Summary
Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Membran temas bölgeleri (MCS'ler), membran füzyonunu içermeden yan yana getirilmiş organeller arasında çeşitli biyomoleküllerin (yani kalsiyum ve lipitler) dinamik değişimine izin veren ve düzenleyen yakın membran yakınlığı alanlarıdır. MCS'ler hücresel homeostaz için gereklidir ve işlevleri, genellikle multimerik protein kompleksleri olarak bulunan yerleşik bileşenler tarafından sağlanır. MCS'ler genellikle lipid sentezi ve hücresel kalsiyum depolamanın önemli bir bölgesi olan endoplazmik retikulumu (ER) içerir ve klasik veziküler taşıma yollarından dışlanan mitokondri gibi organeller için özellikle önemlidir. Son yıllarda, ER ve mitokondri arasındaki MCS'ler, işlevleri hücresel metabolizmayı/biyoenerjetik değerleri güçlü bir şekilde etkilediği için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu temas bölgelerinde membran bağları, kalsiyum kanalları ve lipid transfer proteinleri dahil olmak üzere çeşitli proteinler tanımlanmaya başlanmıştır, bu nedenle bu MCS bileşenlerini incelemek için yeni metodolojilere ve teknik yaklaşımlara olan ihtiyacı artırmaktadır. Burada, birbirine fiziksel olarak yakın (>40 nm) olan ve ER-mitokondri MCS'lerinde aynı zarda bulunan proteinlerin saptanmasına izin veren, yakınlık ligasyon testi (PLA), mitokondri boyama ve 3D görüntüleme segmentasyonunu içeren birleşik teknik yaklaşımlardan oluşan bir protokolü açıklıyoruz. Örneğin, daha önce ER-mitokondri ve ER-plazma membranı MCS'lerinde etkileşime girdiği ve lokalize olduğu gösterilen iki ER'ye bağlı lipid transfer proteini, ORP5 ve ORP8 kullandık. ORP5-ORP8 PLA'yı hücre görüntüleme yazılımı analizi ile ilişkilendirerek, ORP5-ORP8 kompleksinin mitokondriyal yüzeyden uzaklığını tahmin etmek ve ORP5-ORP8 PLA etkileşiminin yaklaşık% 50'sinin mitokondriye yakın ER alt alanlarında meydana geldiğini belirlemek mümkün olmuştur.
Introduction
Organeller arası iletişim, ökaryotik hücrelerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Organellerin iletişim kurmasının bir yolu, bağlar, lipid transfer proteinleri ve kalsiyum kanalları gibi yapısal ve fonksiyonel proteinler tarafından korunan iki organel arasındaki yakın zar karşıtlıkları olan zar temas bölgeleri (MCS'ler) oluşturmaktır1. MCS'ler benzer veya farklı organeller arasında kurulabilir ve hücresel homeostazı korumak için önemli olan hücresel bileşenlerin değişimine aracılık ederler. Bugüne kadar, endoplazmik retikulum (ER)-mitokondri, ER-plazma membranı (PM) ve ER-lipid damlacık (LD) kontakları1 dahil olmak üzere çeşitli MCS tanımlanmıştır. Bunlar arasında, ER ve mitokondri (MERCS'ler) arasında oluşanlar, lipid ve kalsiyum homeostazı2 dahil olmak üzere çeşitli hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde rol oynadıkları için en çok çalışılanlar arasındadır. Mitokondri, klasik veziküler taşıma yollarından büyük ölçüde dışlandığından, ER'den anahtar lipitleri veya lipid öncüllerini ithal etmek için MERCS'ye ve moleküler bileşenlerine güvenirler. Bu lipitlerin MERCS'ler arasında veziküler olmayan taşınması, uygun mitokondriyal lipid bileşiminin yanı sıra fonksiyonel ve yapısal bütünlüklerinin korunmasını sağlar3.
MCS'lerin çeşitli hücresel fonksiyonlara önemli katılımı göz önüne alındığında, moleküler bileşenlerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına olan ilgi son yıllarda büyük ölçüde artmıştır. MCS'ler hakkındaki bilgileri ilerletmek için çeşitli görüntüleme tabanlı yaklaşımlar kullanılmıştır. Bunlar arasında, floresan prob tabanlı yakınlık ligasyon testi (PLA), endojen seviyelerdeorganeller arası protein-protein etkileşimlerini (40 nm'lik bir tespit aralığında) tespit ederek MCS'lerin bolluğunun bir göstergesi olarak yaygın olarak kullanılmıştır 4. Örneğin, MERCS'ler, VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 ve PTPIP51-VAPB 5,6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli mitokondri-ER protein çiftleri arasında PLA kullanılarak görselleştirildi ve ölçüldü. Bu teknoloji, MCS 5,7,9,10,11'de bulunan organeller arası protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılmış olsa da, çalışmaların çoğu PLA'yı organel boyama ile birleştirmemiştir. Sonuç olarak, PLA etkileşimleri ve ilişkili organeller arasındaki yakınlığın ölçülmesine izin veren nicel bir yöntem henüz geliştirilmemiştir. Bu nedenle, şimdiye kadar, ER proteinleri söz konusu olduğunda, diğer organellerle temas halinde olan zar alt alanları içindeki etkileşimleri, yaygın olarak dağılmış ER ağı içindeki etkileşimlerinden ayırt edilmemiştir.
