Summary
Här presenterar vi tre dataanalysprotokoll för fluoresceinangiografi (FA) och optisk koherenstomografi (OCT) i studien av retinal venocklusion (RVO).
Abstract
Framsteg inom oftalmiska avbildningsverktyg erbjuder en oöverträffad nivå av tillgång till forskare som arbetar med djurmodeller av neurovaskulär skada. För att korrekt utnyttja denna större översättningsbarhet finns det ett behov av att utforma reproducerbara metoder för att dra kvantitativa data från dessa bilder. Optisk koherenstomografi (OCT) -avbildning kan lösa retinal histologi vid mikrometerupplösning och avslöja funktionella skillnader i vaskulärt blodflöde. Här avgränsar vi icke-invasiva vaskulära avläsningar som vi använder för att karakterisera patologisk skada efter vaskulär förolämpning i en optimerad musmodell av retinal venocklusion (RVO). Dessa avläsningar inkluderar levande avbildningsanalys av retinal morfologi, desorganisering av retinala inre lager (DRIL) mått på kapillär ischemi och fluoresceinangiografimått av retinalt ödem och vaskulär densitet. Dessa tekniker motsvarar direkt de som används för att undersöka patienter med retinal sjukdom i kliniken. Genom att standardisera dessa metoder möjliggörs direkt och reproducerbar jämförelse av djurmodeller med kliniska fenotyper av oftalmisk sjukdom, vilket ökar den translationella kraften hos kärlskademodeller.
Introduction
Neurovaskulär sjukdom är ett stort sjukvårdsproblem som är ansvarigt för ischemisk stroke, en ledande orsak till dödlighet och sjuklighet och retinala kärlsjukdomar som leder till synförlust 1,2. För att modellera neurovaskulär sjukdom använder vi en musmodell av retinal venocklusion (RVO). Denna modell är icke-invasiv och använder liknande in vivo-avbildningstekniker som de som används för att undersöka personer med retinal kärlsjukdom i klinisk miljö. Användningen av denna modell ökar således den translationella potentialen för studier som använder denna modell. Som med alla musmodeller är det viktigt att maximera modellens reproducerbarhet.
Retinala kärlsjukdomar är en viktig orsak till synförlust hos personer under 70 år. RVO är den näst vanligaste retinala kärlsjukdomen efter diabetisk retinopati3. Kliniska egenskaper som är karakteristiska för RVO inkluderar ischemisk skada, retinalt ödem och synförlust som en följd av neuronal förlust 3,4. Musmodeller av RVO med laserfotokoagulering av större kärl har utvecklats och förfinats för att replikera viktiga kliniska patologier observerade i human RVO 5,6,7. Framsteg inom oftalmisk avbildning möjliggör också replikering av icke-invasiva diagnostiska verktyg som används hos människor, nämligen fluoresceinangiografi (FA) och optisk koherenstomografi (OCT)6. Fluoresceinangiografi möjliggör observation av läckage på grund av nedbrytningen av blod-retinalbarriären (BRB) samt blodflödesdynamik i näthinnan, inklusive ocklusionsställen, med injektion av fluorescein, ett litet fluorescerande färgämne 8,9. OCT-avbildning möjliggör förvärv av högupplösta tvärsnittsbilder av näthinnan och studier av tjockleken och organisationen av retinala lager10. Analys av FA-bilder har historiskt sett varit till stor del kvalitativ, vilket begränsar potentialen för direkt och reproducerbar jämförelse mellan studier. Nyligen har ett antal metoder utvecklats för kvantifiering av skikttjocklek vid OCT-avbildning, även om det för närvarande inte finns något standardiserat analysprotokoll och platsen för OCT-bildförvärv varierar11. För att kunna utnyttja dessa verktyg på rätt sätt behövs standardiserad, kvantitativ och replikerbar dataanalysmetodik. I detta dokument presenterar vi tre sådana vaskulära avläsningar som används för att utvärdera patologiska skador i en musmodell av RVO-fluoresceinläckage, OCT-skikttjocklek och desorganisering av näthinneskikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalande för användning av djur i oftalmisk och synforskning. Gnagarförsök godkändes och övervakades av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Columbia University.
OBS: Avbildning gjordes på 2 månader gamla C57BL/6J hanmöss som vägde ca 23 g.
1. Beredning av reagenser för retinal avbildning
- Framställning av injicerbar fluoresceinlösning.
OBS: Fluorescein är mycket ljuskänsligt. Skydda mot ljus och använd det strax efter beredningen.- Späd fluorescein till en koncentration av 1% i steril saltlösning.
- Beredning av ketamin/xylazin
- Späd Ketamin och Xylazin i steril saltlösning i enlighet med detta för följande koncentration: Ketamin (80-100 mg/kg) och Xylazin (5-10 mg/kg).
