Summary
Aqui, apresentamos três protocolos de análise de dados para angiografia fluoresceína (AF) e tomografia de coerência óptica (OCT) no estudo da Oclusão da Veia Retiniana (RVO).
Abstract
Os avanços nas ferramentas de imagem oftálmica oferecem um nível sem precedentes de acesso a pesquisadores que trabalham com modelos animais de lesão neurovascular. Para alavancar adequadamente essa maior traduzibilidade, há uma necessidade de conceber métodos reprodutíveis de extrair dados quantitativos dessas imagens. A tomografia de coerência óptica (OCT) pode resolver a histologia da retina na resolução de micrômetros e revelar diferenças funcionais no fluxo sanguíneo vascular. Aqui, delineamos leituras vasculares não invasivas que usamos para caracterizar o dano patológico pós-insulto vascular em um modelo otimizado de oclusão da veia retiniana (RVO) em camundongos. Essas leituras incluem análise de imagens ao vivo da morfologia da retina, desorganização das camadas internas da retina (DRIL) medida de isquemia capilar e medidas de angiografia fluoresceína de edema retiniano e densidade vascular. Essas técnicas correspondem diretamente àquelas usadas para examinar pacientes com doença da retina na clínica. A padronização desses métodos permite a comparação direta e reprodutível de modelos animais com fenótipos clínicos de doença oftálmica, aumentando o poder translacional dos modelos de lesão vascular.
Introduction
A doença neurovascular é um importante problema de saúde responsável por acidentes vasculares cerebrais isquêmicos, uma das principais causas de mortalidade e morbidade, e doenças vasculares da retina que levam à perda de visão 1,2. Para modelar a doença neurovascular, empregamos um modelo de camundongo de oclusão da veia retiniana (RVO). Este modelo não é invasivo e utiliza técnicas de imagem in vivo semelhantes àquelas usadas para examinar pessoas com doença vascular da retina em um ambiente clínico. A utilização desse modelo aumenta, assim, o potencial translacional dos estudos que utilizam esse modelo. Tal como acontece com todos os modelos de mouse, é fundamental maximizar a reprodutibilidade do modelo.
As doenças vasculares da retina são uma das principais causas de perda de visão em pessoas com menos de 70 anos. A RVO é a segunda doença vascular retiniana mais comum depois da retinopatia diabética3. As características clínicas características da OVR incluem lesão isquêmica, edema de retina e perda de visão como consequência da perda neuronal 3,4. Modelos de RVO em camundongos utilizando fotocoagulação a laser de vasos importantes foram desenvolvidos e refinados para replicar as principais patologias clínicas observadas no RVO humano 5,6,7. Os avanços na imagem oftálmica também permitem a replicação de ferramentas diagnósticas não invasivas utilizadas em humanos, a saber, a angiografia fluoresceína (AF) e a tomografia de coerência óptica (OCT)6. A Angiografia por Fluoresceína permite a observação de vazamentos devido à quebra da barreira sangue-retina (BRB), bem como a dinâmica do fluxo sanguíneo na retina, incluindo locais de oclusão, utilizando a injeção de fluoresceína, um pequeno corante fluorescente 8,9. A OCT permite a aquisição de imagens transversais de alta resolução da retina e o estudo da espessura e organização das camadas retinianas10. A análise de imagens de AF tem sido historicamente em grande parte qualitativa, o que limita o potencial de comparação direta e reprodutível entre os estudos. Recentemente, vários métodos têm sido desenvolvidos para a quantificação da espessura da camada em imagens de OCT, embora atualmente não exista um protocolo de análise padronizado e o local de aquisição da imagem da OCT varie11. Para aproveitar adequadamente essas ferramentas, é necessária uma metodologia de análise de dados padronizada, quantitativa e replicável. Neste trabalho, apresentamos três dessas leituras vasculares utilizadas para avaliar o dano patológico em um modelo de camundongo de vazamento de RVO-fluoresceína, espessura da camada OCT e desorganização das camadas retinianas.
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Protocol
Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia.
NOTA: A imagem foi feita em camundongos machos C57BL/6J de 2 meses de idade que pesavam aproximadamente 23 g.
1. Preparação de reagentes para imagens da retina
- Preparação de solução injetável de fluoresceína.