Burada, aynı organelin zarında bulunan proteinler arasındaki PLA etkileşimlerini tespit etmek ve bunların MCS'deki ortak organelin zarına yakınlığını analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol iki öncül temelinde geliştirilmiştir: 1) aşırı ekspresyon koşullarında, ER lipid transfer proteinleri ORP5 ve ORP8'in ER-mitokondri ve ER-PM MCS'lerde 12,13,14,15 birlikte lokalize olduğunu ve etkileşime girdiğini ve ORP5'in ER-LD temaslarındalokalize olduğunu gösteren önceki çalışmalar 16,17; 2) PLA, konfokal mikroskopi, organel etiketleme ve 3D görüntüleme analizi dahil olmak üzere mevcut teknolojiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mitokondriyal boyama ve yakınlık ligasyon testi (PLA)
- Plaka 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa hücreleri, Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) %10 FBS, %1 penisilin / streptomisin ve %1 esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiş 37 ° C'de% 5 CO2 ile,% 75 -% 90 hücre birleşmesine izin veren bir seyreltmede1.5 içinde 24 oyuklu plakalarda, işlem gününde% 75-90 hücre birleşmesine izin veren bir seyreltmede.
NOT: HeLa hücreleri, mitokondriyal boyama ve PLA'dan önce siRNA tedavisi ve/veya DNA plazmit transfeksiyonu gibi ek tedavilere tabi tutulabilir. - Mitokondriyal boyama
- Hücreleri bir kez 37 °C'de önceden ısıtılmış serumsuz ortamda yıkayın. Hücreleri önceden ısıtılmış serumsuz besiyeri ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Önceden ısıtılmış serumsuz ortamda 1 μM kırmızı mitokondriyal işaretleyici hazırlayın.
- Hücreleri 500 μL mitokondriyal marker çözeltisi ile 37 ° C'de% 5 CO2 ile 30 dakika inkübe edin. Mitokondriyal belirteç tedavisi ve protokolün sonraki adımları sırasında, hücreleri mümkün olduğunca ışıktan koruyarak lameller üzerinde tutun.
- İnkübasyonun ardından, hücreleri önceden ısıtılmış serum serbest ortamda 1x ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2x yıkayın. Fiksasyondan önceki uzun yıkama adımları mitokondriyal morfolojiyi etkileyebileceğinden, bu adımı mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin.
- 1x PBS'yi lamellerden çıkarın ve hücreleri, kimyasal kaputun altında oda sıcaklığında (karanlıkta) 30 dakika boyunca taze hazırlanmış %4 PFA'da (1x PBS'de) inkübe ederek sabitleyin. 3x'i 500 μL 1x PBS'de 2 dakika yıkayın (tek kullanımlık pipetler veya pompaya bağlı bir vakum sistemi kullanarak).
- 1x PBS'yi çıkarın ve lamelleri 500 μL 50mM NH4Cl ile oda sıcaklığında (karanlıkta) 15 dakika inkübe edin. Bir vakum sistemi kullanarak 500 μL 1x PSB'de 1x'i 2 dakika boyunca yıkayın.
- ORP5-ORP8 PLA için 500 μL bloke edici tampon 1'de (BB1, %1 BSA, 1x PBS'de %0.1 saponin) veya ORP8-PTPIP51 PLA için bloke edici tampon 2'de (BB2, %2 BSA, %0.1 normal keçi serumu, 1x PBS'de 0.1 saponin) 3x'i 2 dakika yıkayın.
- Lamelleri 24 oyuklu plakadan bir nem odasına aktarın. Lamelleri hazneye aktardıktan sonra, kuruluğu önlemek için 100 μL BB (kullanılan antikor çiftlerine göre BB1 veya BB2) ekleyin.
NOT: Işıktan korunan bir nem odası, bir Petri kabını (plastik veya cam) alüminyum folyoya sararak ve Petri kabının çevresine birkaç parça ıslak kağıt havlu ekleyerek kolay ve hızlı bir şekilde elde edilebilir.
- Yakınlık ligasyon testi (PLA)
NOT: PLA protokolü, küçük değişikliklerle üreticinin talimatlarını takip eder.- Primer antikor inkübasyonu
- Birincil antikor çalışma solüsyonunu hazırlayın. BB1'de tavşan anti-ORP5 (1:150) artı fare anti-ORP8 (1:200), BB2'de fare anti-ORP8 (1:200) artı tavşan anti-PTPIP51 (1:200) ve BB1'de tavşan anti-ORP5 (1:150) artı fare anti-PTPIP51 (1:200) seyreltin. Lamel başına (en az) 40 μL primer antikor çözeltisi hazırlayın (ör., 0.27 μL tavşan anti-ORP5, 0.2 μL fare anti-ORP8, 39.53 μL BB1).