- Steril saltlösning
- Förbered en 5 ml spruta med en 26 G nål med steril saltlösning.
2. ULT- och fluoresceinavbildning
- Slå PÅ retinal bildmikroskopets ljuslåda, OCT-maskinen och den uppvärmda musplattformen.
- Slå på datorn och öppna bildprogrammet.
- Tillsätt en droppe fenylefrin och tropikamid till varje öga.
- Injicera 150 μl anestesi (Ketamin (80-100 mg/kg) och Xylazin (5-10 mg/kg)) intraperitonealt (IP). Bestäm djupet av anestesi med tå nypa och vänta tills djuret inte svarar. Applicera oftalmisk salva eller konstgjorda tårar på båda ögonen.
- Rymma musen på plattformen.
- Justera plattformens höjd och vinkel tills utsikten över retinal fundus är tydlig och fokuserad. Ta en bild av fundus.
- Öppna bild- och OCT-programvaran. I OCT-programmet justerar du nudge till 5.
- Ta en OCT-bild vid 75 μm distal från bränningen. Upprepa för de andra tre kvadranterna i näthinnan.
- Injicera 100 μl 1% fluorescein IP.
- Byt kameran till ett 488 nm-filter. Öka kameraförstärkningen till 5.
- Ta en bild av fundus vid exakt 5 minuter efter fluoresceininjektion.
OBS: Undvik långvarig exponering av ögat för kameraljuset vid maximal inställning, eftersom fluorescein kan förvärra retinal fotoskada. Håll ljuskällan avstängd tills väntetiden på 5 minuter har gått och musen är redo för avbildning.
3. Eftervård
- Injicera 1 ml steril saltlösning IP. Applicera smörjmedel ögondroppar på båda ögonen. Applicera oftalmisk salva eller konstgjorda tårar på båda ögonen.
- Observera musen när den återhämtar sig från anestesi. Återvänd till buren med andra djur först när de är helt återställda, vanligtvis efter cirka 40 minuter.
4. Bedömning av uteslutningskriterier
- Öppna fundusbilden som tagits vid 24 timmar efter proceduren för att bedöma för uteslutningskriterier. Uteslut ögat om något av följande kriterier identifieras.
- Bedöm om bilden har noll ocklusioner
- Utvärdera bilden för antalet ockluderade fartyg.
OBS: En framgångsrik ocklusion har vanligtvis en viss lila pigmentering på eller runt bränningen, mycket tunt eller diskontinuerligt kärl genom brännskadan, svagt eller obefintligt kärlutseende utanför brännområdet och retinal missfärgning från hypoxi. Om hela kärlet kan ses genom laserns vita brännskada, misslyckades fartyget med att ockludera. Ibland kommer fartyget att verka delvis blockerat, men om det ser oavbrutet ut utanför bränningen, har fartyget sannolikt inte försvunnit. - För tvetydiga fall, använd FA-avbildning samtidigt för att utvärdera ocklusioner. I dessa bilder kommer en ocklusion att framträda som ett brott i kontinuiteten i ett fartyg, ofta med en avsmalnande av det omgivande fartyget.
- Om noll ocklusioner identifieras, uteslut ögat från analys, eftersom RVO anses vara ineffektivt.
OBS: Ocklusioner löser sig vanligtvis med 48-72 timmar efter RVO, och förekomsten av ocklusioner bör inte längre användas som ett uteslutningskriterium vid dessa tidpunkter.
- Utvärdera bilden för antalet ockluderade fartyg.
- Bedöm fundus- och OCT-bilderna för överdriven näthinneavlossning
OBS: Subretinal vätskeansamling är vanligt efter induktion av RVO och orsakar separation av neural näthinna från RPE. Exkluderande kriterier för överdriven retinalavskiljning definieras enligt följande: OCT kommer antingen att vara helt osynligt, eller så kommer vissa lager att verka otroligt förvrängda. Bildkvaliteten är dålig, med förlust av upplösning av yttre plexiform- och RPE-lager. Separationen mellan den neurala näthinnan och choroiden är större än vad OCT-synfältet tillåter. På fundusbilden blir näthinnetonen nästan helt vit, med lite lila fläckar. En del av näthinnan kan verka förvrängd och ur fokus. Detta beror på att den har lossnat och ligger på ett annat brännvidd än resten av näthinnan.- Om bedömningen av bilderna från ett öga bestämmer perifer eller fullständig avlägsnande av näthinnan, utesluter ögat från analysen.
