Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering og kvantificering af endogene intraorganelle proteininteraktioner på ER-mitokondriekontaktsteder ved nærhedsligeringsassays

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/64750
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2
1Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay, 2Inserm U1280, 3Imagerie-Gif, Light Microscopy Facility, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay

Summary

Behovet for nye tilgange til at studere membrankontaktsteder (MCS'er) er vokset på grund af stigende interesse for at studere disse cellulære strukturer og deres komponenter. Her præsenterer vi en protokol, der integrerer tidligere tilgængelige mikroskopiteknologier til at identificere og kvantificere intraorganelle og interorganelle proteinkomplekser, der befinder sig ved MCS'er.

Abstract

Membrankontaktsteder (MCS'er) er områder med tæt membrannærhed, der tillader og regulerer den dynamiske udveksling af forskellige biomolekyler (dvs. calcium og lipider) mellem de sidestillede organeller uden at involvere membranfusion. MCS'er er afgørende for cellulær homeostase, og deres funktioner sikres af de residente komponenter, som ofte eksisterer som multimere proteinkomplekser. MCS'er involverer ofte det endoplasmatiske retikulum (ER), et vigtigt sted for lipidsyntese og cellulær calciumlagring, og er især vigtige for organeller, såsom mitokondrierne, som er udelukket fra de klassiske vesikulære transportveje. I de sidste år er MCS'er mellem ER og mitokondrier blevet grundigt undersøgt, da deres funktioner stærkt påvirker cellulær metabolisme / bioenergetik. Flere proteiner er begyndt at blive identificeret på disse kontaktsteder, herunder membranbånd, calciumkanaler og lipidoverførselsproteiner, hvilket øger behovet for nye metoder og tekniske tilgange til at studere disse MCS-komponenter. Her beskriver vi en protokol bestående af kombinerede tekniske tilgange, der inkluderer nærhedsligeringsanalyse (PLA), mitokondriefarvning og 3D-billeddannelsessegmentering, der tillader påvisning af proteiner, der er fysisk tæt (>40 nm) på hinanden, og som befinder sig på den samme membran ved ER-mitokondrier MCS'er. For eksempel brugte vi to ER-forankrede lipidoverførselsproteiner, ORP5 og ORP8, som tidligere har vist sig at interagere og lokalisere ved ER-mitokondrier og ER-plasmamembran-MCS'er. Ved at forbinde ORP5-ORP8 PLA med cellebilleddannelsessoftwareanalyse var det muligt at estimere afstanden til ORP5-ORP8-komplekset fra mitokondrieoverfladen og bestemme, at ca. 50% af ORP5-ORP8 PLA-interaktion forekommer på ER-underdomæner i nærheden af mitokondrier.

Introduction

Interorganel kommunikation er et definerende kendetegn ved eukaryote celler. En måde, hvorpå organeller kommunikerer, er ved at danne membrankontaktsteder (MCS'er), som er tætte membranmodsætninger mellem to organeller, der opretholdes af strukturelle og funktionelle proteiner, såsom tethers, lipidoverførselsproteiner og calciumkanaler1. MCS'er kan etableres mellem lignende eller forskellige organeller, og de formidler udvekslingen af cellulære komponenter, hvilket er vigtigt for at opretholde cellulær homeostase. Til dato er flere MCS'er blevet identificeret, herunder endoplasmatisk retikulum (ER)-mitokondrier, ER-plasmamembran (PM) og ER-lipiddråbe (LD) kontakter1. Blandt dem er de, der dannes mellem ER og mitokondrier (MERCS'er), blandt de mest undersøgte, da de er involveret i reguleringen af flere cellulære funktioner, herunder lipid- og calciumhomeostase2. Da mitokondrier stort set er udelukket fra de klassiske vesikulære transportveje, er de afhængige af MERCS og deres molekylære bestanddele til at importere vigtige lipider eller lipidprækursorer fra ER. Den ikke-vesikulære transport af disse lipider på tværs af MERCS'er sikrer opretholdelsen af korrekt mitokondriel lipidsammensætning samt deres funktionelle og strukturelle integritet3.

I betragtning af MCS'ernes afgørende involvering i forskellige cellulære funktioner er interessen for at give en dybere forståelse af deres molekylære komponenter steget kraftigt i de sidste år. Flere typer billedbehandlingsbaserede tilgange er blevet brugt til at fremme viden om MCS'er. Blandt dem er fluorescenssondebaseret nærhedsligationsassay (PLA) blevet anvendt i vid udstrækning som en indikator for overflod af MCS'er ved at detektere interorganelle protein-proteininteraktioner (i et detektionsområde på 40 nm) ved endogene niveauer4. For eksempel er MERCS'er blevet visualiseret og kvantificeret ved hjælp af PLA mellem flere mitokondrier-ER-proteinpar, herunder VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 og PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Selvom denne teknologi er blevet brugt til at detektere og kvantificere interorganelle protein-proteininteraktioner, der er til stede ved MCS 5,7,9,10,11, kombinerede de fleste af undersøgelserne ikke PLA med organelfarvning. Derfor er der endnu ikke udviklet en kvantitativ metode, der muliggør måling af nærheden mellem PLA-interaktioner og associerede organeller. I tilfælde af ER-proteiner er deres interaktion inden for membranunderdomæner i kontakt med andre organeller således hidtil ikke blevet skelnet fra deres interaktion inden for det bredt distribuerede ER-netværk.