- BB'yi bir vakum sistemi kullanarak önceki yıkamadan (adım 1.2.8) çıkarın ve lamellere 40 μL primer antikor solüsyonu ekleyin. Işıktan korunan bir nem odasında oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Vakum sistemini kullanarak lamelleri 3x 5 dakika boyunca 100 μL karşılık gelen BB ile yıkayın.
- PLA prob inkübasyonu
- PLA probları çalışma çözümünü hazırlayın. Tavşan ARTI (1:5) ve fare EKSİ (1:5) PLA problarını BB'de seyreltin ve karıştırın. Her lamel için (en az) 40 μL PLA prob solüsyonu hazırlayın (örneğin, 8 μL tavşan ARTI PLA probu, 8 μL fare EKSİ PLA probu, 24 μL BB). Kullanmadan önce PLA prob solüsyonunun oda sıcaklığında 20 dakika bekletin.
- Bir vakum sistemi kullanarak BB'yi lamellerden çıkarın (adım 1.3.2'den itibaren) ve lamellere 40 μL PLA prob çözeltisi ekleyin. Işıktan korunan bir nem odasında 37°C'de 1 saat inkübe edin.
- Lamelleri oda sıcaklığında 100 μL 1x yıkama tamponu A'da 2x 5 dakika yıkayın.
- Ligasyon
- 5x ligasyon tamponunu ultra saf suyla 1:5 oranında seyreltin ve karıştırın. Her lamel için (en az) 40 μL ligasyon solüsyonu hazırlayın (8 μL 5x ligasyon tamponu, 31 μL ultra saf su).
- Ligaz'ı (PLA kitinde verilen 1 U/μL) önceki adımda 1:40 seyreltmede hazırlanan 1x ligasyon tamponuna ekleyin ve karıştırın.
- Bir vakum sistemi kullanarak lamellerden 1x yıkama tamponu A'yı çıkarın (adım 1.3.4'ten itibaren), lamellere 40 μL ligaz çözeltisi ekleyin ve ışıktan korunan bir nem odasında 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Lamelleri 2x 2 dakika boyunca 100 μL 1x yıkama tamponu A'da oda sıcaklığında vakum sistemini kullanarak yıkayın.
- Polimerizasyon
- 5x amplifikasyon tamponunu ultra saf suyla 1:5 oranında seyreltin ve karıştırın. Her lamel için (en az) 40 μL amplifikasyon solüsyonu (8 μL 5x amplifikasyon tamponu, 31.5 μL ultra saf su) hazırlayın.
- Polimerazı (PLA kitinde verilen 10 U/μL) önceki adımda 1:80 seyreltmede hazırlanan 1x polimerizasyon tamponuna ekleyin ve karıştırın.
- Bir vakum sistemi kullanarak lamellerden 1x yıkama tamponu A'yı çıkarın (adım 1.3.6'dan itibaren), lamellere 40 μL polimeraz çözeltisi ekleyin ve ışıktan korunan bir nem odasında 37 °C'de 1 saat 40 dakika inkübe edin.
- Polimeraz çözeltisini lamellerden çıkarın ve ışıktan korunan bir nem odasında oda sıcaklığında 100 μL 1x yıkama tamponu B'de 2x 10 dakika yıkayın.
- Lamelleri 1 x 1 dakika boyunca 100 μL 0.001x yıkama tamponu B içinde oda sıcaklığında ışıktan korunan bir nem odasında yıkayın.
- Lamelleri DAPI'li montaj ortamı (1.6-0.4 μg/mL arasındaki konsantrasyon) kullanarak mikroskopi için cam slaytlara monte edin. Oje ile kapatın.
- Primer antikor inkübasyonu
2. Görüntü edinme
- PLA sonuçlarını gözlemleyin ve beraberindeki yazılımı kullanarak 63x yağa daldırma objektifi ile floresan konfokal mikroskopi kullanarak görüntüler elde edin.
- 405 nm lazer diyot veya beyaz ışık lazeri kullanarak floresan uyarımını ayarlayın ve GaAsP PMT'ler veya hibrit dedektörlerle spektral pencereleri toplayın. Her odak düzleminde (300 nm'yi kapsayan), PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) ve mitokondri (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm) için floresan sinyallerini alın.
3. Mitokondri ile ilişkili PLA noktalarının görüntü işleme ve değerlendirilmesi
- Hücresel bileşenler arasında mesafe haritaları oluşturan görüntü analizi için bir yazılım kullanarak konfokal görüntüleri işleyin. PLA noktalarının ve mitokondriyal ağın 3D sulandırmalarını oluşturmak ve hücre görüntüleme yazılımını kullanarak aralarındaki mesafeye erişmek için aşağıdaki adımları izleyin (Şekil 1).
- 3D mesafe haritası uzantısının kurulumu
- Hem XT seçeneğiyle hem de MATLAB yazılımıyla hücre analizi yazılım paketini veya yalnızca web sitesinden ücretsiz olarak indirilebilen bir MATLAB derleyici çalışma zamanını (MRC) kurun.