NOTA: A fluoresceína é muito sensível à luz. Proteja da luz e use-o logo após a preparação.- Diluir a fluoresceína a uma concentração de 1% em solução salina estéril.
- Preparação de cetamina/xilazina
- Diluir cetamina e xilazina em solução salina estéril de acordo com a seguinte concentração: cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg).
- Solução salina estéril
- Prepare uma seringa de 5 ml com uma agulha de 26 G com solução salina estéril.
2. OCT e imagens fluoresceínas
- Ligue a caixa de luz do microscópio de imagem da retina, a máquina OCT e a plataforma de mouse aquecida.
- Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens.
- Adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida a cada olho.
- Injete 150 μL de anestesia (cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)) por via intraperitoneal (IP). Determine a profundidade da anestesia por beliscão do dedo do pé e espere até que o animal não responda. Aplique pomada oftálmica ou lágrimas artificiais em ambos os olhos.
- Acomodem o mouse na plataforma.
- Ajuste a altura e o ângulo da plataforma até que a visão do fundo retiniano esteja clara e focada. Tire uma foto do fundo.
- Abra o software de imagem e OCT. No programa OCT, ajuste o empurrão para 5.
- Tire uma imagem OCT a 75 μm distal da queimadura. Repita para os outros três quadrantes da retina.
- Injete 100 μL de 1% de fluoresceína IP.
- Mude a câmera para um filtro de 488 nm. Aumente o ganho da câmera para 5.
- Tire uma foto do fundo de olho exatamente 5 minutos após a injeção de fluoresceína.
NOTA: Evite a exposição prolongada do olho à luz da câmera na configuração máxima, pois a fluoresceína pode exacerbar os fotodanos da retina. Mantenha a fonte de luz desligada até que o tempo de espera de 5 minutos tenha decorrido e o mouse esteja pronto para a geração de imagens.
3. Cuidados posteriores
- Injete 1 mL de solução salina estéril IP. Aplique colírios lubrificantes em ambos os olhos. Aplique pomada oftálmica ou lágrimas artificiais em ambos os olhos.
- Observe o rato enquanto ele se recupera da anestesia. Retornar à gaiola com outros animais somente quando totalmente recuperado, geralmente após cerca de 40 min.
4. Avaliação dos critérios de exclusão
- Abra a imagem do fundo de olho tirada 24 horas após o procedimento para avaliar os critérios de exclusão. Exclua o olho se algum dos seguintes critérios for identificado.
- Avaliar se a imagem tem zero oclusões
- Avalie a imagem para o número de vasos ocluídos.
NOTA: Uma oclusão bem-sucedida geralmente tem alguma pigmentação roxa sobre ou ao redor da queimadura, vaso muito fino ou descontínuo através da queimadura, aparência de vaso fraco ou inexistente fora da área da queimadura e descoloração da retina por hipóxia. Se todo o vaso pode ser visto através da queimadura branca pelo laser, o vaso não conseguiu ocluir. Às vezes, o vaso aparecerá parcialmente obstruído, mas se parecer ininterrupto fora da queimadura, o vaso provavelmente não ocluiu. - Para casos ambíguos, use imagens de AF ao mesmo tempo para avaliar as oclusões. Nessas imagens, uma oclusão aparecerá como uma quebra na continuidade de um vaso, muitas vezes com um afunilamento do vaso circundante.
- Se forem identificadas oclusões zero, exclua o olho da análise, pois o RVO é considerado ineficaz.
NOTA: As oclusões geralmente se resolvem em 48-72 h pós-RVO, e a presença de oclusões não deve mais ser usada como critério de exclusão nesses momentos.
- Avalie a imagem para o número de vasos ocluídos.
- Avaliar as imagens de fundo de olho e OCT para descolamento excessivo de retina
NOTA: O acúmulo de líquido sub-retiniano é comum após a indução de RVO e causa a separação da retina neural da EPR. Os critérios de exclusão para o descolamento excessivo de retina são definidos da seguinte forma: a OCT será completamente invisível ou algumas camadas parecerão incrivelmente distorcidas. A qualidade da imagem é fraca, com perda de resolução das camadas plexiformes e PSE externas. A separação entre a retina neural e a coroide é maior do que o que o campo de visão OCT permite. Na imagem do fundo, o tom da retina será quase completamente branco, com algumas manchas roxas. Parte da retina pode parecer distorcida e fora de foco. Isso ocorre porque ele se desprendeu e está a uma distância focal diferente do resto da retina.- Se a avaliação das imagens de um olho determinar o descolamento periférico ou completo da retina, exclua o olho da análise.