- Uteslut bilder med bevis på hornhinnegrå starr
OBS: En hornhinnecarakt visas som en ogenomskinlig vit prick på musens hornhinna. Grå starr uppstår vanligtvis på grund av otillräcklig smörjning av ögonen medan djuret bedövas och kan till stor del undvikas genom att vara noga med att applicera ögonsalva generöst. Grå starr kan i allmänhet identifieras före avbildning genom att inspektera djuret. Möss som har utvecklat grå starr bör uteslutas från datasetet utan att behöva genomgå avbildningsprocessen. Vid avbildning kommer grå starr att dölja näthinnan från kameran, och OCT kommer att se skev ut. - Bedöm bilden för överdriven blödning
OBS: Överdriven blödning kan identifieras som mängder röd vätska i bilden, vilket vanligtvis döljer retinal bakgrund, kärl och brännskada. Dessa områden med röd vätska kommer att vara ljusare, opaquerröda än de lila fläckarna som är normala i framgångsrik RVO. Blödningar dyker upp vid ganglioncellskiktet vid OCT-avbildning och stör förmågan att visualisera andra näthinneskikt under blödningen.- Om bilden är fast besluten att ha en överdriven blödning, uteslut ögat från analysen.
5. Fluorescein bildbehandling
- Öppna fluoresceinbilden i bildbehandlingsprogrammet.
- Duplicera bilden
- Använd ett urvalsverktyg för att noggrant spåra de viktigaste fartygen.
- De viktigaste kärlen är de tjockare venerna och artärerna som strålar ut från den optiska skivan. Ignorera alla fartyg som förgrenar sig från dessa fartyg.
- Om läckage förhindrar att fartygets kontur ses nära ocklusionsplatsen, spåra genom läckaget på fartygets ungefärliga plats (behåll tjockleken, anslut den sista synliga punkten till nästa synliga punkt).
- I den första bilden tar du bort markeringen och lämnar bara bakgrunden. Spara den här maskerade bilden.
- Flytta markeringen till den andra bilden, invertera markeringen och ta bort, isolera kärlen. Spara den här maskerade bilden.
- Öppna de två bilderna i ImageJ. Öppna bakgrundsbilden och mät den integrerade densiteten.
- Öppna fartygets bild, välj fartygens kontur och mät sedan medelintensiteten.
- Dela bakgrundens integrerade densitet med kärlens medelintensitet, vilket genererar läckageförhållandet för ögat.
- Registrera detta läckageförhållande för varje öga i en experimentell kohort.
- För att ytterligare kontrollera bakgrunden, normalisera experimentella ögon till det genomsnittliga läckageförhållandet för oskadade kontrollögon.
OBS: För att skapa en standardiserad kvantifiering av fluoresceinläckage i FA-bilden använder denna beräkning ett förhållande mellan bakgrundsdensiteten (där läckaget kommer att finnas) med ljusstyrkan hos de stora kärlen för att skapa resultat som styr för variationen i ljusstyrka från bild till bild och kan kvantifieras på ett tillförlitligt sätt. Ögon som är oskadade har inget läckage och bör teoretiskt ha förhållanden på noll. Förhållandena beräknade från dessa oskadade kontrollögon representerar därför bakgrundsbrus, och detta värde används för att ytterligare normalisera experimentella värden.
6. Retinal skikttjocklek
- Öppna OCT-bilden i bildbehandlingsprogrammet.
- Spåra gränserna för ganglioncellskiktet, det inre plexiformskiktet, det inre kärnskiktet, det yttre plexiformskiktet, fotoreceptorskiktet och RPE-lagret. Mät medeltjockleken för varje lager.
- Upprepa för OCT-bilder från de andra tre kvadranterna i näthinnan. Medelvärdet av de genomsnittliga skikttjocklekarna över de fyra kvadranterna för att få medeltjockleken för varje näthinneskikt för ögat.
- Upprepa för varje öga i den experimentella kohorten.
7. Desorganisering av retinala inre lager (DRIL)
- Öppna OCT-bilden i ImageJ.
- Använd linjeverktyget för att mäta avståndet där den övre gränsen för det yttre plexiformskiktet är otydligt.
Det är viktigt att skilja mellan DRIL och områden med dålig lagersynlighet som orsakas av avbildningsartefakter. Dålig OCT-bildkvalitet kan ogiltigförklara ett öga för DRIL-analys om tillräcklig bildupplösning inte är möjlig. Bilder med DRIL har vanligtvis andra regioner eller näthinnelager som är tydligt lösta och organiserade, vilket kan vara en bra indikator på tillräcklig bildkvalitet.- Mät horisontellt från latitud där desorganiseringen börjar till latitud där den övre gränsen för det yttre plexiformskiktet blir synligt igen, om alls. Även om det yttre plexiformskiktet skiftar uppåt eller nedåt vertikalt, mät perfekt horisontellt.
