Summary
여기에서는 망막 정맥 폐색(RVO) 연구에서 형광 혈관 조영술(FA) 및 광학 간섭 단층 촬영(OCT) 이미지에 대한 세 가지 데이터 분석 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
안과 영상 도구의 발전은 신경 혈관 손상의 동물 모델을 연구하는 연구자에게 전례없는 수준의 접근을 제공합니다. 이러한 더 큰 번역 가능성을 적절하게 활용하려면 이러한 이미지에서 정량적 데이터를 그리는 재현 가능한 방법을 고안할 필요가 있습니다. 광학 간섭 단층 촬영(OCT) 영상은 마이크로미터 분해능에서 망막 조직학을 해결하고 혈관 혈류의 기능적 차이를 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 망막 정맥 폐색(RVO)의 최적화된 마우스 모델에서 혈관 모욕 후 병리학적 손상을 특성화하는 데 사용하는 비침습적 혈관 판독을 설명합니다. 이러한 판독값에는 망막 형태의 라이브 이미징 분석, 모세관 허혈의 망막 내층 해체(DRIL) 측정, 망막 부종 및 혈관 밀도의 플루오레세인 혈관 조영술 측정이 포함됩니다. 이 기술은 클리닉에서 망막 질환 환자를 검사하는 데 사용되는 기술과 직접 일치합니다. 이러한 방법을 표준화하면 동물 모델을 안과 질환의 임상 표현형과 직접적이고 재현 가능한 비교가 가능하여 혈관 손상 모델의 번역 능력이 향상됩니다.
Introduction
신경혈관 질환은 사망률 및 이환율의 주요 원인인 허혈성 뇌졸중과시력 상실로 이어지는 망막 혈관 질환의 주요 의료 문제입니다1,2. 신경 혈관 질환을 모델링하기 위해 망막 정맥 폐색 (RVO)의 마우스 모델을 사용합니다. 이 모델은 비침습적이며 임상 환경에서 망막 혈관 질환이 있는 사람들을 검사하는 데 사용되는 것과 유사한 생체 내 이미징 기술을 활용합니다. 따라서이 모델을 사용하면이 모델을 활용하는 연구의 번역 잠재력이 증가합니다. 모든 마우스 모델과 마찬가지로 모델의 재현성을 극대화하는 것이 중요합니다.
망막 혈관 질환은 70 세 미만의 사람들의 시력 상실의 주요 원인입니다. RVO는 당뇨병성 망막병증3 다음으로 두 번째로 흔한 망막혈관 질환입니다. RVO의 특징적인 임상 특징에는 허혈성 손상, 망막 부종 및 신경 손실의 결과로 인한 시력 상실이 포함됩니다 3,4. 주요 혈관의 레이저 광응고를 사용하는 RVO의 마우스 모델은 인간 RVO 5,6,7에서 관찰된 주요 임상 병리를 복제하기 위해 개발 및 개선되었습니다. 안과 영상의 발전은 또한 인간에게 사용되는 비침습적 진단 도구, 즉 형광 혈관 조영술(FA) 및 광학 간섭 단층 촬영(OCT)의 복제를 허용합니다6. Fluorescein 혈관 조영술은 작은 형광 염료인 fluorescein의 주입을 사용하여 폐색 부위를 포함하여 망막의 혈류 역학뿐만 아니라 혈액 망막 장벽 (BRB)의 파괴로 인한 누출을 관찰 할 수 있습니다 8,9. OCT 이미징은 망막의 고해상도 단면 이미지의 획득 및 망막 층(10)의 두께 및 조직에 대한 연구를 가능하게합니다. FA 이미지의 분석은 역사적으로 대체로 질적이어서 연구 간의 직접적이고 재현 가능한 비교 가능성을 제한합니다. 최근에, OCT 이미징에서 층 두께의 정량화를 위한 많은 방법들이 개발되고 있지만, 현재 표준화된 분석 프로토콜은 없고, OCT 이미지 획득장소는 다양하다11. 이러한 도구를 적절하게 활용하려면 표준화되고 정량적이며 복제 가능한 데이터 분석 방법론이 필요합니다. 이 논문에서는 RVO- 플루오 레세인 누출, OCT 층 두께 및 망막 층의 해체에 대한 마우스 모델에서 병리학 적 손상을 평가하는 데 사용되는 세 가지 혈관 판독 값을 제시합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서를 따릅니다. 설치류 실험은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 모니터링되었습니다.
참고: 이미징은 무게가 약 23g인 2개월 된 C57BL/6J 수컷 마우스에서 수행되었습니다.
1. 망막 영상용 시약의 제조
- 주 사용 플루오레세인 용액의 제조.
참고: 플루오레세인은 빛에 매우 민감합니다. 빛으로부터 보호하고 준비 직후에 사용하십시오.- 플루오레세인을 멸균 식염수에서 1% 농도로 희석한다.