- Excluir imagens com evidência de catarata corneana
NOTA: Uma catarata da córnea aparece como um ponto branco opaco na córnea do rato. A catarata geralmente ocorre devido à lubrificação insuficiente dos olhos enquanto o animal está anestesiado e pode ser amplamente evitada tomando cuidado para aplicar a pomada ocular generosamente. A catarata geralmente pode ser identificada antes da imagem, inspecionando o animal. Os ratos que desenvolveram catarata devem ser excluídos do conjunto de dados sem a necessidade de se submeterem ao processo de imagem. Na imagem, a catarata obscurecerá a retina da câmera e a OCT aparecerá deformada. - Avalie a imagem para hemorragia excessiva
NOTA: A hemorragia excessiva pode ser identificada como quantidades de líquido vermelho na imagem, geralmente obscurecendo o fundo da retina, o vaso e a queimadura. Essas áreas de fluido vermelho serão um vermelho mais brilhante e opaco do que as manchas roxas que são normais no RVO bem-sucedido. As hemorragias aparecem na camada de células ganglionares na imagem OCT e interferem na capacidade de visualizar outras camadas da retina sob a hemorragia.- Se a imagem for determinada como tendo uma hemorragia excessiva, exclua o olho da análise.
5. Processamento de imagem fluoresceína
- Abra a imagem fluoresceína no software de processamento de imagem.
- Duplicar a imagem
- Usando uma ferramenta de seleção, trace cuidadosamente os principais vasos.
- Os principais vasos são as veias e artérias mais espessas que irradiam para fora do disco óptico. Ignore quaisquer vasos que se ramificam a partir desses vasos.
- Se o vazamento impedir que o contorno do vaso seja visto perto do local de oclusão, rastreie o vazamento na localização aproximada do vaso (mantenha a espessura, conecte o último ponto visível ao próximo ponto visível).
- Na primeira imagem, exclua a seleção, deixando apenas o plano de fundo. Salve esta imagem mascarada.
- Mova a seleção para a segunda imagem, inverta a seleção e exclua, isolando os vasos. Salve esta imagem mascarada.
- Abra as duas imagens no ImageJ. Abra a imagem de fundo e meça a densidade integrada.
- Abra a imagem do vaso, selecione o contorno dos vasos e, em seguida, meça a intensidade média.
- Divida a densidade integrada do fundo pela intensidade média dos vasos, gerando a razão de vazamento para o olho.
- Registre essa razão de vazamento para cada olho em uma coorte experimental.
- Para maior controle do fundo, normalize os olhos experimentais para a razão média de vazamento dos olhos de controle não lesionados.
NOTA: A fim de criar uma quantificação padronizada do vazamento de fluoresceína na imagem FA, este cálculo usa uma razão da densidade de fundo (onde o vazamento estará presente) com o brilho dos principais vasos para criar resultados que controlam a variação no brilho de imagem para imagem e podem ser quantificados de forma confiável. Os olhos que não estão danificados não têm vazamento e teoricamente devem ter proporções de zero. As razões calculadas a partir desses olhos de controle não danificados, portanto, representam ruído de fundo, e esse valor é usado para normalizar ainda mais os valores experimentais.
6. Espessura da camada retiniana
- Abra a imagem da OCT no software de processamento de imagem.
- Trace as bordas da camada de células ganglionares, camada plexiforme interna, camada nuclear interna, camada plexiforme externa, camada fotorreceptora e camada RPE. Meça a espessura média de cada camada.
- Repita para imagens OCT dos outros três quadrantes da retina. Média das espessuras médias da camada nos quatro quadrantes para obter a espessura média de cada camada da retina para o olho.
- Repetir para cada olho na coorte experimental.
7. Desorganização das camadas internas da retina (DRIL)
- Abra a imagem da OCT no ImageJ.