- Det kan finnas flera områden av desorganisation åtskilda av områden utan desorganisation. Mät dessa individuellt och beräkna summan av avstånden.
- Dela längden på desorganisering med den totala längden på näthinnan som är synlig i varje OCT-bild för att få förhållandet mellan desorganisation för bilden.
- Upprepa mätningen och beräkningen för OCT-bilder från de andra tre kvadranterna i näthinnan.
- Ta medelvärdet av förhållandena för desorganisation från de fyra OCT-bilderna. Detta nummer representerar den genomsnittliga desorganisationen för hela näthinnan. Upprepa för varje öga i den experimentella kohorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa analysmetoder möjliggör kvantifiering av retinal patologi fångad av FA- och OCT-avbildning. Experimenten från vilka de representativa uppgifterna extraheras använde C57BL / 6J hanmöss som antingen fungerade som oskadade kontroller eller genomgick RVO-proceduren och fick antingen Pen1-XBir3-behandlingsögondroppar eller Pen1-saltlösning vegetabiliska ögondroppar. RVO-skademodellen involverade laserbestrålning (532 nm) av de stora venerna i varje öga på en bedövad mus efter en svansveninjektion av rosenbengal, ett fotoaktivatorfärgämne12. Tre laserpulser levererades på ett genomsnittligt avstånd av 375 μm från synnervcentret för att inducera fotokoagulering och ockludera kärlen12. Effektiv användning av RVO-proceduren demonstreras i Avrutsky et al.12, och ytterligare detaljer om RVO-metodoptimering beskrivs i Colón Ortiz et al.13. Figur 1A visar exempel på FA- och ULT-bilder från båda grupperna. På grund av den varierande naturen av ocklusionsbildning och stabilisering genom fotokoagulationsprocessen kan olika grader av skada observeras. I vissa näthinnor introducerar skadan som induceras av RVO-proceduren oftalmiska patologier som gör retinalbilderna olämpliga för analys. Efter förvärvet bör bilder först utvärderas för uteslutningskriterier för att säkerställa optimal analys och tillförlitliga resultat. Dessa exklusionskriterier, som beskrivs i figur 1B, inkluderar näthinneavlossning, blödning och grå starr. Som kan observeras i exemplet fundus och OCT-bilder förhindrar dessa patologier tydlig OCT-avbildning, vilket gör näthinnorna olämpliga för dataanalys. Dessutom är det möjligt att vissa näthinnor inte innehåller några stabila ocklusioner; Dessa bilder modellerar inte exakt ischemisk-hypoxisk skada och bör uteslutas från analysen.
Nedbrytningen av blod-retinalbarriären bidrar till patogenesen av RVO14,15. Att utvärdera mängden läckage från fartyg är en användbar indikator på skadeinducerad kärlpermeabilitet. FA-avbildning möjliggör visualisering av detta läckage, men ett antal faktorer, såsom skillnader i cirkulationshastigheten, påverkar FA-bildernas råintensitet och gör konsekvent kvantifiering16,17. Vår metod styr för denna variation genom att normalisera intensiteten som observerats i näthinnan till medelintensiteten hos den stora kärlen. Detta ger ett förhållande mellan läckage för varje näthinnebild som kan jämföras med andra och analyseras. Figur 2A visar de maskerade bilderna som används för denna beräkning och skiljer den stora kärlen från de andra områdena i näthinnan. Förmågan att kvantifiera fluorescein gör det möjligt att jämföra skadans svårighetsgrad och behandlingseffekt, liksom studier av förändringar i läckage under skadetidsförloppet (figur 2B), vilket kan vara en alltför subtil effekt för att demonstrera med enbart kvalitativ rapportering.
OCT-avbildning möjliggör analys av effekten av RVO på enskilda retinala lager och övergripande retinal tjocklek. Figur 3A visar en avgränsning av näthinnans lager i en OCT-bild. Att spåra gränserna för varje lager (figur 3B) möjliggör flera analysvägar. Kvantifieringen av tjockleken för varje retinalskikt visar sig vara användbar, eftersom det initiala edematösa svaret har en mer djupgående effekt på de inre retinala skikten. Spår möjliggör också studier av total näthinnetjocklek och segregerad analys av de inre kontra yttre näthinneskikten. Figur 3C ger en analys av en tidsförlopp av RVO-skador, där den initiala inflammatoriska svullnaden i näthinneskikten och den eventuella degenerativa gallringen kan observeras. Att plotta tjockleken på varje lager över tid avslöjar olika dynamik för de inre plexiforma och inre kärnskikten, där det inre kärnskiktet upplever ett mycket större svar på den initiala skadan, men det inre plexiformskiktet visar allvarligare gallring efter att det initiala ödemet har stabiliserats och återgår till baslinjen (Figur 3D ). Detta ger en mer exakt förståelse av drivkrafterna för svar vid olika tidpunkter. Vi testade också effektiviteten hos en kaspashämmare för att mildra svullnad och skydda mot eventuell degeneration, med analys som avslöjar olika effekter i enskilda lager.