- Hücre çözümleme yazılımını, bir XTension başlatıldığında MATLAB'ı başlatacak şekilde aşağıdaki gibi ayarlayın: Imaris (Mac OS X) veya Düzen menüsünden (Windows) Tercihler'i seçin, Özel Araçlar paneline geçin ve ardından yolu ayarlayın:
Windows için C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB.exe veya/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab Mac OS X için.
- Görüntüleri yazılıma aktarın
- Konfokal yığın görüntülerini bir . IMS dosyasını, doğrudan Arena bölümü aracılığıyla veya toplu dönüştürmeye izin veren bağımsız Dosya Dönüştürücüyü kullanarak.
- İçe aktarma işleminden sonra, görüntülerin uygun şekilde kalibre edilip edilmediğini kontrol edin. Görüntü Geometrisi > Görüntü Özelliklerini Düzenle > tıklayın ve voksel boyutunun X ve Y cinsinden gerçek görüntü için beklenen piksel boyutuna karşılık gelip gelmediğini kontrol edin (edinme yazılımındaki görüntü kalibrasyonuna bakın) ve Z'deki voksel boyutunun Z yığınını oluşturmak için mikroskop tarafından uygulanan adıma karşılık geldiğini kontrol edin. Değerler doğru değilse, aşağıdaki adımlarda mesafelerin doğru bir şekilde tahmin edilmesini sağlamak için bunları değiştirin.
- Ekran Ayarı menüsündeki farklı kanalların kontrastını Düzenle > Ekran Ayarını Göster'e tıklayarak ayarlayın. Her rengin görüntüsünü optimize etmek için her kanalı bağımsız olarak ayarlayın. Bu adım, görüntü değerlerini doğrudan etkilemez, ancak kesin eşikler ayarlamak veya zayıf nesneleri tespit etmek için gereklidir.
- Düzenle > 3B Kırp seçeneklerini kullanarak görüntüyü kırparak analizi tek bir hücreyle sınırlayın. Aynı görüş alanındaki başka bir hücreyi analiz etmek için, aynı görüntüyü bir kez daha açın ve farklı şekilde kırpın.
- ORP5-ORP8 nokta algılama
- ORP5 ve ORP8 etkileşiminin bulunduğu yerde üretilen PLA sinyallerini, yeni bir nesne kümesi oluşturan ve nokta algılama sihirbazını açan Yeni Noktalar Ekle seçeneğine tıklayarak tespit edin.
- Nokta algılamanın gerçekleştirileceği kanalı seçin.
- Nokta algılama algoritmasının ilgilenilen nesneleri bulmasına yardımcı olmak için Tahmini XY Çapını ayarlayın (nesne boyutu farklıysa aralık uyarlanmalıdır). Seçilen değer çok yüksekse, yakındaki nesnelerin kaynaşacağını unutmayın. Değer çok küçükse, bir sinyal birden fazla nesne olarak kabul edilebilir veya anormal sinyaller algılanabilir.
- İlgilenilen nesnelerin etrafındaki yerel kontrastı artırmak için nokta algılamadan önce görüntü arka planını kaldırmak için Arka Plan Çıkarma'ya tıklayın.
- Kaliteyi (nesne merkezindeki yoğunluk) eşik parametresi ve yazılım otomatik eşiği olarak tutarak nokta algılama eşiğini ayarlayın veya tüm nesneleri algılamak için bu değeri biraz değiştirin. Nokta algılama bittiğinde, algılama parametrelerini kaydedin ve diğer görüntüleri işlemek için bunları yeniden kullanın.
- Mitokondriyal ağ tespiti
- Yeni bir nesne oluşturmak için Yeni Yüzeyler Ekle'ye tıklayarak bir yüzey oluşturma oluşturmak için mitokondriyal ağı tespit edin ve yüzey algılama sihirbazını açın.
- Yüzey oluşturma işleminin gerçekleştirileceği kanalı seçin.
- Daha pürüzsüz bir yüzey elde etmek için Düzgünleştir onay kutusunu tıklatarak ve yüzeyde gözlemlenebilen en küçük ayrıntıları gösteren bir eşik ayarlayarak bir Gauss filtresi uygulayın.
- Yerel kontrastları geliştirmek ve eşik adımına yardımcı olmak için bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirin.
- Sinyalin yoğunluğuna göre mitokondriyal ağı tespit etmek için eşiği ayarlayın. Eşiği doğru bir şekilde ayarlamak zorsa, düzgünlük derecesini ve arka plan çıkarma derecesini ayarlamak için önceki adıma geri dönmeniz önerilir.
- Gerekirse, eşikten kaynaklanan küçük kalıntıları gidermek için yüzeye bir filtre uygulayın. Bunu yapmak için, yüzey sınıflandırma penceresinde Voksel Sayısı filtresini seçin ve yalnızca ilgilenilen nesneleri tutmak için üst ve alt eşiklerle oynayın. Yüzey oluşturma işlemi sona erdiğinde, oluşturma parametrelerini kaydedin ve diğer görüntüleri işlemek için bunları yeniden kullanın.