- Usando a ferramenta de linha, meça a distância em que a borda superior da camada plexiforme externa é indistinta.
NOTA: É importante diferenciar entre DRIL e áreas de baixa visibilidade de camada causada por artefatos de imagem. A má qualidade da imagem OCT pode invalidar um olho para análise DRIL se a resolução de imagem suficiente não for possível. Imagens com DRIL normalmente terão outras regiões ou camadas da retina que são claramente resolvidas e organizadas, o que pode ser um bom indicador de qualidade de imagem suficiente.- Meça horizontalmente a partir da latitude onde a desorganização começa até a latitude onde a borda superior da camada plexiforme externa se torna visível novamente, se for o caso. Mesmo que a camada plexiforme externa se desloque para cima ou para baixo verticalmente, meça perfeitamente horizontalmente.
- Pode haver várias áreas de desorganização separadas por áreas sem desorganização. Meça-os individualmente e calcule a soma das distâncias.
- Divida o comprimento da desorganização pelo comprimento total da retina visível em cada imagem OCT para obter a proporção de desorganização para a imagem.
- Repita a medição e o cálculo para imagens OCT dos outros três quadrantes da retina.
- Tomemos a média das proporções de desorganização das quatro imagens da OCT. Este número representa a desorganização média para toda a retina. Repetir para cada olho na coorte experimental.
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Representative Results
Esses métodos de análise permitem a quantificação da patologia da retina capturada por imagens de AF e OCT. Os experimentos dos quais os dados representativos são extraídos usaram camundongos machos C57BL/6J que serviram como controles não feridos ou foram submetidos ao procedimento RVO e receberam colírios de tratamento Pen1-XBir3 ou colírios de veículo Pen1-Saline. O modelo de lesão RVO envolveu a irradiação a laser (532 nm) das veias principais em cada olho de um rato anestesiado após uma injeção na veia da cauda de rosa bengala, um corante fotoativador12. Três pulsos de laser foram liberados a uma distância média de 375 μm do centro do nervo óptico para induzir a fotocoagulação e ocluir os vasos12. O uso efetivo do procedimento RVO é demonstrado em Avrutsky et al.12, e mais detalhes sobre a otimização do método RVO são detalhados em Colón Ortiz et al.13. A Figura 1A mostra exemplos de imagens de AF e OCT de ambos os grupos. Devido à natureza variável da formação e estabilização da oclusão através do processo de fotocoagulação, diferentes graus de dano podem ser observados. Em algumas retinas, o dano induzido pelo procedimento RVO introduz patologias oftálmicas que tornam as imagens da retina inadequadas para análise. Após a aquisição, as imagens devem primeiro ser avaliadas quanto a critérios de exclusão para garantir uma análise ideal e resultados confiáveis. Esses critérios de exclusão, delineados na Figura 1B, incluem descolamento de retina, hemorragia e catarata. Como pode ser observado nas imagens de fundo de olho e OCT de exemplo, essas patologias impedem imagens claras de OCT, tornando as retinas inadequadas para análise de dados. Além disso, é possível que algumas retinas não contenham oclusões estáveis; essas imagens não modelam com precisão o dano isquêmico-hipóxico e devem ser excluídas da análise.
A quebra da barreira sangue-retina contribui para a patogênese do RVO14,15. Avaliar a quantidade de vazamento dos vasos é um indicador útil da permeabilidade dos vasos induzida por lesões. A imagem de AF permite a visualização desse vazamento, mas uma série de fatores, como diferenças na taxa de circulação, afetam a intensidade bruta das imagens de AF e fazem quantificação consistente16,17. Nosso método controla essa variabilidade normalizando a intensidade observada na retina para a intensidade média da vasculatura maior. Isso fornece uma proporção de vazamento para cada imagem da retina que pode ser comparada a outras e analisada. A Figura 2A demonstra as imagens mascaradas utilizadas para este cálculo, separando a vasculatura maior das demais áreas da retina. A capacidade de quantificar a fluoresceína permite a comparação da gravidade da lesão e da eficácia do tratamento, bem como o estudo das mudanças no vazamento ao longo do curso do tempo de lesão (Figura 2B), o que pode ser um efeito muito sutil para ser demonstrado apenas com relato qualitativo.