Desorganiseringen av inre näthinneskikt (DRIL) är en annan OCT-funktion som används som ett diagnostiskt mått på ischemi vid diabetisk retinopati, liksom ett prediktivt mått på synskärpa i RVO18,19. Vid OCT-avbildning manifesteras DRIL som ett försvinnande av den övre gränsen för det yttre plexiforma skiktet12, som blandar de yttre plexiforma och inre kärnskikten tillsammans (figur 4A). Figur 4B visar två exempel på OCT-bilder med markerade områden i DRIL. Vi uttrycker DRIL som en andel av den totala näthinnelängden, i genomsnitt över fyra OCT-tvärsnitt. Detta mått gör det möjligt för oss att kvantitativt jämföra experimentella grupper; Figur 4C presenterar en exempelanalys, där retinal desorganisering av två experimentella grupper jämfördes för att undersöka effekten av en hämmare för att mildra retinala skador i RVO.
Figur 1: Bilder erhållna från fluoresceinangiografi (FA) och optisk koherenstomografi (OCT) avbildning. (A) Exempel på FA- och ULT-bilder från näthinnor 24 timmar efter RVO och oskadade kontroller. (B) Fundus- och ULT-avbildning av de olika uteslutningskriterierna: överdriven näthinneavlossning, blödning, hornhinnegrå starr och inga ocklusioner. Avståndet för ULT-förvärv indikeras av den gröna riktlinjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantifiering av fluoresceinläckage. (A) Separering av FA-bilden i kärlen och bakgrunden för analys (B) Kvantifiering av fluoresceinläckage från ögonen på C57BL/6J retinala venockluderade (RVO) möss som får antingen 10 mg Pen1-XBir3-hämmare ögondroppar (N = 17) eller Pen1-saltlösning vehikeldroppar (N = 13) vid 24 timmar och 48 timmar efter proceduren. Intensitetsavläsningen av bakgrundsbilden normaliseras till medelintensitetsavläsningen från fartygets bild. Medelvärdet av intensitetsavläsningen för RVO-möss normaliseras ytterligare till oskadade kontroller. Felstaplar visar medelvärde med SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering av näthinnans skikttjocklek i OCT-bilder. (A) Oskadad näthinna med de enskilda näthinneskikten märkta: Ganglion Cell Layer, Inner Plexiform Layer, Inner Nuclear Layer, Outer Plexiform Layer, Photoreceptor Layer, RPE och Choroid. B) Exempel på skiktspår av ULT-bilder tagna från oskadad kontroll och 24 timmar efter RVO C57/BL6-möss. (C) Kvantifiering av förändring i total näthinnetjocklek och intraretinal tjocklek observerad vid OCT-avbildning av C57BL/6J-möss näthinnor vid 4 timmar, 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar och 8 dagar efter RVO. (D) Kvantifiering av tjockleksförändring i inre plexiforma och inre kärnskikt av C57BL/6J-möss näthinnor vid 24 timmar, 48 timmar och 8 dagar efter RVO för C57BL/6J-möss som får antingen 10 mg Pen1-XBir3-hämmare ögondroppar (N = 14) eller Pen1-saltlösning vegetabiliska ögondroppar (N = 15) omedelbart efter RVO-proceduren och 24-timmars post-RVO. Felstaplar visar medelvärde med SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvantifiering av desorganiseringen av de inre näthinneskikten (DRIL) som observerats i OCT-bilder efter RVO. I OCT-bilder indikeras DRIL genom förlusten av en tydlig avgränsning mellan de inre kärn- och yttre plexiformskikten. (A) Exempel på delar av näthinnan med och utan DRIL vid OCT-avbildning. B) DRIL-områden i ULT-avbildning av två regioner i en C57BL/6J-mus 24 timmar efter RVO, indikerad med vita linjer. DRIL mäts horisontellt över bilden istället för att följa näthinnans form. (C) Kvantifiering av andelen av näthinnans längd där DRIL observerades vid 24 timmar och 48 timmar efter RVO för ögonen på C57BL/6J-möss som fick antingen 2,5 mg ögondroppar med Pen1-XBir3-hämmare (N = 19) eller ögondroppar från Pen1-saltlösning (N = 21) efter RVO-proceduren. Felstaplar visar medelvärde med SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Noninvasive gnagare retinal imaging presenterar en väg att studera patologi och utveckla interventioner. Tidigare studier har utvecklat och optimerat en musmodell av RVO, vilket begränsar variabiliteten och möjliggör tillförlitlig översättning av vanliga kliniska patologier i den murina näthinnan 5,7,13. Utvecklingen inom oftalmisk avbildningsteknik möjliggör ytterligare användning av kliniska in vivo-avbildningstekniker som FA och OCT i försöksdjur, vilket ger möjlighet att jämföra musmodeller med profiler av mänsklig sjukdom 6,12,15. För att maximera informationen som kan extraheras från dessa bilder och modellens övergripande translationella potential finns det dock ett behov av standardiserade, reproducerbara och rigorösa kvantitativa metoder för att analysera bilder. Här presenterar vi analysmetoder som möjliggör kvantitativa representationer av skadornas svårighetsgrad, vilket möjliggör mer exakta och tillförlitliga jämförelser mellan möss och mellan experimentella grupper. Dessa analyser inkluderar läckagekvantifiering i FA-bilder, kvantifiering av genomsnittlig skikttjocklek och områden av DRIL i OCT-bilder.