- Mitokondri etrafında 3 boyutlu mesafe haritasının oluşturulması
- Daha önce aşağıdaki gibi oluşturulan mitokondriyal yüzeyin dışında bir mesafe haritası oluşturun. Sahne ağacı kutusunda mitokondri yüzeyini seçin. Görüntü işleme > yüzeyler işlevi > mesafe dönüşümü üzerine tıklayın. Bu, kullanıcıdan haritanın nesne yüzeyinin dışında mı yoksa içinde mi hesaplanacağını seçmesini isteyen bir Matlab XTension'ı çağırır.
- PLA noktaları ile mitokondri yüzeyi arasındaki mesafeyi ölçmek için Dış Yüzey Nesnesi'ni seçin. Mesafe haritası oluşturulduktan sonra, ekran ayarlama panelinde yeni bir kanal olarak görünür. Bu kanalda, her pikselin en yakın mitokondriye olan mesafeye karşılık gelen bir değeri vardır.
- Nesnelerin en yakın mitokondriden uzaklıklarının çıkarılması
- Her noktadan en yakın mitokondriye olan mesafeyi ölçmek ve en yakın olanları belirlemek ve görselleştirmek için, sahne ağacı kutusunda daha önce oluşturulmuş noktaları seçin.
- İstatistiklerde ve ayrıntılı günlükte, Belirli Değerler'i seçin (her nokta için bir ölçüm elde etmek için). Merkez Yoğunluğu Ch=X'i seçin (X, mesafe haritası kanalının numarasına karşılık gelir). Bu, mesafe haritasında en yakın mitokondriye olan mesafesine karşılık gelen her bir nokta merkezinin değerini ölçecektir.
- Pencerenin sol alt kısmındaki Disket simgesine tıklayarak verileri .csv dosyası olarak dışa aktarın.
- Mitokondriye olan mesafelerine göre bir nokta alt popülasyonu çıkarmak için sahne ağacındaki noktaları seçin ve Filtreler sekmesine tıklayın.
- Bu pencerede, bir kez daha Merkez Yoğunluğu Ch=X'e dayalı yeni bir filtre ekleyin ve alt eşiği 0 μm'ye ve üst eşiği 0,380 μm'ye ayarlayarak mitokondriden 380 nm'den daha az uzaklıktaki noktaları çıkarın.
NOT: 380 nm'lik eşik, birincil ve ikincil antikorlar (30 nm) artı PLA amplifikasyon sinyallerinin (350 nm) yarısı maksimumda (FWHM) tam genişliğin yarısı arasındaki ilişkiyi içeren bir PLA reaksiyonuna dayalı olarak tahmin edilmiştir. - Seçili noktalara odaklanmak ve örneğin onlara farklı bir renk vermek için, Seçimi Yeni Noktalara Çoğalt düğmesine basarak bir çoğaltma adımı gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, iki ER'ye bağlı lipid transfer proteininin, ORP5 ve ORP8'in etkileşim bölgelerini tespit ettik ve bunların diğer organellerle, özellikle mitokondri ile temas halinde olan ER membran alt alanlarındaki oluşumlarını değerlendirdik. Bunun için, HeLa hücrelerindeki mitokondriyal ağ kırmızı bir mitokondriyal işaretleyici ile boyandı ve özgüllüğü daha önce immünofloresan15 ile test edilen primer antikorlar anti-ORP5 ve anti-ORP8 kullanılarak fiksasyondan sonra ORP5-ORP8 PLA yeşil lekeleri tespit edildi. Konfokal görüntüler, HeLa hücrelerindeki endojen ORP5-ORP8 PLA etkileşimlerinin, retiküler ER, kortikal ER ve genellikle mitokondri ile ilişkili ER membranları (MAM'lar; Şekil 2A). MAM'larda meydana gelen ORP5-ORP8 PLA etkileşimlerini ölçmek için, her bir PLA noktasının mitokondriden uzaklığı 3D görüntü analizi kullanılarak değerlendirildi. 380 nm'lik bir mesafe eşiği kullanılarak, 3D görüntüleme analizi, endojen ORP5-ORP8 PLA etkileşimlerinin yaklaşık% 50'sinin MAM'larda tespit edildiğini ortaya koydu (Şekil 2A, B). Etkileşimlerin diğer %50'si kortikal ve retiküler ER15 arasında dağıldı. PLA'nın özgüllüğünü doğrulamak için, ORP5-ORP8 PLA deneyleri, ORP5-hedefleme ve ORP8-hedefleme siRNA'ları (negatif kontrol) ile tedavi edilen hücrelerde veya ORP5 ve ORP8'i (pozitif kontrol) birlikte aşırı eksprese eden hücrelerde gerçekleştirildi. ORP5 ve ORP8 aşağı regülasyonu, toplam PLA sinyali sayısında büyük bir azalmaya neden oldu (MAM'larda, retiküler ER'de ve kortikal ER'de; Şekil 2A,C), birlikte aşırı ekspresyonları PLA'da bir artışa neden olurken (Şekil 2A,C), ORP5-ORP8 PLA'nın özgüllüğünü doğrular. Bununla birlikte, ilginç bir şekilde, ORP5 ve ORP8'i birlikte aşırı eksprese eden hücrelerde MAM'larda meydana gelen ORP5-ORP8 PLA etkileşimlerinin yüzdesi, bu proteinlerin endojen seviyelerde eksprese edildiği hücrelerde gözlemlenene benzerdi (Şekil 2B), MAM'larda bir kompleks olarak varlıklarını destekledi. Mitokondri ile yakın temas halinde olan ER membran alt alanlarında ORP5 ve ORP8'in varlığını daha fazla doğrulamak için, ORP5 veya ORP8 ile ORP5 ve ORP813'ün bilinen bir bağlanma ortağı olan dış mitokondriyal membran proteini PTPIP51 arasında ek kantitatif PLA analizleri yapılmıştır. PLA sinyalleri hem ORP5-PTPIP51 hem de ORP8-PTPIP51 çiftlerinde tespit edildi ve ortalama sayıları ORP5-ORP8 PLA çiftine benzerdi ve ER-mitokondri MCS'lerinde ORP5 ve ORP8 lokalizasyonunu doğruladı (Şekil 3).