A imagem OCT permite a análise do impacto do RVO nas camadas individuais da retina e na espessura geral da retina. A Figura 3A mostra um delineamento das camadas da retina em uma imagem OCT. O rastreamento dos limites de cada camada (Figura 3B) permite várias vias de análise. A quantificação da espessura para cada camada retiniana mostra-se útil, pois a resposta edematosa inicial tem um efeito mais profundo sobre as camadas internas da retina. Os vestígios também permitem o estudo da espessura total da retina e a análise segregada das camadas interna versus externa da retina. A Figura 3C fornece uma análise de um curso temporal do dano do RVO, onde o inchaço inflamatório inicial das camadas da retina e o eventual afinamento degenerativo podem ser observados. Plotar a espessura de cada camada ao longo do tempo revela dinâmicas diferentes para as camadas plexiformes internas e nucleares internas, onde a camada nuclear interna experimenta uma resposta muito maior à lesão inicial, mas a camada plexiforme interna demonstra afinamento mais grave após o edema inicial ter sido estabilizado e retornar à linha de base (Figura 3D ). Isso garante uma compreensão mais precisa dos impulsionadores da resposta em diferentes pontos de tempo. Também testamos a eficácia de um inibidor da caspase na mitigação do inchaço e na proteção contra eventual degeneração, com a análise revelando efeitos diferentes em camadas individuais.
A desorganização das camadas internas da retina (DRIL) é outra característica da OCT utilizada como medida diagnóstica de isquemia na retinopatia diabética, bem como medida preditiva da acuidade visual no RVO18,19. Na imagem OCT, o DRIL se manifesta como um desaparecimento do limite superior da camada plexiforme externa12, misturando as camadas nuclear externa-plexiforme e interna (Figura 4A). A Figura 4B mostra dois exemplos de imagens OCT com áreas destacadas de DRIL. Expressamos DRIL como uma proporção do comprimento total da retina, com média em quatro seções transversais da OCT. Essa medida permite comparar quantitativamente grupos experimentais; A Figura 4C apresenta um exemplo de análise, onde a desorganização retiniana de dois grupos experimentais foi comparada para investigar a eficácia de um inibidor na mitigação do dano retiniano na RVO.
Figura 1: Imagens obtidas a partir de angiografia fluoresceína (AF) e tomografia de coerência óptica (OCT). (A) Exemplos de imagens de AF e OCT de retinas 24 h pós-RVO e controles não lesionados. (B) Exames de fundo de olho e OCT dos diferentes critérios de exclusão: descolamento excessivo de retina, hemorragia, catarata corneana e ausência de oclusões. A distância de aquisição da OCT é indicada pela diretriz verde. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Quantificação do vazamento de fluoresceína. (A) Separação da imagem de AF nos vasos e fundo para análise (B) Quantificação de vazamento de fluoresceína a partir de olhos de camundongos C57BL/6J ocluídos com veia retiniana (RVO) recebendo 10 mg de colírios inibidores Pen1-XBir3 (N = 17) ou colírios de veículo Pen1-Saline (N = 13) às 24 h e 48 h após o procedimento. A leitura de intensidade da imagem de fundo é normalizada para a leitura de intensidade média da imagem do vaso. A média da leitura da intensidade para camundongos RVO é ainda normalizada para controles não lesionados. As barras de erro mostram a média com o SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação da espessura da camada retiniana em imagens OCT. (A) Retina não lesada com as camadas individuais da retina marcadas: Camada de Células Gânglias, Camada Plexiforme Interna, Camada Nuclear Interna, Camada Plexiforme Externa, Camada Fotorreceptora, PSE e Coroide. (B) Exemplo de vestígios de camada de imagens OCT retiradas de ratinhos de controlo não feridos e 24 horas pós-RVO C57/BL6. (C) Quantificação da alteração na espessura total da retina e na espessura intrarretiniana observada na TCO de retinas de camundongos C57BL/6J às 4 h, 24 h, 48 h, 72 h e 8 dias pós-RVO. (D) Quantificação da alteração da espessura nas camadas plexiformes internas e nucleares internas das retinas de camundongos C57BL/6J às 24 h, 48 h e 8 dias pós-RVO para camundongos C57BL/6J que receberam 10 mg de colírios inibidores Pen1-XBir3 (N = 14) ou colírios para veículos Pen1-Saline (N = 15) imediatamente após o procedimento RVO e 24 horas pós-RVO. As barras de erro mostram a média com o SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação da desorganização das camadas internas da retina (DRIL) observada nas imagens OCT pós-RVO. Nas imagens OCT, o DRIL é indicado pela perda de uma delimitação clara entre as camadas nuclear interna e plexiforme externa. (A) Exemplos de