Her beskriver vi en protokol til påvisning af PLA-interaktioner mellem proteiner, der befinder sig i membranen i den samme organel og til at analysere deres nærhed til membranen i partnerorganellen ved MCS. Denne protokol blev udviklet baseret på to præmisser: 1) tidligere undersøgelser, der viser, at ER-lipidoverførselsproteinerne ORP5 og ORP8 under overekspressionsbetingelser samlokaliserer og interagerer ved ER-mitokondrier og ER-PM MCS'er 12,13,14,15, og at ORP5 lokaliserer ved ER-LD-kontakter 16,17; 2) eksisterende teknologier, herunder PLA, konfokal mikroskopi, organelmærkning og 3D-billedanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mitokondriefarvning og nærhedsligeringsanalyse (PLA)

  1. Plade 0,5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa-celler, opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 1% ikke-essentielle aminosyrer ved 37 °C med 5% CO2, i 13 mm glasdæksler i1,5 i 24-brøndsplader ved en fortynding, der tillader 75% -90% cellesammenløb på dagen for proceduren.
    BEMÆRK: Bemærk, at HeLa-celler kan underkastes yderligere behandlinger, såsom siRNA-behandling og / eller DNA-plasmidtransfektion, før mitokondriefarvning og PLA.
  2. Mitokondriel farvning
    1. Cellerne vaskes én gang i serumfrit medium, der er forvarmet til 37 °C. Cellerne inkuberes med forvarmet serumfrit medium i 10 minutter ved 37 °C med 5 % CO2.
    2. Forbered 1 μM rød mitokondriemarkør i forvarmet serumfrit medium.
    3. Cellerne inkuberes med 500 μL mitokondriemarkøropløsning i 30 minutter ved 37 °C med 5 % CO2. Under mitokondriemarkørbehandlingen og de følgende trin i protokollen skal du holde cellerne på dæksedler beskyttet mod lys så meget som muligt.
    4. Efter inkubationen vaskes cellerne 1x i forvarmet serumfrit medium og 2x i 1x fosfatbufret saltvand (PBS). Udfør dette trin så hurtigt som muligt, da lange vasketrin før fiksering kan påvirke mitokondriemorfologien.
    5. Fjern 1x PBS fra dæksedlerne, og fastgør cellerne ved at inkubere dem i frisklavet 4% PFA (i 1x PBS) i 30 minutter ved stuetemperatur (i mørke) under kemikaliehætten. Vask 3x i 2 minutter i 500 μL 1x PBS (ved hjælp af engangspipetter eller et vakuumsystem tilsluttet en pumpe).
    6. Fjern 1x PBS, og inkuber dæksedlerne med 500 μL 50mM NH4Cl i 15 minutter ved stuetemperatur (i mørke). Vask 1x i 2 min i 500 μL 1x PSB ved hjælp af et vakuumsystem.
    7. Vask 3x i 2 min i 500 μL blokerende buffer 1 (BB1, 1% BSA, 0,1% saponin i 1x PBS) til ORP5-ORP8 PLA eller blokerende buffer 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% normalt gedeserum, 0,1 saponin i 1x PBS) til ORP8-PTPIP51 PLA.
    8. Overfør dækslerne fra pladen med 24 brønde til et fugtighedskammer. Efter overførsel af dæksedlerne til kammeret tilsættes 100 μL BB (BB1 eller BB2 i henhold til de anvendte antistofpar) for at undgå tørhed.
      BEMÆRK: Et fugtighedskammer, der er beskyttet mod lys, kan nemt og hurtigt opnås ved at pakke en petriskål (plast eller glas) ind i aluminiumsfolie og tilføje nogle stykker vådt køkkenrulle i periferien af petriskålen.
  3. Nærhedsligeringsanalyse (PLA)
    BEMÆRK: PLA-protokollen følger producentens anvisninger med små ændringer.
    1. Primær antistofinkubation
      1. Forbered den primære antistofarbejdsløsning. Fortynd kanin anti-ORP5 (1:150) plus mus anti-ORP8 (1:200) i BB1, mus anti-ORP8 (1:200) plus kanin anti-PTPIP51 (1:200) i BB2 og kanin anti-ORP5 (1:150) plus mus anti-PTPIP51 (1:200) i BB1. Forbered (mindst) 40 μL primær antistofopløsning pr. dæksel (f.eks. 0,27 μL kaninanti-ORP5, 0,2 μL anti-ORP8 med mus, 39,53 μL BB1).