- 케타민/자일라진의 제조
- 케타민 (80-100 mg / kg) 및 자일 라진 (5-10 mg / kg)의 농도에 따라 멸균 식염수에 케타민과 자일 라진을 희석하십시오.
- 멸균 식염수
- 멸균 식염수로 26G 바늘로 5mL 주사기를 준비하십시오.
2. OCT 및 플루오레세인 이미징
- 망막 영상 현미경 라이트박스, OCT 기계 및 가열된 마우스 플랫폼을 켭니다.
- 컴퓨터를 켜고 이미징 프로그램을 엽니다.
- 각 눈에 페닐에 프린과 트로피 아미드 한 방울을 첨가하십시오.
- 150 μL의 마취제 (케타민 (80-100 mg / kg) 및 자일 라진 (5-10 mg / kg))를 복강 내 (IP)로 주사하십시오. 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 결정하고 동물이 반응이 없을 때까지 기다리십시오. 안과 용 연고 또는 인공 눈물을 양쪽 눈에 바르십시오.
- 플랫폼에 마우스를 수용하십시오.
- 망막 안저의 시야가 선명하고 초점이 맞춰질 때까지 플랫폼의 높이와 각도를 조정하십시오. 안저 사진을 찍습니다.
- 이미징 및 OCT 소프트웨어를 엽니다. OCT 프로그램에서 넛지를 5로 조정합니다.
- 화상에서 75μm 떨어진 곳에서 OCT 이미지를 촬영합니다. 망막의 다른 세 사분면에 대해 반복하십시오.
- 1% 플루오레세인 IP 100μL를 주입한다.
- 카메라를 488nm 필터로 전환합니다. 카메라 게인을 5로 늘립니다.
- 플루오레세인 주사 후 정확히 5분 후에 안저 사진을 찍습니다.
알림: 플루오레세인은 망막 광 손상을 악화시킬 수 있으므로 최대 설정에서 카메라 조명에 눈을 장기간 노출시키지 마십시오. 5분의 대기 시간이 경과하고 마우스를 이미징할 준비가 될 때까지 광원을 끄십시오.
3. 애프터 케어
- 1mL의 멸균 식염수 IP를 주입합니다. 윤활제 점안액을 양쪽 눈에 바릅니다. 안과 용 연고 또는 인공 눈물을 양쪽 눈에 바르십시오.
- 마우스가 마취에서 회복되는 것을 관찰하십시오. 완전히 회복 된 경우에만 다른 동물과 함께 케이지로 돌아갑니다 (일반적으로 약 40 분 후).
4. 제외 기준 평가
- 시술 후 24시간에 촬영한 안저 이미지를 열어 제외 기준을 평가합니다. 다음 기준 중 하나라도 확인되면 눈을 제외하십시오.
- 이미지에 폐색이 없는지 평가
- 폐색된 혈관의 수에 대한 이미지를 평가합니다.
알림: 성공적인 폐색은 일반적으로 화상 위 또는 주변에 약간의 자주색 색소 침착, 화상을 통한 매우 얇거나 불연속적인 혈관, 화상 영역 외부의 희미하거나 존재하지 않는 혈관 모양, 저산소증으로 인한 망막 변색이 있습니다. 레이저에 의해 흰색 화상을 통해 전체 혈관을 볼 수 있다면 혈관이 폐색되지 않았습니다. 때로는 혈관이 부분적으로 막힌 것처럼 보이지만 화상 외부에서 방해받지 않는 것처럼 보이면 혈관이 폐색되지 않았을 가능성이 큽니다. - 모호한 경우, 동시에 FA 이미징을 사용하여 교합을 평가합니다. 이 이미지에서 폐색은 종종 주변 혈관의 테이퍼링과 함께 용기의 연속성이 끊어지는 것처럼 보입니다.
- 제로 폐색이 확인되면 RVO가 효과가없는 것으로 간주되므로 분석에서 눈을 제외하십시오.
참고: 폐색은 일반적으로 RVO 후 48-72시간까지 해결되며 폐색의 존재는 더 이상 이러한 시점에서 제외 기준으로 사용되어서는 안 됩니다.
- 폐색된 혈관의 수에 대한 이미지를 평가합니다.