En kritisk faktor för framgångsrik analys ligger i kvaliteten på de förvärvade bilderna. Dåligt upplösta OCT-bilder kan leda till svårigheter att spåra enskilda lager och en oförmåga att skilja inre retinal desorganisation från dålig bildkvalitet. Vid avbildning är det viktigt att ta hand om musens positionering på plattformen och se till att fundusbilden är i fokus, synnerven är relativt centrerad och näthinnans tvärsnitt är horisontellt över bilden. Konsekvent smörjning av ögonen medan djuret bedövas är också viktigt, särskilt när samma djur avbildas flera dagar. Otillräcklig smörjning kan leda till hornhinnans grå starr, vilket kommer att dölja näthinnan och göra den olämplig för avbildning. Olika retinala patologier kan förekomma vid RVO-avbildning, vilket gör bilder olämpliga för analys. Dessa inkluderar överdriven retinalavskiljning och överdriven blödning, som tillsammans med att kraftigt äventyra bildkvaliteten också representerar en grad av skada som är för svår att använda som modell av RVO. Det är dessutom möjligt för alla ockluderade fartyg att helt reperfusera kort efter skada, vilket inte korrekt modellerar RVO-skador och bör användas som ett uteslutningskriterium. Det är dock viktigt att notera att framgångsrika ocklusioner naturligtvis kommer att lösa sig med 48-72 h efter skada, och förekomsten av ocklusioner som ett uteslutningskriterium används bäst vid eller före 24 timmar efter proceduren. Colón Ortiz et al.13 beskriver bästa praxis för att begränsa variabilitet och kalibrera skador i en optimerad modell för RVO-procedur. Identifiering och bedömning av uteslutningskriterier är också ett kritiskt steg till bildanalys. Eftersom detta till stor del är upp till utvärderarens bedömning är det viktigt att utvärderarna är blinda för behandlingsgrupper och övar konsekvens i bedömningen av patologins svårighetsgrad. Vissa begränsningar i tillämpningen av dessa metoder finns, särskilt i praktiken att avbilda samma mus vid flera tidpunkter. Det finns en gräns för hur ofta en mus kan bedövas för avbildning, vilket kräver testning och justering av tidpunkter för att bestämma optimal tidsförlopp. Våra studier använder bildtidspunkter vid 4 h, 24 h, 48 h och 8 dagar, som vi har hittat fånga stadier av initial skada, akut inflammatoriskt svar och långvarig skada12. Dessutom är vissa musstammar mer benägna att utveckla hornhinnegrå starr, som inkluderar olika diabetesmusmodeller, vilket kan leda till ett stort antal undantag eller ofullständiga tidskurser20,21. Studier som använder sådana muslinjer kan behöva skräddarsy experimentell gruppstorlek eller bildtidspunkter beroende på hornhinnans känslighet.