      2. BB fjernes fra den forrige vask (trin 1.2.8) ved hjælp af et vakuumsystem, og der tilsættes 40 μL primær antistofopløsning til dæksedlerne. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i et fugtighedskammer beskyttet mod lys.
    2. Vask dæksler 3x i 5 minutter med 100 μL af den tilsvarende BB ved hjælp af vakuumsystemet.
    3. PLA-sondeinkubation
      1. Forbered PLA-sondernes arbejdsløsning. Fortynd kanin PLUS (1:5) og mus MINUS (1:5) PLA sonder i BB, og bland. For hver dækseddel fremstilles (mindst) 40 μL PLA-sondeopløsning (f.eks. 8 μL kanin PLUS PLA-sonde, 8 μL mus MINUS PLA-sonde, 24 μL BB). Lad PLA-sondeopløsningen sidde i 20 minutter ved stuetemperatur før brug.
      2. BB fjernes fra dæksedlerne (fra trin 1.3.2) ved hjælp af et vakuumsystem, og der tilsættes 40 μL PLA-sondeopløsning til dæksedlerne. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C i et fugtighedskammer, der er beskyttet mod lyset.
    4. Vask dækslerne 2x i 5 min i 100 μL 1x vaskebuffer A ved stuetemperatur.
    5. Ligatur
      1. Fortynd 5x ligeringsbuffer til 1:5 i ultrarent vand og bland. For hver dækseddel skal du forberede (mindst) 40 μL ligeringsopløsning (8 μL 5x ligeringsbuffer, 31 μL ultrarent vand).
      2. Ligasen (1 E/μL, der leveres i PLA-sættet) tilsættes til 1x ligeringsbuffer fremstillet i det foregående trin ved en fortynding på 1:40, og blandes.
      3. 1x vaskebuffer A fjernes fra dæksedlerne (fra trin 1.3.4) ved hjælp af et vakuumsystem, der tilsættes 40 μL ligaseopløsning til dæksedlerne, og der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C i et fugtighedskammer, der er beskyttet mod lyset.
    6. Vask dækslerne 2x i 2 min i 100 μL 1x vaskebuffer A ved stuetemperatur ved hjælp af vakuumsystemet.
    7. Polymerisering
      1. Fortynd 5x amplifikationsbuffer 1:5 i ultrarent vand, og bland. For hver dæksel skal du forberede (mindst) 40 μL amplifikationsopløsning (8 μL 5x amplifikationsbuffer, 31,5 μL ultrarent vand).
      2. Polymerasen (10 E / μL, der leveres i PLA-sættet) til 1x polymerisationsbufferen fremstillet i det foregående trin ved en fortynding på 1:80, og bland.
      3. 1x vaskebuffer A fjernes fra dæksedlerne (fra trin 1.3.6) ved hjælp af et vakuumsystem, der tilsættes 40 μL polymeraseopløsning til dæksedlerne, og der inkuberes i 1 time og 40 minutter ved 37 °C i et fugtighedskammer, der er beskyttet mod lyset.
    8. Fjern polymeraseopløsningen fra dæksedlerne, og vask 2x i 10 minutter i 100 μL 1x vaskebuffer B ved stuetemperatur i et fugtighedskammer, der er beskyttet mod lyset.
    9. Vask dækslerne 1x i 1 min i 100 μL 0,001x vaskebuffer B ved stuetemperatur i et fugtighedskammer beskyttet mod lyset.
    10. Monter dæksedlerne på glasglas til mikroskopi ved hjælp af monteringsmedium med DAPI (koncentration mellem 1,6-0,4 μg/ml). Forsegl med neglelak.

2. Optagelse af billede

  1. Overhold PLA-resultaterne, og tag billeder ved hjælp af fluorescenskonfokalmikroskopi med et 63x olienedsænkningsmål ved hjælp af den medfølgende software.
  2. Indstil fluorescensexcitationen ved hjælp af en 405 nm laserdiode eller en hvid lyslaser, og saml spektralvinduerne med GaAsP PMT'er eller hybriddetektorer. På hvert brændplan (spænder over 300 nm) erhverves fluorescenssignalerne for PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) og mitokondrier (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).