Son olarak, laboratuvarımızdaki son çalışmalarda, sırasıyla PM veya LD'yi işaretlemek için PHPLCd-RFP veya mcherry-PLN1 ile transfekte edilen HeLa hücrelerinde benzer bir yaklaşım kullanarak, ER-PM temaslarında ORP5-ORP8 PLA etkileşimlerinin oluşumunu analiz edebildik ve mitokondri, ER ve LD'ler arasında üç yönlü bir temas yeri belirleyebildik (Şekil 4)15, 17.
Şekil 1: Mitokondriye yakın PLA sinyallerinin tanımlanması için iş akışı. İlk olarak, konfokal yığınlar, PLA odaklarını (lekeleri) ve mitokondriyal ağı (yüzeyleri) tanımlamak için bölümlere ayrılır. Daha sonra, yüzeylerin dışına (mitokondri) doğru 3D mesafe haritaları hesaplanır ve her noktanın en yakın mitokondriden uzaklığının ölçülmesine izin verilir. Son olarak, PLA noktaları, algılama sisteminin hassasiyetine dayalı olarak belirlenen 380 nm'lik bir yakınlık eşiğine dayalı olarak iki popülasyona (kırmızı ve yeşil) ayrılır. Bu rakam Monteiro-Cardoso ve ark.15'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ORP5-ORP8 kompleksinin temsili görüntüleri, ER-mitokondri temaslarında lokalize endojen seviyelerde eksprese edilir. (A) ORP5-ORP8 PLA konfokal serisi ve ilgili 3D sulandırmaları. Ölçek çubukları: 10 μm ve 2 μm (genişletilmiş görüntüler). (B) Mitokondri ile yakın temas halinde ORP5-ORP8 PLA odaklarının miktarının belirlenmesi. Endo, n = 33 hücre ve Overexp ORP5 + ORP8, n = 27 hücre. Veriler ortalama ± SEM (ortalamanın standart hatası) olarak sunulur. Bu görüntü Monteiro-Cardoso ve ark.15'ten değiştirilmiştir. (C) Toplam ORP5-ORP8 PLA odaklarının miktarının belirlenmesi. Endo, n = 38 hücre, siORP5 + siORP8, n = 38 hücre ve Overexp ORP5 + ORP8, n = 35 hücre. Veriler ortalama ± SEM (ortalamanın standart hatası) olarak sunulur. Bu görüntü Monteiro-Cardoso ve ark.15'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mitokondriyal protein PTPIP51 ile ORP5 veya ORP8 arasındaki PLA sinyallerinin temsili görüntüleri. (A) ER-mitokondri yakın temaslarında PTPIP51 ile ORPR5 veya ORP8 PLA etkileşimlerinin meydana geldiğini doğrulamak için 3D sulandırma ve mesafe haritaları oluşturmak için konfokal seriler kullanıldı. Ölçek çubukları: 10 μm ve 2 μm (genişletilmiş görüntüler). (B) kontrolde PTPIP51 immünofloresan konfokal görüntüler (tek odak düzlemi) ve siRNA hedefleme PTPIP51 ile tedavi edilen HeLa hücreleri. Ölçek çubukları: 10 μm ve 2 μm (genişletilmiş görüntüler). (C) Kontrolde ORP5-PTPIP51 ve ORP8-PTPIP51 PLA konfokal görüntüleri ve siRNA hedefleme PTPIP51 ile tedavi edilen HeLa hücreleri. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ORP5-ORP8 PLA kompleksini ER-PM ve ER-mitokondri-LD kontaklarında lokalize etmek için kullanılan 3D rekonstrüksiyon örnekleri. (A) Yeşil noktalarla temsil edilen ORP5-ORP8 PLA ile bir HeLa hücresinin konfokal görüntüsü ve ilgili 3D sulandırması, kırmızı hücre ile temsil edilen PHPLCd-RFP ile işaretlenmiş PM ve mavi yüzeylerle temsil edilen Mito-BFP ile işaretlenmiş mitokondri. Sol ve orta görüntüler: tüm HeLa hücresinin temsili. Sağdaki resim: hücre içinde yakınlaştırılmış bir bölgenin temsili. (B) Yeşil noktalarla temsil edilen ORP5-ORP8 PLA ile bir HeLa hücresinin yakınlaştırılmış bir bölgesinin konfokal görüntüsü ve ilgili 3D sulandırması, kırmızı yüzeylerle temsil edilen mCherry-PLN1 ile işaretlenmiş LD'ler ve mavi yüzeylerle temsil edilen Mito-BFP. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, MCS'lerde, özellikle MERCS'lerde organeller arası protein PLA etkileşimlerini tanımlamak ve ölçmek için tasarlanmıştır. Protokolün yeniliği, aynı zarda bulunan iki protein arasındaki PLA etkileşimlerini lokalize etmek ve ölçmek için PLA'yı çoklu organellerin etiketlenmesi, konfokal mikroskopi ve 3D görüntü analizi ile birleştirmesidir, bu durumda ER zarı içinde mitokondri zarı (MAM) veya MAM ve LD'ler ile aynı anda. Bu protokol, belirli MERCS'lerde ve aynı zamanda diğer MCS'lerde potansiyel olarak lokalize olan proteinleri doğrulamak için bir araç olarak kullanılabilir.