Fluorescein angiografi avbildning har till stor del använts kvalitativt för att observera och gradera retinala patologier såsom läckage, liksom mönster av förändrat blodflöde RVO6. På senare tid har man arbetat med att utveckla en kvantitativ analys av FA i djurmodeller, såsom beräkning av kärlarea och tortuositet16 och linjär regressionsanalys av bildintensitetstemporalitet17. Segmentering av de stora kärlen från fundusbakgrunden har tidigare använts, men i en pixelanalys av fyllnings- och sönderfallsdynamik, vilket vittnar om variationen i bildintensitet hos olika möss17. Dessutom noterades risken för bias i tolkningen av fluoresceinpoolning17. Den kvantitativa metod som diskuteras här är inriktad på läckage av fluorescein från den stora retinala vaskulaturen, vilket indikerar nedbrytningen av BRB, som har visat sig spela en roll i RVO-skada11,12,14. En alternativ analys av läckage kvantifierar färgläckage på retinala platta fästen22. Invasiva obduktionsanalyser är dock mindre lämpliga för studier av tidslinjen för RVO-skada i en enda mus, där läckaget studeras vid flera tidpunkter. Analyser av fluoresceinläckageområdet vid olika stadier av näthinnesjukdomen har tidigare använts i kliniska studier och korrelerats med andra observerade sjukdomspatologier23. Denna metod möjliggör liknande utnyttjande av FA-bilder för att studera fartygsläckage in vivo, vilket möjliggör studier av läckagedynamik inom tidslinjen för RVO-skada. Eftersom valet av läckageområde är beroende av utvärderarens val av en region, introducerar det potentiellt en större mängd variation via subjektivitet. Eftersom studierna av RVO-skademodellen som diskuteras här undersöker läckage i hela näthinnan har vi istället valt att använda en maskeringsteknik för beräkning. Denna läckagemetod återspeglar en annan aspekt av RVO-skador än de som avslöjas av DRIL- och ULT-lagerspårningsanalys, och korrelation med dessa åtgärder möjliggör skapandet av en mer exakt sjukdomsprofil.
Vi presenterar två metoder för utvärdering av ULT-bilder. Akut inflammation och efterföljande degenerering av näthinneskikten är ett kännetecken för RVO-skada 6,12. OCT-lagerspårningsmetoden som beskrivs här möjliggör en exakt studie av enskilda lager och avslöjar mer subtila effekter och skillnader i dynamik i olika regioner i näthinnan. Denna analysteknik bygger på andra vanliga protokoll för kvantifiering av retinal skikttjocklek vid OCT-avbildning. Denna metod behandlar variationen mellan protokoll i det område som används för att uppskatta skikttjockleken, liksom antalet mätningar som gjorts över bilden11. Eftersom gallringen inte är enhetlig inom varje näthinneskikt är det osannolikt att metoder med färre punktmätningar ger en fullständig bild av skadeeffekter. Metaanalys av flera mätstrategier för retinal skikttjocklek rapporterade att protokoll i genomsnitt över större områden av OCT-bilden visade en högre korrelation med sjukdomens svårighetsgrad, liksom större repeterbarhet11. Genom att medelvärde över hela bilden fångar denna metod en mer exakt representation av näthinneförtunningen som finns vid långvarig RVO-skada. Studier skiljer sig också åt när det gäller platsen där OCT-bilder tas-många studier centrerar avbildning på optisk nerv. Däremot centrerar den presenterade metoden i förhållande till ocklusionerna. En ny utveckling inom analysen av mänsklig OCT-avbildning är användningen av maskininlärningsalgoritmer för att klassificera och kvantifiera funktioner24. Sådana analyser kan vara en lovande framtida riktning för analys av djurretinal avbildning.
Dessutom presenterar vi en översättning av DRIL, ett kliniskt mått på kapillär ischemi, till en gnagarmodell. Hos människor har DRIL visat sig vara en prediktor för synskärpaförlust och skillnader i näthinnans tjocklek och har visat hög diagnostisk känslighet och specificitet18,19. Att kvantifiera DRIL hos möss genom att mäta andelen av näthinnan som är oorganiserad har visat korrelation med fraktionen av ockluderade vener, ERG b-vågamplitud vid 7 dagar efter RVO och retinal gallring vid 8 dagar efter RVO12. Ett alternativ till DRIL-mätning är användningen av HYPOX-4 för att mäta retinal hypoxi och ischemisk skada. HYPOX-4 förenar pimonidazol animehydroklorid, en hypoximarkör, med en fluorescerande sond för att detektera retinal hypoxi25. De flesta protokoll som använder HYPOX-4 är invasiva och kräver retinal plattmonterad analys, vilket kan vara mindre lämpligt för att bygga skadetidslinjer, även om ett in vivo-avbildningsprotokoll med en HYPOX-4-sond nyligen har testats25. DRIL-analys är också användbar som en snabb avläsning av näthinneskador, eftersom enstaka mätningar i varje OCT-bild är mer tidseffektiva än analyser som retinal lagerspårning. Det bör dock noteras att dessa åtgärder inte är utbytbara och avslöjar olika retinala patologier. Snarare bör de användas i samförstånd, där DRIL kan användas som en initial avläsning för effektstorlek eller interventionseffekt, och skiktspårning kan därefter användas för en grundlig analys av mer subtila effekter i näthinneskikten.