- 과도한 망막 박리에 대한 안저 및 OCT 이미지 평가
알림: 망막하 유체 축적은 RVO 유도 후 흔하며 RPE에서 신경 망막이 분리됩니다. 과도한 망막 박리에 대한 제외 기준은 다음과 같이 정의됩니다 : OCT는 완전히 볼 수 없거나 일부 레이어가 엄청나게 왜곡되어 나타납니다. 이미지 품질이 좋지 않으며 외부 플렉시 폼 및 RPE 레이어의 해상도가 손실됩니다. 신경 망막과 맥락막 사이의 간격은 OCT 시야가 허용하는 것보다 큽니다. 안저 이미지에서 망막 톤은 거의 완전히 흰색이며 약간의 보라색 얼룩이 있습니다. 망막의 일부가 왜곡되어 초점이 맞지 않을 수 있습니다. 이것은 망막이 분리되어 망막의 나머지 부분과 다른 초점 거리에 있기 때문입니다.- 눈에서 이미지를 평가하여 망막의 말초 또는 완전한 분리를 결정하는 경우 분석에서 눈을 제외하십시오.
- 각막 백내장의 증거가 있는 이미지 제외
참고: 각막 백내장은 마우스의 각막에 불투명한 흰색 점으로 나타납니다. 백내장은 일반적으로 동물이 마취되는 동안 눈의 윤활이 충분하지 않아 발생하며 눈 연고를 넉넉하게 바르면 크게 피할 수 있습니다. 백내장은 일반적으로 동물을 검사하여 영상화 전에 확인할 수 있습니다. 백내장이 발생한 마우스는 이미징 과정을 거칠 필요없이 데이터 세트에서 제외해야합니다. 영상에서 백내장은 카메라에서 망막을 가리고 OCT가 뒤틀린 것처럼 보입니다. - 과도한 출혈에 대한 이미지 평가
참고: 과도한 출혈은 이미지에서 붉은 액체의 양으로 식별될 수 있으며 일반적으로 망막 배경, 혈관 및 화상을 가립니다. 이러한 빨간색 유체 영역은 성공적인 RVO에서 정상적인 보라색 얼룩보다 더 밝고 불투명한 빨간색입니다. 출혈은 OCT 영상에서 신경절 세포층에 나타나며 출혈 아래의 다른 망막층을 시각화하는 능력을 방해합니다.- 이미지에 과도한 출혈이 있는 것으로 판단되면 분석에서 눈을 제외합니다.
5. 플루오레세인 이미지 처리
- 이미지 처리 소프트웨어에서 플루오레세인 이미지를 엽니다.
- 이미지 복제
- 선택 도구를 사용하여 주요 선박을주의 깊게 추적하십시오.
- 주요 혈관은 시신경에서 방사되는 두꺼운 정맥과 동맥입니다. 이 선박에서 분기되는 선박은 무시하십시오.
- 누출로 인해 용기의 윤곽이 폐색 부위 근처에서 보이지 않으면 용기의 대략적인 위치에서 누출을 추적하십시오 (두께 유지, 마지막 가시 점을 다음 가시 지점에 연결).
- 첫 번째 이미지에서 배경 만 남기고 선택 항목을 삭제하십시오. 이 마스크된 이미지를 저장합니다.
- 선택 영역을 두 번째 이미지로 이동하고 선택 영역을 반전하고 삭제하여 용기를 분리합니다. 이 마스크된 이미지를 저장합니다.
- ImageJ에서 두 이미지를 엽니다. 배경 이미지를 열고 통합 밀도를 측정합니다.
- 용기의 이미지를 열고 혈관의 윤곽을 선택한 다음 평균 강도를 측정합니다.
- 배경의 통합 밀도를 혈관의 평균 강도로 나누어 눈의 누출 비율을 생성합니다.
- 실험 코호트에서 각 눈에 대한 이 누출 비율을 기록합니다.
- 배경을 추가로 제어하려면 실험용 눈을 다치지 않은 대조군 눈의 평균 누출 비율로 정규화합니다.
참고: FA 이미지에서 플루오레세인 누출의 표준화된 정량화를 생성하기 위해 이 계산은 배경 밀도(누출이 있는 위치)와 주요 용기의 밝기의 비율을 사용하여 이미지에서 이미지로의 밝기 변화를 제어하는 결과를 생성하고 안정적으로 정량화할 수 있습니다. 손상되지 않은 눈은 누출이 없으며 이론적으로 비율이 0이어야합니다. 따라서 손상되지 않은 대조군 눈에서 계산된 비율은 배경 소음을 나타내며 이 값은 실험 값을 추가로 정규화하는 데 사용됩니다.
6. 망막 층 두께
- 이미지 처리 소프트웨어에서 OCT 이미지를 엽니다.
- 신경절 세포층, 내부 플렉시 폼 층, 내부 핵층, 외부 플렉시 폼 층, 광 수용체 층 및 RPE 층의 경계를 추적하십시오. 각 층의 평균 두께를 측정합니다.
- 망막의 다른 세 사분면의 OCT 이미지에 대해 반복합니다. 눈에 대한 각 망막 층의 평균 두께를 얻기 위해 4 개의 사분면에 걸친 평균 층 두께를 평균화합니다.