2006 yılında geliştirilmesinden bu yana, bir ER ve bir mitokondriyal protein arasındaki PLA, MERCS'leriölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır 7,9,10,11. Bununla birlikte, PLA'nın hücrelerde MERCS bolluğunun bir göstergesi olarak kullanılmasının, yüksek çözünürlüklü yaklaşımlarla dikkatlice doğrulanması gerekir. Örneğin, MERCS'lerin bolluğunu etkilemeyen bir mitokondriyal protein olan SAM50'nin ablasyonu (elektron mikroskobu ile ölçüldüğü gibi)15, ER proteini ORP8 ve mitokondriyal protein TOM20 arasındaki PLA etkileşimlerini de değiştirmez, ancak ORP8 ile mitokondriyal protein Metaxin2 arasındaki PLA etkileşimlerini ekspresyon seviyelerini düşürmedenazaltır 15. Bu sonuçlar, PLA etkileşimlerinin tahlilde kullanılan protein çiftine özgü olabileceğini ve MERCS'nin bolluğunu değerlendirmek için tek parametre olarak kullanılamayacağını yansıtmaktadır.
Bununla birlikte, PLA, in situ endojen protein etkileşimlerini tespit etmek için kanıtlanmış hassas bir yaklaşımdır. Bölünmüş GFP ve FRET dahil olmak üzere diğer floresan prob tabanlı tespit yöntemlerinin veya yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlarının aksine, PLA, hedeflenen organellerin fiziksel özelliklerinin değiştirilmesi gibi doğal deneysel artefaktlardan kaçınarak, etiketli proteinlerin aşırı ekspresyonunu gerektirmez15. Protein etkileşimlerinin PLA ile saptanması, western blot ile birlikte immünopresipitasyon gibi diğer immüno-disepsipitasyon yöntemlerine göre de avantajlar sunar. PLA, tek hücre düzeyinde tek floresan noktalarının nicelleştirilmesine izin verirken, ko-immünopresipitasyon yüksek miktarda biyolojik materyal gerektirir ve yalnızca uygun bir yükleme kontrolünün elde edilmesinin zor olduğu bir heterojen hücre havuzundan ekstrakte edilen proteinin nispi nicelleştirilmesine izin verir15. Organel boyama ve konfokal mikroskopi ile birlikte PLA kullanımının ko-immünopresipitasyona göre ek avantajı, ilk yaklaşımın protein etkileşimlerinin hücre altı düzeyde lokalizasyonuna izin vermesidir.
Öte yandan, bu protokolün belirgin dezavantajları, MERCS'lerden daha büyük olan yaklaşık 40 nm'lik PLA algılama aralığı ve yaklaşık 250 nm'lik konfokal mikroskopi ile elde edilen maksimum çözünürlük ile ilişkilidir, bu da temas bölgelerini kesin olarak tanımlamayı zorlaştırır. Bununla birlikte, burada, birincil ve ikincil antikorların (30 nm) ve PLA amplifikasyon sinyallerinin FWHM'sinin yarısının (350 nm) ilişkisi dahil olmak üzere, PLA reaksiyonunun boyutuna bağlı olarak mitokondri yüzeyleri ile ilişkili PLA lekelerini tahmin etmek için 380 nm'lik bir eşik kullanıldı. PLA'nın bir başka sınırlaması, yalnızca sabit numunelerde kullanılabilmesi ve belirgin, spesifik ve ölçülebilir bir PLA sinyalinin elde edilmesinin, ilgilenilen proteine oldukça spesifik olan antikorların mevcudiyetini gerektirmesiile ilgilidir 15. Ek olarak, mesafe tahmini için 3D görüntüleme analizi, tüm laboratuvarlarda kolayca bulunamayabilecek özel bir yazılım gerektirir.