secções da retina com e sem DRIL em imagens OCT. (B) Áreas de DRIL em imagens OCT de duas regiões em um camundongo C57BL/6J 24 h pós-RVO, indicadas por linhas brancas. DRIL é medido horizontalmente em toda a imagem, em vez de seguir a forma da retina. (C) Quantificação da proporção do comprimento da retina em que a DRIL foi observada às 24 h e 48 h pós-RVO para os olhos de camundongos C57BL/6J que receberam 2,5 mg de colírios inibidores da Pen1-XBir3 (N = 19) ou colírios para veículos Pen1-Saline (N = 21) após o procedimento de RVO. As barras de erro mostram a média com o SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A imagem não invasiva da retina de roedores apresenta uma via para estudar a patologia e desenvolver intervenções. Estudos prévios desenvolveram e otimizaram um modelo de RVO em camundongos, limitando a variabilidade e permitindo a tradução confiável de patologias clínicas comuns na retina murina 5,7,13. Os desenvolvimentos na tecnologia de imagem oftálmica permitem ainda o uso de técnicas clínicas de imagem in vivo, como AF e OCT, em animais experimentais, garantindo a capacidade de comparar modelos de camundongos com perfis de doenças humanas 6,12,15. No entanto, para maximizar as informações que podem ser extraídas dessas imagens e o potencial translacional geral do modelo, há uma necessidade de métodos quantitativos padronizados, reprodutíveis e rigorosos para a análise de imagens. Aqui apresentamos métodos de análise que permitem representações quantitativas da gravidade do dano, permitindo comparações mais precisas e confiáveis entre camundongos e entre grupos experimentais. Essas análises incluem quantificação de vazamento em imagens de AF, quantificação da espessura média da camada e áreas de DRIL em imagens OCT.
Um fator crítico para uma análise bem-sucedida está na qualidade das imagens adquiridas. Imagens OCT mal resolvidas podem levar à dificuldade de rastrear camadas individuais e à incapacidade de distinguir a desorganização interna da retina da má qualidade da imagem. Ao fazer a imagem, é importante tomar cuidado no posicionamento do mouse na plataforma, garantindo que a imagem do fundo esteja em foco, o nervo óptico esteja relativamente centrado e a seção transversal da retina seja horizontal em toda a imagem. A lubrificação consistente dos olhos enquanto o animal está anestesiado também é importante, especialmente quando o mesmo animal é fotografado vários dias. A lubrificação insuficiente pode resultar em catarata da córnea, o que obscurecerá a retina e a tornará inadequada para exames de imagem. Várias patologias da retina podem ocorrer na imagem RVO, tornando as imagens inadequadas para análise. Estes incluem descolamento excessivo de retina e hemorragia excessiva, que, juntamente com comprometer muito a qualidade da imagem, também representam um grau de dano que é muito grave para ser usado como um modelo de RVO. Além disso, é possível que todos os vasos ocluídos se recuperem completamente logo após a lesão, o que não modelará com precisão os danos do RVO e deve ser usado como critério de exclusão. No entanto, é importante notar que as oclusões bem-sucedidas se resolverão naturalmente por 48-72 h após a lesão, e a presença de oclusões como critério de exclusão é melhor usada em ou antes de 24 h após o procedimento. Colón Ortiz et al.13 detalham as melhores práticas para limitar a variabilidade e calibrar a lesão em um modelo otimizado para o procedimento de RVO. A identificação e o julgamento dos critérios de exclusão também são um passo crítico para a análise de imagens. Como isso depende em grande parte da discrição do avaliador, é importante que os avaliadores estejam cegos para os grupos de tratamento e pratiquem a consistência no julgamento da gravidade da patologia. Existem algumas limitações na aplicação desses métodos, particularmente na prática de imagem do mesmo camundongo em vários pontos de tempo. Há um limite para a frequência com que um rato pode ser anestesiado para exames de imagem, necessitando do teste e ajuste de pontos de tempo para determinar o curso de tempo ideal. Nossos estudos empregam pontos de tempo de imagem em 4 h, 24 h, 48 h e 8 dias, que encontramos estágios de captura de lesão inicial, resposta inflamatória aguda e lesão de longo prazo12. Além disso, certas cepas de camundongos são mais propensas ao desenvolvimento de cataratas corneanas, que incluem vários modelos de camundongos diabéticos, o que pode levar a um grande número de exclusões ou ciclos temporais incompletos20,21. Estudos utilizando essas linhagens de camundongos podem precisar adaptar o tamanho do grupo experimental ou os pontos de tempo de imagem, dependendo da sensibilidade da córnea.