- 실험 코호트의 각 눈에 대해 반복합니다.
7. 망막 내층의 무질서 (DRIL)
- 이미지J에서 OCT 이미지를 엽니다.
- 선 도구를 사용하여 외부 플렉시 폼 레이어의 상단 경계가 불분명 한 거리를 측정합니다.
참고: DRIL과 이미징 아티팩트로 인한 레이어 가시성이 좋지 않은 영역을 구별하는 것이 중요합니다. OCT 이미지 품질이 좋지 않으면 충분한 이미지 해상도가 불가능한 경우 DRIL 분석에 대한 눈이 무효화될 수 있습니다. DRIL이 있는 이미지에는 일반적으로 명확하게 분해되고 구성된 다른 영역 또는 망막 층이 있으며, 이는 충분한 이미지 품질을 나타내는 좋은 지표가 될 수 있습니다.- 무질서가 시작되는 위도에서 외부 플렉시 폼 층의 상단 경계가 다시 보이는 위도까지 수평으로 측정하십시오. 외부 플렉시 폼 층이 수직으로 위 또는 아래로 이동하더라도 완벽하게 수평으로 측정하십시오.
- 무질서한 영역으로 구분된 여러 무질서 영역이 있을 수 있습니다. 이를 개별적으로 측정하고 거리의 합을 계산하십시오.
- 무질서의 길이를 각 OCT 영상에서 볼 수 있는 망막의 전체 길이로 나누어 영상에 대한 무질서의 비율을 구합니다.
- 망막의 다른 세 사분면의 OCT 이미지에 대해 측정 및 계산을 반복합니다.
- 4개의 OCT 이미지에서 무질서 비율의 평균을 취하십시오. 이 숫자는 전체 망막의 평균 무질서를 나타냅니다. 실험 코호트의 각 눈에 대해 반복합니다.
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Representative Results
이러한 분석 방법을 통해 FA 및 OCT 영상으로 캡처 한 망막 병리의 정량화를 가능하게합니다. 대표 데이터를 추출한 실험은 손상되지 않은 대조군 역할을 하거나 RVO 절차를 거치고 Pen1-XBir3 치료 안약 또는 Pen1-식염수 차량 안약을 받은 C57BL/6J 수컷 마우스를 사용했습니다. RVO 손상 모델은 광활성제 염료12인 로즈 벵갈의 꼬리 정맥 주사 후 마취된 마우스의 각 눈에 있는 주요 정맥의 레이저 조사(532nm)를 포함했습니다. 3개의 레이저 펄스가 시신경 센터로부터 평균 375μm의 거리에 전달되어 광응고를 유도하고 혈관(12)을 폐색하였다. RVO 절차의 효과적인 사용은 Avrutsky et al.12에 나와 있으며 RVO 방법 최적화에 대한 자세한 내용은 Colón Ortiz et al.13에 자세히 설명되어 있습니다. 그림 1A는 두 그룹의 FA 및 OCT 이미지의 예를 보여줍니다. 광응고 과정을 통한 폐색 형성 및 안정화의 다양한 특성으로 인해 다양한 정도의 손상이 관찰될 수 있습니다. 일부 망막에서는 RVO 절차에 의해 유도 된 손상이 망막 이미지를 분석에 적합하지 않게 만드는 안과 병리를 도입합니다. 획득 후 최적의 분석과 신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해 먼저 이미지를 제외 기준에 대해 평가해야 합니다. 그림 1B에 설명된 이러한 제외 기준에는 망막 박리, 출혈 및 백내장이 포함됩니다. 예제 안저 및 OCT 이미지에서 볼 수 있듯이 이러한 병리는 명확한 OCT 영상을 방해하여 망막을 데이터 분석에 적합하지 않게 만듭니다. 또한 일부 망막에는 안정적인 폐색이 없을 수 있습니다. 이러한 이미지는 허혈성 저산소 손상을 정확하게 모델링하지 않으므로 분석에서 제외해야 합니다.
혈액 - 망막 장벽의 파괴는 RVO14,15의 발병 기전에 기여합니다. 혈관에서 누출 정도를 평가하는 것은 부상으로 인한 혈관 투과성의 유용한 지표입니다. FA 이미징은 이러한 누출의 시각화를 허용하지만 순환 속도의 차이와 같은 여러 요인이 FA 이미지의 원시 강도에 영향을 미치고 일관된 정량화를 만듭니다16,17. 우리의 방법은 망막에서 관찰되는 강도를 주요 혈관의 평균 강도로 정규화하여 이러한 변동성을 제어합니다. 이것은 다른 사람들과 비교되고 분석될 수 있는 각 망막 이미지에 대한 누출 비율을 제공합니다. 그림 2A는 망막의 다른 영역과 주요 혈관을 분리하는 이 계산에 사용된 마스킹 이미지를 보여줍니다. 플루오레세인을 정량화하는 능력은 부상 심각도와 치료 효능의 비교뿐만 아니라 부상 시간 경과에 따른 누출의 변화에 대한 연구(그림 2B)를 가능하게 하며, 이는 질적 보고만으로는 입증하기에는 너무 미묘한 효과일 수 있습니다.