3. Billedbehandling og vurdering af PLA-pletter forbundet med mitokondrier

  1. Behandl de konfokale billeder ved hjælp af en software til billedanalyse, der genererer afstandskort mellem de cellulære komponenter. Følg nedenstående trin for at generere 3D-rekonstitutioner af PLA-pletter og mitokondrienetværket og for at få adgang til afstanden mellem dem ved hjælp af cellebilleddannelsessoftware (figur 1).
  2. Installation af 3D-afstandskortudvidelsen
    1. Installer både celleanalysesoftwarepakken med XT-indstillingen og MATLAB-softwaren eller kun en MATLAB-compiler runtime (MRC), som frit kan downloades fra hjemmesiden.
    2. Konfigurer celleanalysesoftwaren til at starte MATLAB, når en XTension startes på følgende måde: Fra indstillingen Imaris (Mac OS X) eller menuen Rediger (Windows) skal du vælge Indstillinger, skifte til panelet Brugerdefinerede værktøjer og derefter indstille stien:
      C: \ Program Files \ MATLAB \ R201Xa_x64 \ bin \ win64 \ MATLAB .exe til Windows eller / Programmer / MATLAB_R201Xa.app / bin / matlab til Mac OS X.
  3. Importer billederne til softwaren
    1. Konverter de konfokale stakbilleder til en . IMS-fil, enten direkte gennem Arena-sektionen eller ved hjælp af den enkeltstående File Converter , der tillader batchkonvertering.
    2. Efter importen skal du kontrollere, at billederne forbliver korrekt kalibreret. Klik på Rediger > billedegenskaber > billedgeometri, og kontroller, at voxelstørrelsen svarer i X og Y til den pixelstørrelse, der forventes for det faktiske billede (se billedkalibrering i anskaffelsessoftwaren), og at voxelstørrelsen i Z svarer til det trin, der anvendes af mikroskopet til at generere Z-stakken. Hvis værdierne ikke er korrekte, skal du ændre dem for at sikre en korrekt estimering af afstandene i følgende trin.
    3. Juster kontrasten mellem de forskellige kanaler i menuen Displayjustering ved at klikke på Rediger > Vis visningsjustering. Juster hver kanal uafhængigt for at optimere visningen af hver farve. Dette trin påvirker ikke direkte billedværdierne, men er vigtigt for at indstille præcise tærskler eller registrere svage objekter.
    4. Begræns analysen til en enkelt celle ved at beskære billedet ved hjælp af indstillingerne Rediger > Beskær 3D. Hvis du vil analysere en anden celle i samme synsfelt, skal du åbne det samme billede igen og beskære det forskelligt.
  4. ORP5-ORP8 spotdetektion
    1. Registrer de PLA-signaler, der genereres på stedet for ORP5- og ORP8-interaktion ved at klikke på indstillingen Tilføj nye pletter , som opretter et nyt sæt objekter og åbner guiden til spotdetektering.
    2. Vælg den kanal, som spotdetekteringen skal udføres på.
    3. Juster den estimerede XY-diameter (området skal tilpasses, hvis objektstørrelsen er forskellig) for at hjælpe spotdetekteringsalgoritmen med at finde de objekter, der er af interesse. Bemærk, at hvis den valgte værdi er for høj, smelter de nærliggende objekter sammen. Hvis værdien er for lille, kan et signal betragtes som flere objekter, eller afvigende signaler kan detekteres.
    4. Klik på Baggrundssubtraktion for at fjerne billedbaggrunden før spotdetektering for at forbedre den lokale kontrast omkring objekterne af interesse.
    5. Juster tærsklen for punktregistrering ved at bevare kvaliteten (intensiteten i objektets centrum) som tærskelparameter og softwarens automatiske tærskel, eller rediger denne værdi en smule for at registrere alle objekterne. Når spotregistreringen er færdig, skal du gemme registreringsparametrene og genbruge dem til at behandle andre billeder.
  5. Registrering af mitokondrienetværk
    1. Registrer mitokondrienetværket for at generere en overfladegengivelse ved at klikke på Tilføj nye overflader for at oprette et nyt objekt, og åbn guiden til overfladeregistrering.
    2. Vælg den kanal, som overfladeoprettelsen skal udføres på.
    3. Anvend et gaussisk filter for at opnå en glattere overflade ved at klikke på afkrydsningsfeltet Udjævn og ved at indstille en tærskel, der angiver de mindste detaljer, der kan observeres på overfladen.
    4. Udfør en baggrundssubtraktion for at forbedre de lokale kontraster og for at hjælpe med tærskeltrinnet.
    5. Juster tærsklen for at registrere mitokondrienetværket baseret på signalets intensitet. Hvis det er vanskeligt at indstille tærsklen korrekt, anbefales det at gå tilbage til det foregående trin for at justere graden af glathed og baggrundssubtraktion.
    6. Anvend om nødvendigt et filter på overfladen for at fjerne små rester, der stammer fra tærsklen. For at gøre dette skal du vælge filteret Antal Voxels i vinduet klassificere overflade og lege med de øvre og nedre tærskler for kun at beholde objekterne af interesse. Når overfladeoprettelsen er slut, skal du gemme oprettelsesparametrene og genbruge dem til at behandle andre billeder.