Özellikle, yukarıda belirtilen dezavantajlardan bazıları, son zamanlarda mevcut olan teknolojiler kullanılarak ele alınabilir. Örneğin, konvansiyonel konfokal mikroskopi, Airyscan veya yapılandırılmış ışıklı mikroskopi (SIM)17 gibi daha yüksek çözünürlük seviyesindeki görüntüleme teknikleriyle değiştirilebilir ve ilgilenilen proteinler için iyi primer antikorların eksikliği, CRISPR-Cas9 teknolojisi kullanılarak endojen proteinlerin stabil bir şekilde etiketlenmesiyle aşılabilir18. Son olarak, antikorların ve PLA sinyallerinin kalitesi ve özgüllüğü aşağıdaki kontroller kullanılarak doğrulanabilir: 1) kontrol hücrelerinde ve ilgilenilen proteinin tükendiği veya aşırı eksprese edildiği hücrelerde primer antikorların immünofloresan ve western blot ile test edilmesi; 2) ilgilenilen proteinlerden birinin veya her ikisinin tükendiği hücrelerde PLA gerçekleştirmek; 3) ilgilenilen proteinleri birlikte aşırı eksprese eden hücrelerde PLA gerçekleştirmek; 4) ilgilenilen proteinler için her iki antikoru da ihmal ederken PLA gerçekleştirmek; 5) ilgilenilen proteinler için iki antikordan sadece birini kullanarak PLA gerçekleştirmek; 6) birincil antikorların üretildiği türlerle aynı IgG ile inkübasyon ile PLA gerçekleştirmek. Özgüllüklerini değerlendirmek için, bu protokolde kullanılan antikorlar, kontrol hücrelerinde ve ORP5 15, ORP815 veya PTPIP51'yi hedefleyen siRNA ile tedavi edilen hücrelerde immünofloresan ve western blot ile test edildi (Şekil 3B ve Guyard ve ark.17). Ayrıca, antikor algılama sinyali ile EGFP sinyali15 arasındaki Pearson katsayısı değerlendirilerek EGFP etiketli ORP5 veya ORP8 eksprese eden hücrelerde anti-ORP5 ve anti-ORP8 özgüllüğü değerlendirilmiştir. Anti-ORP515, anti-ORP815 ve anti-PTPIP51 (Şekil 1 ve Şekil 3C) antikorlarının özgüllükleri, bu proteinlerin tükendiği hücrelerde daha fazla analiz edildi ve bu da PLA sinyallerinde bir azalmaya yol açtı. İmmünofloresan boyama için uygun olan antikor konsantrasyonu genellikle PLA için de uygundur; bununla birlikte, kullanılan antikorlara bağlı olarak, PLA boyamasını iyileştirmek için bloke edici solüsyonda ve/veya antikor konsantrasyonlarında bazı ayarlamalar yapılabilir. ORP5-ORP8 ve ORP8-PTPIP51 PLA boyama, blokaj çözeltisi ayarlandıktan sonra iyileştirildi. Yüksek kaliteli mitokondriyal ve PLA boyama elde etmek için, 3D modülasyonu kolaylaştırmak için önemli olan düşük arka plan sinyallerine sahip yüksek kaliteli konfokal görüntüler elde etmek esastır. Örneğin, yüksek arka plan etki eşiği ayarlarına sahip konfokal görüntüler ve sonuç olarak mitokondriyal ağın veya PLA'nın 3D modülasyonunun doğruluğunu etkiler.
Sonuç olarak, burada sunulan protokol, çok hücreli organel etiketlemesi kullanarak ve 3D yeniden yapılandırılmış konfokal görüntülerde mesafe haritaları oluşturarak, belirli MERCS alt alanlarında (MCS'lerle meşgul olan aynı zar içinde cis'de lokalize proteinler arasındaki etkileşimler veya yan yana getirilmiş membranlar içinde transta lokalize proteinler arasındaki etkileşimler) PLA protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu ve nicelleştirilmesini sağlar. Burada açıklanan prosedürler, MERCS'lerde protein etkileşimlerini tespit etmek için diğer metodolojilerle karşılaştırıldığında teknik olarak basit ve nispeten hızlı olmasına rağmen, elde edilen veriler yüksek oranda tekrarlanabilir. Ayrıca, bu protokol, ilgilenilen proteinler için mevcut antikorlar ve organelleri boyamak için mevcut belirteçler kadar çok yönlüdür. Bu nedenle, çok çeşitli protein çiftlerine ve çeşitli organellere ve MCS'lere uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir Programı, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) ve Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02 / Saclay Bitki Bilimleri).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
References
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287 (2019).
- Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
- Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
- Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).
- Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
- Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).
- Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).
- Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
- Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
- Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
- Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757 (2017).
- Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).
- Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).
- Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