OCT 이미징을 통해 RVO가 개별 망막층과 전체 망막 두께에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다. 도 3A 는 OCT 이미지에서 망막의 층들의 묘사를 도시한다. 각 레이어의 경계를 추적하면(그림 3B) 여러 가지 분석 방법이 가능합니다. 각 망막 층의 두께 정량화는 초기 부종 반응이 내부 망막 층에 더 큰 영향을 미치기 때문에 유용합니다. 흔적은 또한 전체 망막 두께에 대한 연구와 내부 대 외부 망막 층의 분리 된 분석을 허용합니다. 도 3C 는 망막층의 초기 염증성 팽창 및 궁극적인 퇴행성 얇아짐이 관찰될 수 있는 RVO 손상의 시간 경과에 대한 분석을 제공한다. 시간이 지남에 따라 각 층의 두께를 플로팅하면 내부 핵층이 초기 손상에 대해 훨씬 더 큰 반응을 경험하지만 내부 플렉시 폼 층은 초기 부종이 안정화되고 기준선으로 돌아온 후 더 심한 얇아짐을 보이는 내부 플렉시 폼 및 내부 핵 층에 대해 다른 역학을 보여줍니다 (그림 3D ). 이를 통해 서로 다른 시점에서 반응의 동인을 보다 정확하게 이해할 수 있습니다. 또한 부종을 완화하고 궁극적인 퇴행으로부터 보호하는 데 카스파아제 억제제의 효과를 테스트했으며, 분석 결과 개별 층에서 다른 효과가 밝혀졌습니다.
내부 망막층의 해체 (DRIL)는 당뇨병 성 망막증에서 허혈의 진단 척도로 사용되는 또 다른 OCT 기능이며 RVO18,19에서 시력의 예측 척도입니다. OCT 이미징에서 DRIL은 외부 플렉시 폼 층(12)의 상부 경계가 사라지는 것으로 나타나 외부 플렉시 형태 및 내부 핵 층을 함께 혼합합니다 (그림 4A). 그림 4B는 DRIL의 강조 표시된 영역이 있는 OCT 이미지의 두 가지 예를 보여줍니다. 우리는 DRIL을 총 망막 길이의 비율로 표현하며 4 개의 OCT 단면에 걸쳐 평균합니다. 이 측정을 통해 실험 그룹을 정량적으로 비교할 수 있습니다. 도 4C는 RVO에서 망막 손상을 완화시키는 억제제의 효능을 조사하기 위해 두 실험 그룹의 망막 해체를 비교한 분석의 예를 제시한다.
그림 1: 형광 혈관조영술(FA) 및 광학 간섭 단층 촬영 (OCT) 영상에서 얻은 이미지. (A) RVO 후 24 시간 및 손상되지 않은 대조군의 망막에서 FA 및 OCT 이미지의 예. (B) 다른 배제 기준의 안저 및 OCT 영상 : 과도한 망막 박리, 출혈, 각막 백내장 및 폐색 없음. OCT 획득 거리는 녹색 지침으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 플루오레세 인 누출의 정량화. (A) 분석을 위한 혈관 및 배경으로 FA 이미지 분리 (B) 시술 후 24시간 및 48시간에 Pen1-XBir3 억제제 점안액(N=17) 또는 Pen1-식염수 비히클 점안액(N=13) 중 하나를 투여받은 C57BL/6J 망막 정맥 폐색(RVO) 마우스의 눈에서 플루오레세인 누출 정량화. 배경 이미지의 강도 판독값은 선박 이미지로부터의 평균 강도 판독값으로 정규화된다. RVO 마우스에 대한 강도 판독의 평균은 손상되지 않은 대조군으로 추가로 정규화됩니다. 오차 막대는 SEM과 함께 평균을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: OCT 이미지에서 망막층 두께의 정량화 . (A) 개별 망막 층이 표시된 손상되지 않은 망막 : 신경절 세포층, 내부 플렉시 폼 층, 내부 핵 층, 외부 플렉시 폼 층, 광 수용체 층, RPE 및 맥락막. (B) 손상되지 않은 대조군 및 RVO C57/BL6 이후 24시간 동안 촬영한 OCT 이미지의 레이어 트레이스의 예. (C) RVO 후 4 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 8 일에 C57BL / 6J 마우스 망막의 OCT 영상에서 관찰 된 총 망막 두께 및 망막 내 두께의 변화의 정량화. (D) RVO 시술 직후 및 RVO 후 24-h Pen1-XBir3 억제제 점안액 (N = 14) 또는 Pen1-식염수 차량 점안액 (N = 15)을 투여받은 C57BL / 6J 마우스에 대한 RVO 후 24 시간, 48 시간 및 8 일에 C57BL / 6J 마우스 망막의 내부 플렉시 폼 및 내부 핵층의 두께 변화 정량화. 