु माप का उपयोग करने वाले तरीकों से चोट के प्रभावों की पूरी तस्वीर देने की संभावना नहीं है। रेटिना परत मोटाई के लिए कई माप रणनीतियों के मेटा-विश्लेषण ने बताया कि ओसीटी छवि के बड़े क्षेत्रों में औसत प्रोटोकॉल ने रोग की गंभीरता के साथ-साथ अधिक पुनरावृत्ति11 के साथ एक उच्च सहसंबंध दिखाया। पूरी छवि में औसत करके, यह विधि दीर्घकालिक आरवीओ चोट में मौजूद रेटिना पतलेपन का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व करती है। अध्ययन उस स्थान के संदर्भ में भी भिन्न होते हैं जहां ओसीटी छवियां ली जाती हैं- कई अध्ययन ऑप्टिक तंत्रिका पर इमेजिंग केंद्र करते हैं। इसके विपरीत, प्रस्तुत विधि रोड़ा के सापेक्ष केंद्रित है। मानव ओसीटी इमेजिंग के विश्लेषण में एक हालियाविकास सुविधाओं को वर्गीकृत और निर्धारित करने के लिए मशीन लर्निंग एल्गोरिदम का उपयोग है। इस तरह के विश्लेषण पशु रेटिना इमेजिंग के विश्लेषण के लिए एक आशाजनक भविष्य की दिशा हो सकती है।

इसके अतिरिक्त, हम एक कृंतक मॉडल में केशिका इस्किमिया के नैदानिक उपाय डीआरआईएल का अनुवाद प्रस्तुत करते हैं। मनुष्यों में, डीआरआईएल को दृश्य तीक्ष्णता हानि और रेटिना मोटाई अंतर का भविष्यवक्ता पाया गया है और उच्च नैदानिक संवेदनशीलता और विशिष्टता18,19 का प्रदर्शन किया है। अव्यवस्थित रेटिना के अनुपात को मापकर चूहों में डीआरआईएल की मात्रा निर्धारित करने से आरवीओ के बाद 7 दिनों में ईआरजी बी तरंग आयाम और आरवीओ12 के बाद 8 दिनों में रेटिना पतला होने के साथ सहसंबंध दिखाया गया है। डीआरआईएल माप का एक विकल्प रेटिना हाइपोक्सिया और इस्केमिक क्षति को मापने के लिए हाइपोक्सिक -4 का उपयोग है। हाइपोएक्स -4 रेटिना हाइपोक्सिया25 का पता लगाने के लिए एक फ्लोरोसेंट जांच के साथ एक हाइपोक्सिया मार्कर, पिमोनिडाज़ोल एनीमे हाइड्रोक्लोराइड को जोड़ता है। हाइपोएक्स -4 का उपयोग करने वाले अधिकांश प्रोटोकॉल आक्रामक हैं और रेटिना फ्लैट माउंट विश्लेषण की आवश्यकता होती है, जो चोट की टाइमलाइन के निर्माण के लिए कम उपयुक्त हो सकता है, हालांकि हाइपोक्सि -4 जांच का उपयोग करके एक इनविवो इमेजिंग प्रोटोकॉल को हाल ही मेंपायलट किया गया है। डीआरआईएल विश्लेषण रेटिना क्षति के त्वरित रीडआउट के रूप में भी उपयोगी है, क्योंकि प्रत्येक ओसीटी छवि में एकल माप रेटिना परत अनुरेखण जैसे विश्लेषण की तुलना में अधिक समय-कुशल हैं। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ये उपाय विनिमेय नहीं हैं और विभिन्न रेटिना विकृति को प्रकट करते हैं। इसके बजाय, उनका उपयोग संगीत कार्यक्रम में किया जाना चाहिए, जहां डीआरआईएल को प्रभाव आकार या हस्तक्षेप प्रभावकारिता के लिए प्रारंभिक रीडआउट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और परत अनुरेखण को बाद में रेटिना परतों में अधिक सूक्ष्म प्रभावों के गहन विश्लेषण के लिए नियोजित किया जा सकता है।