A angiografia com fluoresceína tem sido amplamente utilizada qualitativamente para observar e classificar patologias da retina, como vazamento, bem como padrões de fluxo sanguíneo alterado RVO6. Recentemente, tem havido esforços para desenvolver uma análise quantitativa da AF em modelos animais, como cálculo de área vascular e tortuosidade16 e análise de regressão linear da temporalidade da intensidade da imagem17. A segmentação dos principais vasos a partir do fundo de fundo já foi utilizada anteriormente, mas em uma análise de pixels da dinâmica de preenchimento e decaimento, atestando a variabilidade na intensidade da imagem em diferentes camundongos17. Além disso, o potencial de viés foi observado na interpretação do pooling de fluoresceína17. O método quantitativo aqui discutido tem como alvo o extravasamento de fluoresceína da vasculatura retiniana maior, indicativo da quebra do BRB, que tem demonstrado desempenhar um papel na lesão do RVO11,12,14. Uma análise alternativa de vazamento quantifica o vazamento de corante em montagens planas da retina22. No entanto, análises post-mortem invasivas são menos adequadas para estudos da linha do tempo da lesão por RVO em um único camundongo, onde o vazamento é estudado em vários pontos de tempo. Análises da área de extravasamento de fluoresceína em diferentes estágios da doença retiniana já foram utilizadas em estudos clínicos e correlacionadas com outras patologias da doença observadas23. Este método permite alavancagem semelhante de imagens de AF para estudar o vazamento de vasos in vivo, permitindo o estudo da dinâmica de vazamento dentro da linha do tempo da lesão por RVO. Como a seleção da área de vazamento depende da seleção do avaliador de uma região, ela potencialmente introduz uma maior quantidade de variabilidade via subjetividade. Além disso, uma vez que os estudos do modelo de lesão RVO discutidos aqui investigam o vazamento em toda a retina, optamos por usar uma técnica de mascaramento para o cálculo. Este método de fuga reflete uma faceta diferente do dano RVO daqueles revelados pela análise de rastreamento de camada DRIL e OCT, e a correlação com essas medidas permite a criação de um perfil de doença mais preciso.
Apresentamos dois métodos para a avaliação de imagens OCT. A inflamação aguda e a subsequente degeneração das camadas retinianas são características da lesão do RVO 6,12. A metodologia de rastreamento de camadas OCT detalhada aqui permite o estudo preciso de camadas individuais e revela efeitos mais sutis e diferenças na dinâmica em diferentes regiões da retina. Esta técnica de análise baseia-se em outros protocolos comumente usados para a quantificação da espessura da camada retiniana em imagens OCT. Esse método aborda a variação entre protocolos na área utilizada para estimar a espessura da camada, bem como o número de medidas realizadas na imagem11. Como o afinamento não é uniforme dentro de cada camada da retina, é improvável que os métodos que usam menos medições pontuais forneçam uma imagem completa dos efeitos da lesão. A metanálise de múltiplas estratégias de mensuração da espessura da camada retiniana relatou que os protocolos médios em áreas maiores da imagem OCT mostraram maior correlação com a gravidade da doença, bem como maior repetibilidade11. Ao calcular a média de toda a imagem, esse método captura uma representação mais precisa do afinamento da retina presente na lesão por RVO a longo prazo. Os estudos também diferem em termos do local onde as imagens OCT são tiradas - muitos estudos centram a imagem no nervo óptico. Por outro lado, o método apresentado centra-se em relação às oclusões. Um desenvolvimento recente na análise de imagens de OCT humanas é o uso de algoritmos de aprendizado de máquina para classificar e quantificar recursos24. Tais análises podem ser uma direção futura promissora para a análise de imagens da retina animal.