오차 막대는 SEM과 함께 평균을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: RVO 후 OCT 이미지에서 관찰된 망막 내부 분해층(DRIL)의 정량화. OCT 이미지에서 DRIL은 내부 핵 층과 외부 플렉시 폼 층 사이의 명확한 묘사 손실로 표시됩니다. (A) OCT 영상에서 DRIL이 있거나 없는 망막 절편의 예. (B) C57BL/6J 마우스 24시간 후 RVO에서 두 영역의 OCT 이미징에서 DRIL 영역, 흰색 선으로 표시됨. DRIL은 망막의 모양을 따르는 대신 이미지를 가로질러 수평으로 측정됩니다. (C) RVO 절차 후 2.5mg의 Pen1-XBir3 억제제 안약(N=19) 또는 Pen1-식염수 비히클 점안액(N=21)을 투여받은 C57BL/6J 마우스의 눈에 대해 RVO 후 24시간 및 48시간에 DRIL이 관찰된 망막 길이의 비율의 정량화. 오차 막대는 SEM과 함께 평균을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
비침습적 설치류 망막 영상은 병리학을 연구하고 중재를 개발할 수 있는 방법을 제시합니다. 이전 연구에서는 RVO의 마우스 모델을 개발하고 최적화하여 가변성을 제한하고 쥐 망막 5,7,13에서 일반적인 임상 병리의 신뢰할 수있는 번역을 허용했습니다. 안과 영상 기술의 발전은 실험 동물에서 FA 및 OCT와 같은 임상 생체 내 영상 기술의 사용을 추가로 허용하여 마우스 모델을 인간 질병 6,12,15의 프로파일과 비교할 수 있는 능력을 부여합니다. 그러나 이러한 이미지에서 추출할 수 있는 정보와 모델의 전반적인 변환 잠재력을 최대화하려면 이미지 분석을 위한 표준화되고 재현 가능하며 엄격한 정량적 방법이 필요합니다. 여기에서는 손상 심각도를 정량적으로 표현할 수있는 분석 방법을 제시하여 마우스와 실험 그룹 간에보다 정확하고 신뢰할 수있는 비교를 가능하게합니다. 이러한 분석에는 FA 이미지의 누설 정량화, 평균 층 두께의 정량화 및 OCT 이미지의 DRIL 영역이 포함됩니다.
성공적인 분석의 중요한 요소는 획득 한 이미지의 품질에 있습니다. 제대로 해결되지 않은 OCT 이미지는 개별 레이어를 추적하기 어렵고 망막 내부 무질서와 열악한 이미지 품질을 구별하지 못할 수 있습니다. 이미징할 때 플랫폼에서 마우스의 위치에 주의를 기울여 안저 이미지에 초점이 맞고 시신경이 상대적으로 중앙에 있으며 망막 단면이 이미지를 가로질러 수평인지 확인하는 것이 중요합니다. 동물이 마취되는 동안 눈의 일관된 윤활도 중요하며, 특히 동일한 동물을 여러 날 이미지화하는 경우 더욱 그렇습니다. 윤활이 충분하지 않으면 각막 백내장이 발생하여 망막이 가려지고 영상에 적합하지 않게 될 수 있습니다. RVO 영상에서 다양한 망막 병리가 발생하여 이미지를 분석에 적합하지 않게 만들 수 있습니다. 여기에는 과도한 망막 박리 및 과도한 출혈이 포함되며, 이는 영상의 품질을 크게 손상시키는 것과 함께 RVO 모델로 사용하기에는 너무 심각한 손상 정도를 나타냅니다. 또한 모든 폐색 된 혈관이 부상 직후 완전히 재관류 될 수 있으며, 이는 RVO 손상을 정확하게 모델링하지 않으며 제외 기준으로 사용해야합니다. 그러나 성공적인 폐색은 부상 후 48-72 시간까지 자연적으로 해결되며 배제 기준으로서의 폐색의 존재는 시술 후 24 시간 또는 그 이전에 가장 잘 사용된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. Colón Ortiz et al.13은 RVO 절차에 최적화된 모델에서 변동성을 제한하고 부상을 보정하기 위한 모범 사례를 자세히 설명합니다. 제외 기준의 식별 및 판단도 이미지 분석의 중요한 단계입니다. 이것은 주로 평가자의 재량에 달려 있기 때문에 평가자가 치료 그룹에 눈을 멀게하고 병리학 적 중증도 판단에서 일관성을 실천하는 것이 중요합니다. 이러한 방법의 적용에는 몇 가지 제한이 존재하며, 특히 여러 시점에서 동일한 마우스를 이미징하는 관행에 있습니다. 이미징을 위해 마우스를 마취할 수 있는 빈도에는 제한이 있으므로 최적의 시간 경로를 결정하기 위해 시점을 테스트하고 조정해야 합니다. 우리의 연구는 4 시간, 24 시간, 48 시간 및 8 일의 영상 시점을 사용하며, 초기 손상, 급성 염증 반응 및 장기 손상의 포착 단계를 발견했습니다12. 또한, 특정 마우스 균주는 다양한 당뇨병 마우스 모델을 포함하는 각막 백내장의 발병에 더 취약하며, 이는 많은 수의 배제 또는 불완전한 시간 과정20,21로 이어질 수 있습니다. 이러한 마우스 라인을 활용하는 연구는 각막의 민감도에 따라 실험 그룹 크기 또는 이미징 시점을 조정해야 할 수 있습니다.