ये विधियां प्रकृति में ऑर्थोगोनल हैं, जो प्रत्येक प्रयोगात्मक विषय के लिए एक रोग प्रोफ़ाइल के निर्माण की अनुमति देती हैं। चूंकि इनमें से प्रत्येक विधि द्वारा रिपोर्ट की गई विकृति अलग-अलग है, इसलिए उन्हें आनुपातिक रूप से स्केल करने की गारंटी नहीं है, और पैथोलॉजी की अधिक समग्र तस्वीर प्राप्त करने से आरवीओ क्षति के अलग-अलग अभिव्यक्ति विन्यास की अधिक कठोर जांच की अनुमति मिलेगी। प्रत्येक प्रयोगात्मक जानवर की इमेजिंग से निकाली जा सकने वाली जानकारी की मात्रा को अधिकतम करने की क्षमता महत्वपूर्ण निष्कर्ष निकालने के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करेगी, प्रयोगात्मक प्रक्रिया की दक्षता को बढ़ाएगी। हाल ही में परिष्कृत आरवीओ प्रोटोकॉल पर इन विधियों को लागू करने से पशु मॉडल में नैदानिक फेनोटाइप के अनुवाद की अधिक प्रजनन क्षमता और अध्ययन की अनुमति मिलती है। आरवीओ मॉडल के अध्ययन से परे, इन विधियों के उपयोग में रेटिना रोगों के अन्य मॉडलों के अनुप्रयोग हैं जो एफए और ओसीटी इमेजिंग को नियोजित करते हैं। इस तरह के माउस मॉडल के उदाहरणों में उम्र से संबंधित मैकुलर एडिमा (एएमडी) 26, डायबिटिक मैकुलर एडिमा (डीएमई) 23, कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीएनवी)27, प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून यूवेरेटिनाइटिस (ईएयू) 28, और रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमेच्योरिटी (आरओपी) 15 शामिल हैं। इन विधियों को अन्य प्रजातियों में इन बीमारियों के मॉडल का अध्ययन करने में एफए और ओसीटी इमेजिंग का उपयोग करके अध्ययन के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है। ये परिमाणीकरण रोग तंत्र में अधिक सूक्ष्म परिवर्तनों के प्रति भी संवेदनशील हैं, जिससे उन्हें उपचार प्रभावकारिता के मूल्यांकन में उपयोगी बनाया जाता है, जैसे कि चित्रा 3 डी और चित्रा 4 सी में। उपयोगिता दवा यौगिकों के सहनशीलता अध्ययन में विषाक्तता परीक्षण में इमेजिंग के उपयोग तक भी फैली हुई है। इन विश्लेषण प्रोटोकॉल के मानकीकरण और प्रजनन क्षमता पशु मॉडल की ट्रांसलेशनल वैधता में सुधार करने और रेटिनोवास्कुलर रोग के रोगजनन और पैथोफिज़ियोलॉजी की हमारी समझ का विस्तार करने के लिए काम कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम (एनएसएफ-जीआरएफपी) अनुदान डीजीई - 1644869 (सीकेसीओ को), नेशनल आई इंस्टीट्यूट (एनईआई) 5टी 32 ईवाई013933 (एएमपी के लिए), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (आरओ 1 एनएस 081333, सीएमटी को आर03 एनएस 099920), और रक्षा सेना / वायु सेना विभाग (डीयूआरआईपी से सीएमटी) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AK-Fluor 10% Akorn NDC: 17478-253-10 light-sensitive
Carprofen Rimadyl NADA #141-199 keep at 4 °C
GenTeal Alcon 00658 06401
Image J NIH
InSight 2D Phoenix Technology Group OCT analysis software
Ketamine Hydrochloride Henry Schein NDC: 11695-0702-1
Phenylephrine Akorn NDCL174478-201-15
Phoenix Micron IV Phoenix Technology Group Retinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian Module Phoenix Technology Group Laser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module Phoenix Technology Group OCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix Module Phoenix Technology Group Fundus imaging and acquisition targeting
Photoshop Adobe
Refresh Allergan 94170
Tropicamide Akorn NDC: 174478-102-12
Xylazine Akorn NDCL 59399-110-20

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 182
<em>विवो में</em> प्रजनन क्षमता को बढ़ावा देने के लिए माउस रेटिना में संवहनी चोट रीडआउट
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Chen, C. W., Potenski, A. M.,… More

Chen, C. W., Potenski, A. M., Colón Ortiz, C. K., Avrutsky, M. I., Troy, C. M. In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility. J. Vis. Exp. (182), e63782, doi:10.3791/63782 (2022).

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