Dessa metoder är ortogonala till sin natur, vilket möjliggör skapandet av en sjukdomsprofil för varje experimentellt ämne. Eftersom de patologier som rapporteras av var och en av dessa metoder är distinkta, är de inte garanterade att skala proportionellt, och att få en mer holistisk bild av patologi kommer att möjliggöra en mer noggrann undersökning av de olika manifestationskonfigurationerna av RVO-skador. Möjligheten att maximera mängden information som kan extraheras från avbildningen av varje försöksdjur kommer att minska antalet djur som är nödvändiga för att dra betydande slutsatser, vilket förbättrar effektiviteten i experimentprocessen. Tillämpning av dessa metoder på nyligen förfinade RVO-protokoll möjliggör större reproducerbarhet och studier av översättningen av kliniska fenotyper till djurmodeller. Utöver studien av RVO-modeller har användningen av dessa metoder tillämpningar på andra modeller av näthinnesjukdomar som använder FA- och ULT-avbildning. Exempel på sådana musmodeller inkluderar de för åldersrelaterat makulaödem (AMD)26, diabetiskt makulaödem (DME)23, koroidal neovaskularisering (CNV)27, experimentell autoimmun uveoretinit (EAU)28 och retinopati av prematuritet (ROP)15. Dessa metoder kan vidare generaliseras till studier med FA- och OCT-avbildning för att studera modeller av dessa sjukdomar hos andra arter. Dessa kvantifieringar är också känsliga för mer subtila förändringar i sjukdomsmekanismen, vilket gör dem användbara vid utvärdering av behandlingseffekt, såsom i figur 3D och figur 4C. Nyttan sträcker sig också till användningen av avbildning vid toxicitetstestning i tolerabilitetsstudier av läkemedelsföreningar. Standardiseringen och reproducerbarheten av dessa analysprotokoll kan tjäna till att förbättra den translationella giltigheten hos djurmodeller och utöka vår förståelse för patogenesen och patofysiologin hos retinovaskulär sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) bidrag DGE - 1644869(till CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (till AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 till CMT) och Department of Defense Army / Air Force (DURIP till CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Tong, X., et al. The burden of cerebrovascular disease in the united states. Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).
- Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles. Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).
- Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature. Retina. 33 (5), 901-910 (2013).
- Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment. Retina. 36 (3), 432-448 (2016).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Cavallerano, A.
- Laatikainen, L. The fluorescein angiography revolution: a breakthrough with sustained impact. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 82 (4), 381-392 (2004).
- Huang, D., et al.
- Oberwahrenbrock, T., et al. Reliability of intra-retinal layer thickness estimates. PLoS One. 10 (9), 0137316 (2015).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J., Smart, J., Troy, C. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (174), e62980 (2021).
- Schmidt-Erfurth, U., et al. Guidelines for the management of retinal vein occlusion by the European society of retina specialists (EURETINA). Ophthalmologica. 242 (3), 123-162 (2019).
- Yoshimura, T., et al. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4 (12), 8158 (2009).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Hui, F., et al. Quantitative spatial and temporal analysis of fluorescein angiography dynamics in the eye. PLoS One. 9 (11), 111330 (2014).
- Berry, D., Thomas, A. S., Fekrat, S., Grewal, D. S. Association of disorganization of retinal inner layers with ischemic index and visual acuity in central retinal vein occlusion. Ophthalmology. Retina. 2 (11), 1125-1132 (2018).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Obrosova, I., Chung, S., Kador, P. Diabetic cataracts: mechanisms and management. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 26 (3), 172-180 (2010).
- Hegde, K., Henein, M., Varma, S. Establishment of the mouse as a model animal for the study of diabetic cataracts. Ophthalmic Research. 35 (1), 12-18 (2003).
- Takahashi, H., et al. Time course of collateral vessel formation after retinal vein occlusion visualized by OCTA and elucidation of factors in their formation. Heliyon. 7 (1), 05902 (2021).
- Haj Najeeb, B., et al. Fluorescein angiography in diabetic macular edema: A new approach to its etiology. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (10), 3986-3990 (2017).
- Alam, M., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography features for objective classification and staging of diabetic retinopathy. Retina. 40 (2), 322-332 (2020).
- Uddin, M., Jayagopal, A., McCollum, G., Yang, R., Penn, J. In vivo imaging of retinal hypoxia using HYPOX-4-dependent fluorescence in a mouse model of laser-induced retinal vein occlusion (RVO). Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3818-3824 (2017).
- Qiang, W., Wei, R., Chen, Y., Chen, D. Clinical pathological features and current animal models of type 3 macular neovascularization. Frontiers in Neuroscience. 15, 734860 (2021).
- Park, J., et al. Imaging laser-induced choroidal neovascularization in the rodent retina using optical coherence tomography angiography. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 331 (2016).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C., Caspi, R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8 (5), 63904 (2013).