Fluorescein 혈관 조영술 영상은 주로 누출과 같은 망막 병리 및 변경된 혈류 RVO6의 패턴을 관찰하고 등급을 매기기 위해 정성적으로 사용되었습니다. 최근에, 혈관 면적 및 비틀림의 계산(16) 및 이미지 강도 시간성의 선형 회귀 분석(17)과 같은 동물 모델에서 FA의 정량적 분석을 개발하려는 노력이 있어 왔다. 안저 배경으로부터 주요 혈관의 분할은 이전에 사용되었지만, 충진 및 감쇠 역학의 픽셀 분석에서, 상이한 마우스에서 이미지 강도의 가변성을 증언한다17. 또한, 비뚤림 가능성은 fluorescein pooling17의 해석에서 언급되었다. 여기에서 논의된 정량적 방법은 주요 망막 혈관구조에서 플루오레세인의 누출을 목표로 하며, 이는 RVO 손상11,12,14에서 역할을 하는 것으로 입증된 BRB의 파괴를 나타냅니다. 누설의 대안적인 분석은 망막 플랫 마운트(22) 상의 염료 누설을 정량화한다. 그러나 침습적 사후 분석은 누출이 여러 시점에서 연구되는 단일 마우스 내에서 RVO 손상의 타임 라인 연구에는 적합하지 않습니다. 망막 질환의 상이한 단계에서의 플루오레세인 누출 영역의 분석은 이전에 임상 연구에서 사용되었고, 다른 관찰된 질병 병리와 상관관계가 있다23. 이 방법을 사용하면 생체 내 혈관 누출을 연구하기 위해 FA 이미지를 유사하게 활용하여 RVO 손상 타임라인 내에서 누출 역학을 연구할 수 있습니다. 누출 영역의 선택은 영역의 평가자 선택에 의존하기 때문에 주관성을 통해 잠재적으로 더 많은 변동성을 도입합니다. 또한 여기에서 논의 된 RVO 손상 모델에 대한 연구는 망막 전체의 누출을 조사하기 때문에 대신 마스킹 기술을 사용하여 계산하기로 결정했습니다. 이 누출 방법은 DRIL 및 OCT 층 추적 분석에 의해 밝혀진 것과는 다른 RVO 손상 측면을 반영하며 이러한 측정과의 상관 관계를 통해보다 정확한 질병 프로필을 생성 할 수 있습니다.
OCT 이미지를 평가하는 두 가지 방법을 제시합니다. 망막 층의 급성 염증 및 후속 퇴행은 RVO 손상 6,12의 특징입니다. 여기에 자세히 설명된 OCT 계층 추적 방법론을 사용하면 개별 층을 정확하게 연구할 수 있으며 망막의 여러 영역에서 보다 미묘한 효과와 역학 차이를 알 수 있습니다. 이 분석 기술은 OCT 이미징에서 망막층 두께의 정량화를 위해 일반적으로 사용되는 다른 프로토콜을 기반으로 합니다. 이 방법은 층 두께를 추정하는 데 사용되는 영역의 프로토콜 간의 변동과 이미지11에 걸쳐 수행된 측정 수를 해결합니다. 각 망막층 내에서 얇아짐이 균일하지 않기 때문에 더 적은 점 측정을 사용하는 방법은 손상 효과에 대한 완전한 그림을 제공하지 못할 것입니다. 망막 층 두께에 대한 여러 측정 전략의 메타 분석에 따르면 OCT 이미지의 더 넓은 영역에 걸쳐 평균화 된 프로토콜은 질병 중증도와 더 높은 상관 관계 및 더 큰 반복성을 나타냈다11. 전체 이미지에 걸쳐 평균을 냄으로써이 방법은 장기 RVO 손상에 존재하는 망막 얇아짐을보다 정확하게 표현합니다. 연구는 또한 OCT 이미지가 촬영되는 위치 측면에서 다릅니다 - 많은 연구가 시신경에 대한 이미징을 중심으로합니다. 대조적으로, 제시된 방법은 폐색에 상대적이다. 인간 OCT 이미징 분석의 최근 발전은 특징을 분류하고 정량화하기 위한 기계 학습 알고리즘의 사용이다(24). 이러한 분석은 동물 망막 영상 분석을위한 유망한 미래 방향이 될 수 있습니다.