  6. Generering af 3D-afstandskortet omkring mitokondrierne
    1. Generer et afstandskort uden for mitokondrieoverfladen, der tidligere er oprettet som følger. Vælg mitokondriernes overflade i scenetræboksen. Klik på Billedbehandling > Overflader funktion > afstandstransformation. Dette kalder en Matlab XTension, der beder brugeren om at vælge, om kortet skal beregnes uden for eller inde i objektoverfladen.
    2. Vælg Udvendigt overfladeobjekt for at måle afstanden mellem PLA-pletterne og mitokondriernes overflade. Når afstandskortet er genereret, vises det som en ny kanal i displayjusteringspanelet. I denne kanal har hver pixel en værdi svarende til afstanden til de nærmeste mitokondrier.
  7. Udtræk af objekternes afstande fra nærmeste mitokondrier
    1. Hvis du vil måle afstanden fra hvert punkt til det nærmeste mitokondrie og identificere og visualisere de nærmeste, skal du markere de pletter, der tidligere er genereret i scenetræboksen.
    2. I statistikken og den detaljerede log skal du vælge Specifikke værdier (for at få en måling for hvert sted). Vælg Centerintensitet Ch=X (hvor X svarer til nummeret på afstandskortkanalen). Dette måler værdien af hvert spotcenter, hvilket svarer til dets afstand til nærmeste mitokondrie, på afstandskortet.
    3. Eksporter dataene som en .csv fil ved at klikke på disketteikonet nederst til venstre i vinduet.
    4. For at udtrække en delpopulation af pletter baseret på deres afstande til mitokondrier skal du vælge pletterne i scenetræet og klikke på fanen Filtre .
    5. I dette vindue skal du tilføje et nyt filter baseret igen på centerintensiteten Ch=X og udtrække pletterne mindre end 380 nm væk fra mitokondrier ved at indstille den nedre tærskel til 0 μm og den øvre tærskel til 0,380 μm.
      BEMÆRK: Tærsklen på 380 nm blev estimeret baseret på en PLA-reaktion, herunder sammenhængen mellem de primære og sekundære antistoffer (30 nm) plus halvdelen af den fulde bredde ved halv maksimum (FWHM) af PLA-forstærkningssignalerne (350 nm).
    6. Hvis du vil fokusere på de markerede punkter og f.eks. give dem en bestemt farve, skal du udføre et dubleringstrin ved at trykke på knappen Dubler markering til nye punkter .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor detekterede vi interaktionsstederne for to ER-forankrede lipidoverførselsproteiner, ORP5 og ORP8, og vurderede deres forekomst ved ER-membranunderdomæner i kontakt med andre organeller, især med mitokondrierne. Til det blev mitokondrienetværket i HeLa-celler farvet med en rød mitokondriemarkør, og ORP5-ORP8 PLA grønne pletter blev detekteret efter fiksering ved anvendelse af de primære antistoffer anti-ORP5 og anti-ORP8, hvis specificitet tidligere blev testet ved immunofluorescens15. Konfokale billeder viste, at endogene ORP5-ORP8 PLA-interaktioner i HeLa-cellerne forekom i den retikulære ER, kortikale ER og i ER-underdomæner i tæt kontakt med mitokondrier, almindeligvis omtalt som mitokondrieassocierede ER-membraner (MAM'er; Figur 2A). For at kvantificere ORP5-ORP8 PLA-interaktionerne, der forekommer ved MAM'er, blev afstanden mellem hvert PLA-sted og mitokondrier evalueret ved hjælp af 3D-billedanalyse. Ved hjælp af en afstandstærskel på 380 nm afslørede 3D-billeddannelsesanalyse, at ca. 50% af endogene ORP5-ORP8 PLA-interaktioner blev detekteret ved MAM'er (figur 2A, B). De øvrige 50% af interaktionerne blev fordelt mellem kortikal og retikulær ER15. For at validere specificiteten af PLA blev ORP5-ORP8 PLA-eksperimenter udført enten i celler behandlet med ORP5-målretning og ORP8-målretning siRNA'er (negativ kontrol) eller i celler, der co-overudtrykker ORP5 og ORP8 (positiv kontrol). ORP5 og ORP8 nedregulering inducerede et massivt fald i det samlede antal PLA-signaler (ved MAM'er, ved retikulær ER og ved kortikal ER; Figur 2A,C), mens deres co-overekspression resulterede i en stigning i PLA (figur 2A,C), hvilket bekræfter specificiteten af ORP5-ORP8 PLA. Det er imidlertid interessant, at procentdelen af ORP5-ORP8 PLA-interaktioner, der forekommer ved MAM'er i celler, der co-overudtrykker ORP5 og ORP8, svarede til den, der blev observeret i celler, hvor disse proteiner blev udtrykt på endogene niveauer (figur 2B), hvilket understøtter deres eksistens som et kompleks ved MAM'er. For yderligere at bekræfte tilstedeværelsen af ORP5 og ORP8 på ER-membranunderdomæner i tæt kontakt med mitokondrier blev der udført yderligere kvantitative PLA-analyser mellem ORP5 eller ORP8 og det ydre mitokondriemembranprotein PTPIP51, en kendt bindingspartner for ORP5 og ORP813. PLA-signaler blev detekteret i både ORP5-PTPIP51- og ORP8-PTPIP51-par, og deres gennemsnitlige antal lignede ORP5-ORP8 PLA-parret, hvilket bekræftede ORP5- og ORP8-lokalisering ved ER-mitokondrier MCS'er (figur 3).