Além disso, apresentamos uma tradução do DRIL, uma medida clínica de isquemia capilar, em um modelo de roedores. Em humanos, o DRIL tem sido considerado um preditor de perda de acuidade visual e diferenças de espessura da retina e demonstrou alta sensibilidade diagnóstica e especificidade18,19. A quantificação do DRIL em camundongos medindo a proporção da retina desorganizada mostrou correlação com a fração de veias ocluídas, amplitude da onda ERG b aos 7 dias pós-RVO e afinamento da retina aos 8 dias pós-RVO12. Uma alternativa à medição da DRIL é o uso de HYPOX-4 para medir a hipóxia da retina e o dano isquêmico. HYPOX-4 une cloridrato de anime de pimonidazol, um marcador de hipóxia, com uma sonda fluorescente para detectar hipóxia retiniana25. A maioria dos protocolos que utilizam HYPOX-4 é invasiva e requer análise de montagem plana da retina, o que pode ser menos adequado para a construção de cronogramas de lesão, embora um protocolo de imagem in vivo usando uma sonda HYPOX-4 tenha sido recentemente testado25. A análise DRIL também é útil como uma leitura rápida do dano à retina, pois as medições únicas em cada imagem OCT são mais eficientes em termos de tempo do que análises como o rastreamento da camada da retina. No entanto, deve-se notar que essas medidas não são intercambiáveis e revelam diferentes patologias da retina. Em vez disso, eles devem ser usados em conjunto, onde o DRIL pode ser usado como uma leitura inicial para o tamanho do efeito ou a eficácia da intervenção, e o rastreamento de camadas pode ser subsequentemente empregado para uma análise completa dos efeitos mais sutis nas camadas da retina.
Esses métodos são de natureza ortogonal, o que permite a criação de um perfil de doença para cada sujeito experimental. Como as patologias relatadas por cada um desses métodos são distintas, não é garantido que elas sejam dimensionadas proporcionalmente, e a obtenção de um quadro mais holístico da patologia permitirá uma investigação mais rigorosa das diferentes configurações de manifestação do dano RVO. A capacidade de maximizar a quantidade de informação que pode ser extraída da imagem de cada animal experimental reduzirá o número de animais necessários para tirar conclusões significativas, aumentando a eficiência do processo experimental. A aplicação desses métodos em protocolos RVO recentemente refinados permite maior reprodutibilidade e estudo da tradução de fenótipos clínicos em modelos animais. Além do estudo de modelos de RVO, o uso desses métodos tem aplicações para outros modelos de doenças da retina que empregam imagens de AF e OCT. Exemplos desses modelos de camundongos incluem aqueles para edema macular relacionado à idade (DMRI)26, edema macular diabético (EMD)23, neovascularização da coroide (NVC)27, uveorretinite autoimune experimental (EAU)28 e retinopatia da prematuridade (ROP)15. Esses métodos podem ainda ser generalizados para estudos usando imagens de AF e OCT no estudo de modelos dessas doenças em outras espécies. Essas quantificações também são sensíveis a mudanças mais sutis no mecanismo da doença, tornando-as úteis na avaliação da eficácia do tratamento, como na Figura 3D e na Figura 4C. A utilidade também se estende ao uso de imagens em testes de toxicidade em estudos de tolerabilidade de compostos de drogas. A padronização e a reprodutibilidade desses protocolos de análise podem servir para melhorar a validade translacional de modelos animais e ampliar nossa compreensão da patogênese e fisiopatologia da doença retinovascular.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela bolsa do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (para CKCO), o National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (para AMP), o Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (RO1 NS081333, R03 NS099920 para CMT) e o Departamento de Defesa Exército / Força Aérea (DURIP para CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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