또한 모세 혈관 허혈의 임상 측정 인 DRIL을 설치류 모델로 번역하는 것을 제시합니다. 인간에서 DRIL은 시력 손실 및 망막 두께 차이의 예측 인자로 밝혀졌으며 높은 진단 민감도와 특이도를 입증했습니다18,19. 무질서한 망막의 비율을 측정하여 마우스에서 DRIL을 정량화하면 폐색 된 정맥의 분율, RVO 후 7 일째의 ERG b 파 진폭 및 RVO12 후 8 일째의 망막 얇아짐과의 상관 관계가 나타났습니다. DRIL 측정의 대안은 망막 저산소증 및 허혈성 손상을 측정하기 위해 HYPOX-4를 사용하는 것입니다. HYPOX-4는 저산소증 마커 인 피모 니다졸 아니메 하이드로 클로라이드와 망막 저산소증25를 검출하는 형광 프로브를 결합합니다. HYPOX-4를 사용하는 대부분의 프로토콜은 침습적이며 망막 플랫 마운트 분석을 필요로하며, 이는 손상 타임 라인의 구축에 덜 적합 할 수 있지만 HYPOX-4 프로브를 사용하는 생체 내 이미징 프로토콜이 최근에 파일럿되었습니다25. DRIL 분석은 각 OCT 이미지의 단일 측정이 망막층 추적과 같은 분석보다 시간 효율적이기 때문에 망막 손상의 빠른 판독으로도 유용합니다. 그러나 이러한 조치는 상호 교환 할 수 없으며 다른 망막 병리를 나타냅니다. 오히려 DRIL을 효과 크기 또는 개입 효능에 대한 초기 판독값으로 사용할 수 있는 병행하여 사용해야 하며, 망막층의 보다 미묘한 효과에 대한 철저한 분석을 위해 층 추적을 사용할 수 있습니다.
이러한 방법은 본질적으로 직교하므로 각 실험 대상에 대한 질병 프로파일을 생성 할 수 있습니다. 이러한 각 방법에 의해보고 된 병리는 뚜렷하기 때문에 비례 적으로 확장되는 것이 보장되지 않으며 병리학에 대한보다 전체적인 그림을 얻으면 RVO 손상의 다양한 증상 구성을보다 엄격하게 조사 할 수 있습니다. 각 실험 동물의 이미징에서 추출 할 수있는 정보의 양을 최대화 할 수있는 능력은 중요한 결론을 도출하는 데 필요한 동물의 수를 줄여 실험 프로세스의 효율성을 향상시킵니다. 최근에 정제된 RVO 프로토콜에 이러한 방법을 적용하면 임상 표현형을 동물 모델로 번역하는 재현성과 연구를 높일 수 있습니다. RVO 모델의 연구 외에도 이러한 방법의 사용은 FA 및 OCT 영상을 사용하는 다른 망막 질환 모델에 적용됩니다. 이러한 마우스 모델의 예로는 연령 관련 황반 부종(AMD)26, 당뇨병성 황반 부종(DME)23, 맥락막 신생혈관(CNV)27, 실험적 자가면역 포도막염(EAU)28 및 미숙아 망막병증(ROP)15이 포함됩니다. 이러한 방법은 다른 종에서 이러한 질병의 모델을 연구 할 때 FA 및 OCT 이미징을 사용하는 연구로 일반화 될 수 있습니다. 이러한 정량화는 또한 질병 메커니즘의 보다 미묘한 변화에 민감하므로 도 3D 및 도 4C와 같이 치료 효능의 평가에 유용하다. 유용성은 또한 약물 화합물의 내약성 연구에서 독성 테스트에서 이미징의 사용으로 확장됩니다. 이러한 분석 프로토콜의 표준화 및 재현성은 동물 모델의 번역 유효성을 개선하고 망막 혈관 질환의 발병 기전 및 병태생리학에 대한 이해를 확장하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램(NSF-GRFP) 보조금 DGE - 1644869(CKCO), 국립 안과 연구소(NEI) 5T32EY013933(AMP), 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(RO1 NS081333, R03 NS099920에서 CMT), 국방부 육군/공군(DURIP에서 CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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