Endelig var vi i nylige værker fra vores laboratorium ved at bruge en lignende tilgang i HeLa-celler transfekteret med PHPLCd-RFP eller mcherry-PLN1 for at markere henholdsvis PM eller LD i stand til at analysere forekomsten af ORP5-ORP8 PLA-interaktioner ved ER-PM-kontakter og identificere et trevejs kontaktsted mellem mitokondrier, ER og LD'er (figur 4)15, 17.

Figure 1
Figur 1: Workflow til identifikation af PLA-signaler i nærheden af mitokondrierne. For det første segmenteres de konfokale stakke for at identificere PLA-foci (pletter) og mitokondrienetværket (overflader). Derefter beregnes 3D-afstandskort mod ydersiden af overfladerne (mitokondrier), hvilket gør det muligt at måle afstanden for hvert sted fra det nærmeste mitokondrie. Endelig klassificeres PLA-pletter i to populationer (rød og grøn) baseret på en nærhedstærskel på 380 nm etableret baseret på detektionssystemets præcision. Dette tal er ændret fraMonteiro-Cardoso et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder af ORP5-ORP8-komplekset udtrykt på endogene niveauer lokaliseret ved ER-mitokondriekontakter. (A) ORP5-ORP8 PLA konfokale serier og respektive 3D-rekonstitutioner. Skalabjælker: 10 μm og 2 μm (udvidede billeder). B) Kvantificering af ORP5-ORP8 PLA-foci i tæt kontakt med mitokondrier. Endo, n = 33 celler og Overexp ORP5 + ORP8, n = 27 celler. Data præsenteres som middelværdien ± SEM (standardfejl i middelværdien). Dette billede er blevet ændret fra Monteiro-Cardoso et al.15. (C) Kvantificering af de samlede ORP5-ORP8 PLA-foci. Endo, n = 38 celler, siORP5 + siORP8, n = 38 celler og Overexp ORP5 + ORP8, n = 35 celler. Data præsenteres som middelværdien ± SEM (standardfejl i middelværdien). Dette billede er blevet ændret fra Monteiro-Cardoso et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative billeder af PLA-signaler mellem ORP5 eller ORP8 med mitokondrieproteinet PTPIP51. (A) Konfokale serier blev brugt til at generere 3D-rekonstitutioner og afstandskort for at bekræfte, at ORPR5- eller ORP8 PLA-interaktioner med PTPIP51 forekommer ved ER-mitokondrier nære kontakter. Skalabjælker: 10 μm og 2 μm (udvidede billeder). (B) PTPIP51 immunofluorescenskonfokale billeder (enkelt fokalplan) i kontrol og HeLa-celler behandlet med siRNA rettet mod PTPIP51. Skalabjælker: 10 μm og 2 μm (udvidede billeder). (C) ORP5-PTPIP51 og ORP8-PTPIP51 PLA konfokale billeder i kontrol og HeLa-celler behandlet med siRNA målretning PTPIP51. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Eksempler på 3D-rekonstruktioner, der bruges til at lokalisere ORP5-ORP8 PLA-komplekset ved ER-PM- og ER-mitokondrier-LD-kontakter. (A) Konfokalbillede og respektive 3D-rekonstitution af en HeLa-celle med ORP5-ORP8 PLA, repræsenteret af de grønne pletter, PM markeret med PHPLCd-RFP, repræsenteret af den røde celle, og mitokondrier markeret med Mito-BFP, repræsenteret af blå overflader. Venstre og midterste billeder: repræsentation af hele HeLa-cellen. Højre billede: repræsentation af et zoomet område inde i cellen. (B) Konfokalbillede og respektive 3D-rekonstitution af et zoomet område af en HeLa-celle med ORP5-ORP8 PLA, repræsenteret af de grønne pletter, LD'er markeret med mCherry-PLN1, repræsenteret af de røde overflader, og Mito-BFP, repræsenteret af de blå overflader. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol blev designet til at identificere og kvantificere interorganelle protein PLA-interaktioner ved MCS'er, især ved MERCS'er. Nyheden ved protokollen er, at den kombinerer PLA med mærkning af flere organeller, konfokal mikroskopi og 3D-billedanalyse for at lokalisere og kvantificere PLA-interaktioner mellem to proteiner, der er bosiddende i samme membran, i dette tilfælde inden for ER-membranen i nærheden af mitokondrimembranen (MAM) eller med MAM og LD'erne samtidigt. Denne protokol kan bruges som et værktøj til at validere proteiner, der potentielt lokaliseres ved specifikke MERCS'er, men også ved andre MCS'er.

Siden udviklingen i 2006 har PLA mellem en ER og et mitokondrieprotein været meget brugt til at kvantificere MERCS'er 7,9,10,11. Imidlertid skal brugen af PLA som indikator for MERCS-overflod i celler omhyggeligt verificeres ved hjælp af højopløsningsmetoder. For eksempel ændrer ablationen af SAM50, et mitokondrieprotein, der ikke påvirker mængden af MERCS'er (som kvantificeret ved elektronmikroskopi)15, heller ikke PLA-interaktioner mellem ER-proteinet ORP8 og mitokondrieproteinet TOM20, men det reducerer PLA-interaktioner mellem ORP8 og mitokondrieproteinet Metaxin2 uden at reducere deres ekspressionsniveauer15. Disse resultater afspejler, at PLA-interaktioner kan være specifikke for det proteinpar, der anvendes i analysen, og kan ikke bruges som den eneste parameter til at vurdere forekomsten af MERCS.

Ikke desto mindre er PLA en dokumenteret følsom tilgang til at detektere in situ endogene proteininteraktioner. I modsætning til andre fluorescerende sondebaserede detektionsmetoder, herunder split-GFP og FRET, eller billeddannelsesmetoder med høj opløsning, kræver PLA ikke overekspression af mærkede proteiner, idet man undgår iboende eksperimentelle artefakter, såsom ændring af de fysiske egenskaber af de målrettede organeller15. Påvisning af proteininteraktioner ved PLA giver også fordele i forhold til andre immundetektionsmetoder, såsom co-immunudfældning med western blot. Mens PLA tillader kvantificering af enkelte fluorescenspletter på enkeltcelleniveau, kræver coimmunudfældning en stor mængde biologisk materiale og tillader kun relativ kvantificering af proteinet ekstraheret fra en pulje af heterogene celler, for hvilke en passende belastningskontrol er vanskelig at opnå15. Den yderligere fordel ved brugen af PLA kombineret med organelfarvning og konfokal mikroskopi over co-immunudfældning er, at den første tilgang tillader lokalisering af proteininteraktioner på subcellulært niveau.

På den anden side er de fremtrædende ulemper ved denne protokol forbundet med PLA-detektionsområdet på ca. 40 nm, hvilket er større end MERCS'er, og med den maksimale opløsning opnået ved konfokalmikroskopi på ca. 250 nm, hvilket gør det vanskeligt at utvetydigt identificere kontaktsteder. Her blev der imidlertid anvendt en tærskel på 380 nm til at estimere PLA-pletterne forbundet med mitokondrieoverflader baseret på størrelsen af PLA-reaktionen, herunder foreningen af de primære og sekundære antistoffer (30 nm) plus halvdelen af FWHM af PLA-forstærkningssignalerne (350 nm). En anden begrænsning af PLA er relateret til det faktum, at det kun kan bruges i faste prøver, og erhvervelsen af et tydeligt, specifikt og kvantificerbart PLA-signal kræver tilgængeligheden af antistoffer, der er meget specifikke for proteinet af interesse15. Derudover kræver 3D-billedanalysen til afstandsestimering specifik software, der muligvis ikke er let tilgængelig i alle laboratorier.

Især kan nogle af de ovennævnte ulemper løses ved hjælp af nyligt tilgængelige teknologier. For eksempel kan konventionel konfokal mikroskopi erstattes af billeddannelsesteknikker på et højere opløsningsniveau, såsom Airyscan eller struktureret oplyst mikroskopi (SIM)17, og manglen på gode primære antistoffer mod de interessante proteiner kan overvindes ved stabilt at mærke endogene proteiner ved hjælp af CRISPR-Cas9-teknologien18. Endelig kan kvaliteten og specificiteten af antistofferne og PLA-signalerne verificeres ved hjælp af følgende kontroller: 1) test af de primære antistoffer ved immunofluorescens og western blot i kontrolceller og i celler, hvor proteinet af interesse er blevet udtømt eller overudtrykt; 2) udførelse af PLA i celler, hvor et eller begge proteiner af interesse er blevet udtømt; 3) udførelse af PLA i celler, der co-overudtrykker proteinerne af interesse; 4) udførelse af PLA, mens begge antistoffer udelades for de relevante proteiner; 5) udførelse af PLA ved kun at bruge et af de to antistoffer til de interessante proteiner; 6) udfører PLA med inkubation med samme IgG som den art, hvorfra de primære antistoffer blev genereret. For at vurdere deres specificitet blev antistofferne anvendt i denne protokol testet ved immunofluorescens og western blot i kontrolceller og i celler, der blev behandlet med siRNA rettet mod ORP5 15, ORP8 15 eller PTPIP51 (figur 3B og Guyard et al.17). Desuden er anti-ORP5- og anti-ORP8-specificiteten blevet vurderet i celler, der udtrykker EGFP-mærket ORP5 eller ORP8 ved at evaluere Pearsons koefficient mellem antistofdetektionssignalet og EGFP-signalet15. Specificiteterne af anti-ORP5 15, anti-ORP8 15 og anti-PTPIP51 (figur 1 og figur 3C) antistoffer blev yderligere analyseret i celler, hvor disse proteiner var udtømt, hvilket førte til et fald i PLA-signaler. Bemærk, at antistofkoncentrationen, der er egnet til immunofluorescensfarvning, normalt også er egnet til PLA; Afhængigt af de anvendte antistoffer kan der dog foretages nogle justeringer i blokeringsopløsningen og / eller antistofkoncentrationerne for at forbedre PLA-farvningen. ORP5-ORP8 og ORP8-PTPIP51 PLA-farvningen blev forbedret efter justering af blokeringsopløsningen. For at opnå mitokondrie- og PLA-farvning af høj kvalitet er det vigtigt at opnå konfokale billeder af høj kvalitet med lave baggrundssignaler, hvilket er vigtigt for at lette 3D-modulering. For eksempel påvirker konfokale billeder med høje justeringer af baggrundspåvirkningstærsklen og påvirker følgelig nøjagtigheden af 3D-modulationen af mitokondrienetværket eller PLA.

Afslutningsvis muliggør protokollen, der præsenteres her, lokalisering og kvantificering af PLA-proteininteraktioner ved specifikke MERCS-underdomæner (interaktioner mellem proteiner lokaliseret i cis inden for den samme membran, der er involveret i MCS'er eller mellem proteiner lokaliseret i trans inden for de sidestillede membraner) ved hjælp af multicellulær organelmærkning og generering af afstandskort i 3D-rekonstruerede konfokale billeder. Selvom de procedurer, der er beskrevet her, er teknisk enkle og relativt hurtige sammenlignet med andre metoder til påvisning af proteininteraktioner ved MERCS'er, er de opnåede data meget reproducerbare. Desuden er denne protokol lige så alsidig som de antistoffer, der er tilgængelige for proteinerne af interesse, og som de markører, der er tilgængelige for at plette organellerne. Derfor kan den anvendes på en bred vifte af par proteiner og flere organeller og MCS'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir-programmet, Fondation pour la Recherche Medicale (nr. 206548) og Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP: 669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 / Morphoscope, ANR-10-INBS-04 / FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) Gibco 14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl) VWR 21236.291
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 Agar Scientific L46R13-15
CMXRos red MitoTracker Invitrogen M7512 red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-X Leica DMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates Merck CLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green  Sigma DUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI  Sigma DUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS  Sigma DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma DUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence  Sigma DUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement  Gibco 51985026 serum free medium
Imaris software v 9.3 Bitplane N/A cell imaging software
Incubator UINCU-line IL10 VWR 390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“)  Knittel Glass
mouse anti-ORP8  Santa Cruz 134409
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
rabbit anti-ORP5  Sigma HAP038712
Saponin Sigma 84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free Invitrogen 10977-035

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287 (2019).
  2. Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
  3. Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
  4. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  5. Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
  6. Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).
  7. Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
  8. Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).
  9. Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).
  10. Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
  11. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
  12. Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  13. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  14. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757 (2017).
  15. Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).
  16. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).
  17. Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 200 PLA 3D-billedanalyse lysmikroskopi membrankontaktsteder endoplasmatiske retikulum-mitokondriekontaktsteder proteininteraktion membrankontaktstedskomponenter
Visualisering og kvantificering af endogene intraorganelle proteininteraktioner på ER-mitokondriekontaktsteder ved nærhedsligeringsassays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monteiro-Cardoso, V. F., Le Bars,… More

Monteiro-Cardoso, V. F., Le Bars, R., Giordano, F. Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays. J. Vis. Exp. (200), e64750, doi:10.3791/64750 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter