Summary
De behoefte aan nieuwe benaderingen voor het bestuderen van membraancontactplaatsen (MCS'en) is gegroeid als gevolg van de toenemende interesse in het bestuderen van deze cellulaire structuren en hun componenten. Hier presenteren we een protocol dat eerder beschikbare microscopietechnologieën integreert om intra-organel en inter-organel eiwitcomplexen die zich in MCS'en bevinden te identificeren en te kwantificeren.
Abstract
Membraancontactplaatsen (MCS'en) zijn gebieden met nauwe membraannabijheid die de dynamische uitwisseling van diverse biomoleculen (d.w.z. calcium en lipiden) tussen de naast elkaar geplaatste organellen mogelijk maken en reguleren zonder dat er sprake is van membraanfusie. MCS'en zijn essentieel voor cellulaire homeostase en hun functies worden verzekerd door de residente componenten, die vaak bestaan als multimere eiwitcomplexen. MCS'en omvatten vaak het endoplasmatisch reticulum (ER), een belangrijke plaats van lipidesynthese en cellulaire calciumopslag, en zijn vooral belangrijk voor organellen, zoals de mitochondriën, die zijn uitgesloten van de klassieke vesiculaire transportroutes. In de afgelopen jaren zijn MCS'en tussen het ER en mitochondriën uitgebreid bestudeerd, omdat hun functies een sterke invloed hebben op het cellulaire metabolisme / bio-energetica. Verschillende eiwitten zijn begonnen te worden geïdentificeerd op deze contactplaatsen, waaronder membraanbinders, calciumkanalen en lipideoverdrachtseiwitten, waardoor de behoefte aan nieuwe methodologieën en technische benaderingen om deze MCS-componenten te bestuderen, toeneemt. Hier beschrijven we een protocol dat bestaat uit gecombineerde technische benaderingen, waaronder proximity ligation assay (PLA), mitochondriale kleuring en 3D-beeldvormingssegmentatie, waarmee eiwitten kunnen worden gedetecteerd die fysiek dicht (>40 nm) bij elkaar zijn en die zich op hetzelfde membraan bevinden bij ER-mitochondriale MCS'en. We gebruikten bijvoorbeeld twee ER-verankerde lipideoverdrachtseiwitten, ORP5 en ORP8, waarvan eerder is aangetoond dat ze interageren en lokaliseren bij ER-mitochondriën en ER-plasmamembraan MCS'en. Door de ORP5-ORP8 PLA te associëren met celbeeldvormingssoftware-analyse, was het mogelijk om de afstand van het ORP5-ORP8-complex tot het mitochondriale oppervlak te schatten en te bepalen dat ongeveer 50% van de ORP5-ORP8 PLA-interactie plaatsvindt op ER-subdomeinen in de nabijheid van mitochondriën.
Introduction
Inter-organel communicatie is een bepalend kenmerk van eukaryote cellen. Een manier waarop organellen communiceren, is door membraancontactplaatsen (MCS'en) te vormen, die nauwe membraanopposities zijn tussen twee organellen die worden onderhouden door structurele en functionele eiwitten, zoals tethers, lipideoverdrachtseiwitten en calciumkanalen1. MCS'en kunnen worden vastgesteld tussen vergelijkbare of verschillende organellen en ze bemiddelen de uitwisseling van cellulaire componenten, wat belangrijk is voor het behoud van cellulaire homeostase. Tot op heden zijn verschillende MCS'en geïdentificeerd, waaronder endoplasmatisch reticulum (ER)-mitochondriën, ER-plasmamembraan (PM) en ER-lipidedruppel (LD) contacten1. Onder hen behoren die gevormd tussen het ER en de mitochondriën (MERCSs) tot de meest bestudeerde omdat ze betrokken zijn bij de regulatie van verschillende cellulaire functies, waaronder lipide- en calciumhomeostase2. Omdat mitochondriën grotendeels zijn uitgesloten van de klassieke vesiculaire transportroutes, vertrouwen ze op MERCS en op hun moleculaire bestanddelen om belangrijke lipiden of lipideprecursoren uit het ER te importeren. Het niet-vesiculaire transport van deze lipiden over MERCSs zorgt voor het behoud van een goede mitochondriale lipidesamenstelling, evenals hun functionele en structurele integriteit3.
Gezien de cruciale betrokkenheid van MCS'en bij verschillende cellulaire functies, is de interesse in het bieden van een dieper inzicht in hun moleculaire componenten de afgelopen jaren sterk toegenomen. Verschillende soorten op beeldvorming gebaseerde benaderingen zijn gebruikt om de kennis over MCS'en te vergroten. Onder hen is de fluorescentiesonde-gebaseerde proximity ligation assay (PLA) op grote schaal gebruikt als een indicator van de overvloed aan MCS'en door inter-organel eiwit-eiwitinteracties (in een detectiebereik van 40 nm) te detecteren op endogene niveaus4. MERCS'en zijn bijvoorbeeld gevisualiseerd en gekwantificeerd door PLA te gebruiken tussen verschillende mitochondriën-ER-eiwitparen, waaronder VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 en PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Hoewel deze technologie is gebruikt om inter-organel eiwit-eiwitinteracties te detecteren en te kwantificeren die aanwezig zijn bij de MCS 5,7,9,10,11, combineerden de meeste studies PLA niet met organelkleuring. Daarom is er nog geen kwantitatieve methode ontwikkeld waarmee de nabijheid tussen PLA-interacties en geassocieerde organellen kan worden gemeten. Tot nu toe is in het geval van ER-eiwitten hun interactie binnen membraansubdomeinen in contact met andere organellen dus niet onderscheiden van hun interactie binnen het wijd verspreide ER-netwerk.
Hier beschrijven we een protocol om PLA-interacties te detecteren tussen eiwitten die zich in het membraan van hetzelfde organel bevinden en om hun nabijheid tot het membraan van het partnerorganel in het MCS te analyseren. Dit protocol is ontwikkeld op basis van twee premissen: 1) eerdere studies die aantonen dat, in overexpressieomstandigheden, de ER-lipideoverdrachtseiwitten ORP5 en ORP8 co-lokaliseren en interageren op ER-mitochondriën en ER-PM MCSs 12,13,14,15 en dat ORP5 lokaliseert bij ER-LD-contacten 16,17; 2) bestaande technologieën, waaronder PLA, confocale microscopie, organeletikettering en 3D-beeldvormingsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mitochondriale kleuring en proximity ligation assay (PLA)
- Plaat 0,5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa-cellen, onderhouden in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren bij 37 °C met 5% CO2, in 13 mm glazen afdekplaten in1,5 in 24-putplaten met een verdunning die 75% -90% celsamenvloeiing op de dag van de procedure mogelijk maakt.
OPMERKING: Van belang is dat HeLa-cellen kunnen worden onderworpen aan aanvullende behandelingen, zoals siRNA-behandeling en / of DNA-plasmidetransfectie, vóór mitochondriale kleuring en PLA. - Mitochondriale kleuring
- Was de cellen eenmaal in een serumvrij medium dat is voorverwarmd op 37 °C. Incubeer de cellen met voorverwarmd serumvrij medium gedurende 10 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
- Bereid 1 μM rode mitochondriale marker in voorverwarmd serumvrij medium.
- Incubeer de cellen met 500 μL mitochondriale markeroplossing gedurende 30 minuten bij 37 °C met 5% CO2. Houd tijdens de mitochondriale markerbehandeling en de volgende stappen van het protocol de cellen op coverslips zoveel mogelijk beschermd tegen licht.
- Na de incubatie was u de cellen 1x in voorverwarmd serumvrij medium en 2x in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voer deze stap zo snel mogelijk uit, omdat lange wasstappen vóór fixatie de mitochondriale morfologie kunnen beïnvloeden.
- Verwijder de 1x PBS van de afdekstroken en bevestig de cellen door ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (in het donker) onder de chemische kap te incuberen in vers bereide 4% PFA (in 1x PBS). Was 3x gedurende 2 minuten in 500 μL of 1x PBS (met behulp van wegwerppipetten of een vacuümsysteem aangesloten op een pomp).
- Verwijder de 1x PBS en incuber de coverslips met 500 μL van 50mM NH4Cl gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (in het donker). Was 1x gedurende 2 minuten in 500 μL of 1x PSB met behulp van een vacuümsysteem.
- Was 3x gedurende 2 min in 500 μL blokkeringsbuffer 1 (BB1, 1%BSA, 0,1% saponine in 1x PBS) voor de ORP5-ORP8 PLA of blokkeringsbuffer 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% normaal geitenserum, 0,1 saponine in 1x PBS) voor de ORP8-PTPIP51 PLA.
- Breng de afdekstroken van de 24-putplaat over in een vochtigheidskamer. Voeg na het overbrengen van de coverslips in de kamer 100 μL BB (BB1 of BB2, afhankelijk van de gebruikte antilichamenparen) toe om uitdroging te voorkomen.
OPMERKING: Een vochtkamer beschermd tegen licht kan gemakkelijk en snel worden verkregen door een petrischaal (plastic of glas) in aluminiumfolie te wikkelen en enkele stukken nat keukenpapier toe te voegen aan de periferie van de petrischaal.
- Nabijheidsligatietest (PLA)
OPMERKING: Het PLA-protocol volgt de instructies van de fabrikant met kleine wijzigingen.- Incubatie van primaire antilichamen
- Bereid de primaire antilichaamwerkoplossing voor. Verdun konijn anti-ORP5 (1:150) plus muis anti-ORP8 (1:200) in BB1, muis anti-ORP8 (1:200) plus konijn anti-PTPIP51 (1:200) in BB2, en konijn anti-ORP5 (1:150) plus muis anti-PTPIP51 (1:200) in BB1. Bereid (ten minste) 40 μL primaire antilichaamoplossing per coverslip (bijv. 0,27 μL konijn anti-ORP5, 0,2 μL muis anti-ORP8, 39,53 μL BB1).
- Verwijder de BB uit de vorige wasbeurt (stap 1.2.8) met behulp van een vacuümsysteem en voeg 40 μL primaire antilichaamoplossing toe aan de dekzeilen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtigheidskamer beschermd tegen licht.
- Was coverslips 3x gedurende 5 min met 100 μL van de bijbehorende BB met behulp van het vacuümsysteem.
- PLA sonde incubatie
- Bereid de werkoplossing van de PLA-sondes voor. Verdun konijn PLUS (1:5) en muis MINUS (1:5) PLA sondes in BB, en meng. Bereid voor elke coverslip (ten minste) 40 μL PLA-sondeoplossing (bijv. 8 μL rabbit PLUS PLA-sonde, 8 μL muis MINUS PLA-sonde, 24 μL BB). Laat de PLA-sondeoplossing voor gebruik 20 minuten op kamertemperatuur staan.
- Verwijder de BB van de afdekstroken (uit stap 1.3.2) met behulp van een vacuümsysteem en voeg 40 μL PLA-sondeoplossing toe aan de afdekplaten. Incubeer gedurende 1 uur bij 37°C in een vochtigheidskamer beschermd tegen het licht.
- Was de coverslips 2x gedurende 5 min in 100 μL of 1x wasbuffer A op kamertemperatuur.
- Afbinding
- Verdun 5x ligatiebuffer tot 1:5 in ultrazuiver water en meng. Bereid voor elke deklaag (ten minste) 40 μL ligatieoplossing (8 μL 5x ligatiebuffer, 31 μL ultrazuiver water).
- Voeg het ligase (1 U/μL, meegeleverd in de PLA-kit) toe aan 1x ligatiebuffer bereid in de vorige stap bij een verdunning van 1:40 en meng.
- Verwijder 1x wasbuffer A van de afdekstroken (vanaf stap 1.3.4) met behulp van een vacuümsysteem, voeg 40 μL ligase-oplossing toe aan de afdekstroken en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een vochtigheidskamer die beschermd is tegen het licht.
- Was de coverslips 2x gedurende 2 min in 100 μL of 1x wasbuffer A op kamertemperatuur met behulp van het vacuümsysteem.
- Polymerisatie
- Verdun 5x versterkingsbuffer 1:5 in ultrazuiver water en meng. Bereid voor elke coverslip (ten minste) 40 μL amplificatieoplossing (8 μL 5x versterkingsbuffer, 31,5 μL ultrazuiver water).
- Voeg het polymerase (10 U/μL, meegeleverd in de PLA-kit) toe aan de 1x polymerisatiebuffer die in de vorige stap is bereid bij een verdunning van 1:80 en meng.
- Verwijder 1x wasbuffer A van de afdekstroken (vanaf stap 1.3.6) met behulp van een vacuümsysteem, voeg 40 μL polymeraseoplossing toe aan de afdekstroken en incubeer gedurende 1 uur en 40 minuten bij 37 °C in een vochtigheidskamer die beschermd is tegen het licht.
- Verwijder de polymerase-oplossing uit de afdekstroken en was 2x gedurende 10 minuten in 100 μL 1x wasbuffer B op kamertemperatuur in een vochtigheidskamer beschermd tegen het licht.
- Was de coverslips 1x gedurende 1 min in 100 μL of 0,001x wasbuffer B op kamertemperatuur in een vochtkamer beschermd tegen het licht.
- Monteer de coverslips op glasplaten voor microscopie met behulp van montagemedium met DAPI (concentratie tussen 1,6-0,4 μg/ml). Sluit af met nagellak.
- Incubatie van primaire antilichamen
2. Beeldacquisitie
- Bekijk de PLA-resultaten en verkrijg beelden met behulp van fluorescentie confocale microscopie met een 63x olie-onderdompelingsobjectief met behulp van de bijbehorende software.
- Stel de fluorescentie-excitatie in met behulp van een 405 nm laserdiode of een witlichtlaser en verzamel de spectrale vensters met GaAsP PMT's of hybride detectoren. Op elk brandpuntsvlak (verspreid over 300 nm) verwerven de fluorescentiesignalen voor PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) en mitochondriën (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).
3. Beeldverwerking en beoordeling van PLA-vlekken geassocieerd met mitochondriën
- Verwerk de confocale beelden met behulp van een software voor beeldanalyse die afstandskaarten tussen de cellulaire componenten genereert. Volg de onderstaande stappen om 3D-reconstituties van PLA-spots en het mitochondriale netwerk te genereren en toegang te krijgen tot de afstand tussen hen met behulp van celbeeldvormingssoftware (figuur 1).
- Installatie van de 3D-afstandskaartuitbreiding
- Installeer zowel het celanalysesoftwarepakket met de XT-optie als de MATLAB-software of alleen een MATLAB-compilerruntime (MRC), die gratis kan worden gedownload van de website.
- Stel de celanalysesoftware in om MATLAB te starten wanneer een XTension als volgt wordt gestart: selecteer in de optie Imaris (Mac OS X) of het menu Bewerken (Windows) Voorkeuren, ga naar het deelvenster Aangepaste hulpmiddelen en stel vervolgens het pad in:
C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe voor Windows of/Programma's/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab voor Mac OS X.
- Importeer de afbeeldingen in de software
- Converteer de confocale stapelafbeeldingen naar een . IMS-bestand, rechtstreeks via de Arena-sectie of met behulp van de zelfstandige bestandsconverter die batchconversie mogelijk maakt.
- Controleer na het importeren of de afbeeldingen goed gekalibreerd blijven. Klik op Edit > Image Properties > Image Geometry en controleer of de voxelgrootte in X en Y overeenkomt met de verwachte pixelgrootte voor de werkelijke afbeelding (zie beeldkalibratie in de acquisitiesoftware) en of de voxelgrootte in Z overeenkomt met de stap die door de microscoop wordt toegepast om de Z-stack te genereren. Als de waarden niet correct zijn, wijzigt u ze om een juiste schatting van de afstanden in de volgende stappen te garanderen.
- Pas het contrast van de verschillende kanalen in het menu Beeldschermaanpassing aan door op Bewerken > Weergaveaanpassing weergeven te klikken. Pas elk kanaal afzonderlijk aan om de weergave van elke kleur te optimaliseren. Deze stap heeft geen directe invloed op de afbeeldingswaarden, maar is essentieel om nauwkeurige drempelwaarden in te stellen of zwakke objecten te detecteren.
- Beperk de analyse tot één cel door de afbeelding bij te snijden met de opties Bewerken > 3D bijsnijden. Als u een andere cel in hetzelfde gezichtsveld wilt analyseren, opent u dezelfde afbeelding opnieuw en snijdt u deze anders bij.
- ORP5-ORP8 spot detectie
- Detecteer de PLA-signalen die worden gegenereerd op de locatie van ORP5- en ORP8-interactie door op de optie Nieuwe vlekken toevoegen te klikken, waarmee een nieuwe set objecten wordt gemaakt en de wizard voor spotdetectie wordt geopend.
- Selecteer het kanaal waarop de spotdetectie moet worden uitgevoerd.
- Pas de geschatte XY-diameter aan (het bereik moet worden aangepast als de objectgrootte verschilt) om het spotdetectiealgoritme te helpen de interessante objecten te vinden. Houd er rekening mee dat als de gekozen waarde te hoog is, de objecten in de buurt zullen samensmelten. Als de waarde te klein is, kan één signaal als meerdere objecten worden beschouwd of kunnen afwijkende signalen worden gedetecteerd.
- Klik op Achtergrondaftrek om de achtergrond van de afbeelding te verwijderen voordat u de spotdetectie uitvoert om het lokale contrast rond de interessante objecten te verbeteren.
- Pas de spotdetectiedrempel aan door de kwaliteit (intensiteit in het objectmidden) te behouden als de drempelparameter en de automatische drempel van de software, of wijzig deze waarde enigszins om alle objecten te detecteren. Zodra de spotdetectie is voltooid, slaat u de detectieparameters op en gebruikt u deze opnieuw om andere afbeeldingen te verwerken.
- Mitochondriale netwerkdetectie
- Detecteer het mitochondriale netwerk om een oppervlakteweergave te genereren door op Nieuwe oppervlakken toevoegen te klikken om een nieuw object te maken en de wizard voor oppervlaktedetectie te openen.
- Selecteer het kanaal waarop het maken van het oppervlak moet worden uitgevoerd.
- Pas een Gauss-filter toe om een gladder oppervlak te verkrijgen door op het selectievakje Vloeiend te klikken en een drempelwaarde in te stellen die de kleinste details aangeeft die op het oppervlak waarneembaar zijn.
- Voer een achtergrondaftrek uit om de lokale contrasten te verbeteren en te helpen bij de drempelstap.
- Pas de drempel aan om het mitochondriale netwerk te detecteren op basis van de intensiteit van het signaal. Als het moeilijk is om de drempel goed in te stellen, is het raadzaam om terug te gaan naar de vorige stap om de mate van vloeiendheid en achtergrondaftrek aan te passen.
- Breng indien nodig een filter aan op het oppervlak om kleine resten als gevolg van de drempel te verwijderen. Om dit te doen, selecteert u het filter Aantal Voxels in het venster Classificeren oppervlak en speelt u met de bovenste en onderste drempels om alleen de objecten van belang te behouden. Zodra het maken van het oppervlak is voltooid, slaat u de aanmaakparameters op en gebruikt u deze opnieuw om andere afbeeldingen te verwerken.
- Generatie van de 3D-afstandskaart rond de mitochondriën
- Genereer een afstandskaart buiten het mitochondriale oppervlak die eerder als volgt is gemaakt. Selecteer het mitochondriale oppervlak in de scèneboomdoos. Klik op Beeldverwerking > Surfaces Function > Distance Transformation. Dit wordt een Matlab XTension genoemd die de gebruiker vraagt om te kiezen of de kaart buiten of binnen het objectoppervlak moet worden berekend.
- Selecteer Object aan buitenoppervlak om de afstand tussen de PLA-vlekken en het oppervlak van de mitochondriën te meten. Eenmaal gegenereerd, wordt de afstandskaart weergegeven als een nieuw kanaal in het weergave-aanpassingsvenster. In dit kanaal heeft elke pixel een waarde die overeenkomt met de afstand tot de dichtstbijzijnde mitochondriën.
- Extractie van de afstanden van de objecten tot het dichtstbijzijnde mitochondrion
- Om de afstand van elk punt tot het dichtstbijzijnde mitochondrion te meten en de dichtstbijzijnde te identificeren en te visualiseren, selecteert u de vlekken die eerder zijn gegenereerd in de scèneboomvak.
- Selecteer in de statistieken en het gedetailleerde logboek Specifieke waarden (om één meting voor elke plek te verkrijgen). Selecteer Center Intensity Ch=X (waarbij X overeenkomt met het nummer van het afstandskaartkanaal). Dit meet de waarde van elk spotcentrum, dat overeenkomt met de afstand tot het dichtstbijzijnde mitochondrion, in de afstandskaart.
- Exporteer de gegevens als een .csv bestand door op het diskettepictogram linksonder in het venster te klikken.
- Als u een subpopulatie van vlekken wilt extraheren op basis van hun afstanden tot mitochondriën, selecteert u de vlekken in de scènestructuur en klikt u op het tabblad Filters .
- Voeg in dit venster een nieuw filter toe dat opnieuw is gebaseerd op de Center Intensity Ch=X en haal de vlekken op minder dan 380 nm afstand van mitochondriën door de onderste drempel in te stellen op 0 μm en de bovenste drempel op 0,380 μm.
OPMERKING: De drempel van 380 nm werd geschat op basis van een PLA-reactie inclusief de associatie tussen de primaire en secundaire antilichamen (30 nm) plus de helft van de volledige breedte bij de helft van het maximum (FWHM) van de PLA-amplificatiesignalen (350 nm). - Als u zich wilt concentreren op de geselecteerde vlekken en ze bijvoorbeeld een duidelijke kleur wilt geven, voert u een duplicatiestap uit door op de knop Selectie dupliceren naar nieuwe vlekken te drukken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het hierboven beschreven protocol detecteerden we de interactieplaatsen van twee ER-verankerde lipideoverdrachtseiwitten, ORP5 en ORP8, en beoordeelden we hun voorkomen bij ER-membraansubdomeinen in contact met andere organellen, in het bijzonder met de mitochondriën. Daarvoor werd het mitochondriale netwerk in HeLa-cellen gekleurd met een rode mitochondriale marker en werden ORP5-ORP8 PLA-groene vlekken gedetecteerd na fixatie met behulp van de primaire antilichamen anti-ORP5 en anti-ORP8, waarvan de specificiteit eerder werd getest door immunofluorescentie15. Confocale beelden toonden aan dat endogene ORP5-ORP8 PLA-interacties in de HeLa-cellen optraden in het reticulaire ER, corticale ER en in ER-subdomeinen in nauw contact met mitochondriën, gewoonlijk aangeduid als mitochondriën-geassocieerde ER-membranen (MAMs; Figuur 2A). Om de ORP5-ORP8 PLA-interacties bij MAMs te kwantificeren, werd de afstand van elke PLA-spot tot mitochondriën geëvalueerd met behulp van 3D-beeldanalyse. Met behulp van een afstandsdrempel van 380 nm toonde 3D-beeldvormingsanalyse aan dat ongeveer 50% van de endogene ORP5-ORP8 PLA-interacties werden gedetecteerd bij MAMs (figuur 2A, B). De overige 50% van de interacties waren verdeeld tussen de corticale en reticulaire ER15. Om de specificiteit van de PLA te valideren, werden ORP5-ORP8 PLA-experimenten uitgevoerd in cellen behandeld met ORP5-targeting en ORP8-targeting siRNA's (negatieve controle) of in cellen co-overexpressie ORP5 en ORP8 (positieve controle). ORP5- en ORP8-downregulatie veroorzaakte een enorme afname van het totale aantal PLA-signalen (bij MAMs, bij het reticulaire ER en bij het corticale ER; Figuur 2A,C), terwijl hun co-overexpressie resulteerde in een toename van PLA (figuur 2A,C), wat de specificiteit van de ORP5-ORP8 PLA bevestigt. Interessant is echter dat het percentage ORP5-ORP8 PLA-interacties dat optreedt bij MAMs in cellen die ORP5 en ORP8 co-overexpresseren vergelijkbaar was met dat waargenomen in cellen waar deze eiwitten tot expressie kwamen op endogene niveaus (figuur 2B), wat hun bestaan als een complex bij MAMs ondersteunt. Om de aanwezigheid van ORP5 en ORP8 op ER-membraansubdomeinen in nauw contact met mitochondriën verder te bevestigen, werden aanvullende kwantitatieve PLA-analyses uitgevoerd tussen ORP5 of ORP8 en het buitenste mitochondriale membraaneiwit PTPIP51, een bekende bindingspartner van ORP5 en ORP813. PLA-signalen werden gedetecteerd in zowel ORP5-PTPIP51 als ORP8-PTPIP51 paren, en hun gemiddelde aantallen waren vergelijkbaar met het ORP5-ORP8 PLA-paar, wat de ORP5- en ORP8-lokalisatie bij ER-mitochondriale MCS'en bevestigde (figuur 3).
Ten slotte waren we in recente werken van ons laboratorium, door een vergelijkbare aanpak te gebruiken in HeLa-cellen getransfecteerd met PHPLCd-RFP of mcherry-PLN1 om respectievelijk de PM of LD te markeren, het optreden van ORP5-ORP8 PLA-interacties bij ER-PM-contacten te analyseren en een driewegcontactplaats tussen mitochondriën, het ER en LDs te identificeren (figuur 4)15, 17.
Figuur 1: Workflow voor de identificatie van PLA-signalen in de nabijheid van de mitochondriën. Eerst worden de confocale stapels gesegmenteerd om de PLA-foci (vlekken) en het mitochondriale netwerk (oppervlakken) te identificeren. Vervolgens worden 3D-afstandskaarten berekend naar de buitenkant van de oppervlakken (mitochondriën), waardoor de afstand van elke plek tot het dichtstbijzijnde mitochondrion kan worden gemeten. Ten slotte worden PLA-vlekken ingedeeld in twee populaties (rood en groen) op basis van een nabijheidsdrempel van 380 nm die is vastgesteld op basis van de precisie van het detectiesysteem. Dit cijfer is gewijzigd vanMonteiro-Cardoso et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van het ORP5-ORP8-complex uitgedrukt op endogene niveaus die lokaliseren bij ER-mitochondriale contacten. (A) ORP5-ORP8 PLA confocale serie en respectievelijke 3D-reconstituties. Schaalbalken: 10 μm en 2 μm (uitgebreide afbeeldingen). (B) Kwantificering van ORP5-ORP8 PLA foci in nauw contact met mitochondriën. Endo, n = 33 cellen, en Overexp ORP5+ORP8, n = 27 cellen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (standaardfout van het gemiddelde). Deze afbeelding is aangepast van Monteiro-Cardoso et al.15. (C) Kwantificering van de totale ORP5-ORP8 PLA foci. Endo, n = 38 cellen, siORP5+siORP8, n = 38 cellen en Overexp ORP5+ORP8, n = 35 cellen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (standaardfout van het gemiddelde). Deze afbeelding is aangepast van Monteiro-Cardoso et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beelden van PLA-signalen tussen ORP5 of ORP8 met het mitochondriale eiwit PTPIP51. (A) Confocale reeksen werden gebruikt om 3D-reconstituties en afstandskaarten te genereren om te bevestigen dat ORPR5- of ORP8 PLA-interacties met PTPIP51 optreden bij nauwe contacten tussen ER-mitochondriën. Schaalbalken: 10 μm en 2 μm (uitgebreide afbeeldingen). (B) PTPIP51 immunofluorescentie confocale beelden (enkel brandpuntsvlak) in controle en HeLa-cellen behandeld met siRNA gericht PTPIP51. Schaalbalken: 10 μm en 2 μm (uitgebreide afbeeldingen). (C) ORP5-PTPIP51 en ORP8-PTPIP51 PLA confocale beelden in controle en HeLa-cellen behandeld met siRNA gericht PTPIP51. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeelden van 3D-reconstructies die zijn gebruikt om het ORP5-ORP8 PLA-complex te lokaliseren bij ER-PM- en ER-mitochondriën-LD-contacten. (A) Confocaal beeld en respectievelijke 3D-reconstitutie van een HeLa-cel met ORP5-ORP8 PLA, vertegenwoordigd door de groene vlekken, de PM gemarkeerd met PHPLCd-RFP, vertegenwoordigd door de rode cel, en mitochondriën gemarkeerd met Mito-BFP, weergegeven door blauwe oppervlakken. Linker en middelste afbeeldingen: weergave van de hele HeLa-cel. Rechterafbeelding: weergave van een ingezoomd gebied in de cel. (B) Confocaal beeld en respectievelijke 3D-reconstitutie van een ingezoomd gebied van een HeLa-cel met ORP5-ORP8 PLA, vertegenwoordigd door de groene vlekken, LDs gemarkeerd met mCherry-PLN1, weergegeven door de rode oppervlakken, en Mito-BFP, vertegenwoordigd door de blauwe oppervlakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is ontworpen om inter-organel eiwit PLA interacties bij MCS'en, in het bijzonder bij MERCSs, te identificeren en te kwantificeren. De nieuwigheid van het protocol is dat het PLA combineert met de etikettering van meerdere organellen, confocale microscopie en 3D-beeldanalyse om PLA-interacties tussen twee eiwitten in hetzelfde membraan te lokaliseren en te kwantificeren, in dit geval binnen het ER-membraan in de nabijheid van het membraan van mitochondriën (MAM) of met de MAM en LDs tegelijkertijd. Dit protocol kan worden gebruikt als een hulpmiddel om eiwitten te valideren die mogelijk lokaliseren bij specifieke MERCS'en, maar ook bij andere MCS'en.
Sinds de ontwikkeling in 2006 is PLA tussen een ER en een mitochondriaal eiwit op grote schaal gebruikt om MERCSs 7,9,10,11 te kwantificeren. Het gebruik van PLA als indicator van MERCS-abundantie in cellen moet echter zorgvuldig worden geverifieerd door benaderingen met een hoge resolutie. De ablatie van SAM50, een mitochondriaal eiwit dat geen invloed heeft op de abundantie van MERCS'en (zoals gekwantificeerd door elektronenmicroscopie)15, verandert bijvoorbeeld ook geen PLA-interacties tussen het ER-eiwit ORP8 en het mitochondriale eiwit TOM20, maar het vermindert PLA-interacties tussen ORP8 en het mitochondriale eiwit Metaxin2 zonder hun expressieniveaus te verminderen 15. Deze resultaten weerspiegelen dat PLA-interacties specifiek kunnen zijn voor het paar eiwitten dat in de test wordt gebruikt en niet kunnen worden gebruikt als de enige parameter om de abundantie van MERCS te beoordelen.
Niettemin is PLA een bewezen gevoelige benadering om in situ endogene eiwitinteracties te detecteren. In tegenstelling tot andere fluorescerende sonde-gebaseerde detectiemethoden, waaronder split-GFP en FRET, of beeldvormingsbenaderingen met hoge resolutie, vereist PLA niet de overexpressie van gelabelde eiwitten, waardoor inherente experimentele artefacten worden vermeden, zoals de wijziging van de fysieke eigenschappen van de beoogde organellen15. De detectie van eiwitinteracties door PLA biedt ook voordelen ten opzichte van andere immunodetectiemethoden, zoals co-immunoprecipitatie met western blot. Terwijl PLA de kwantificering van enkele fluorescentievlekken op eencellig niveau mogelijk maakt, vereist co-immunoprecipitatie een grote hoeveelheid biologisch materiaal en maakt het alleen de relatieve kwantificering mogelijk van het eiwit dat wordt geëxtraheerd uit een pool van heterogene cellen, waarvoor een geschikte belastingscontrole moeilijk te verkrijgen is15. Het bijkomende voordeel van het gebruik van PLA in combinatie met organelkleuring en confocale microscopie ten opzichte van co-immunoprecipitatie is dat de eerste benadering de lokalisatie van eiwitinteracties op subcellulair niveau mogelijk maakt.
Aan de andere kant zijn de prominente nadelen van dit protocol geassocieerd met het PLA-detectiebereik van ongeveer 40 nm, dat groter is dan MERCSs, en met de maximale resolutie die wordt bereikt door confocale microscopie van ongeveer 250 nm, waardoor het moeilijk is om contactlocaties ondubbelzinnig te identificeren. Hier werd echter een drempel van 380 nm gebruikt om de PLA-vlekken geassocieerd met mitochondriënoppervlakken te schatten op basis van de grootte van de PLA-reactie, inclusief de associatie van de primaire en secundaire antilichamen (30 nm) plus de helft van de FWHM van de PLA-amplificatiesignalen (350 nm). Een andere beperking van PLA houdt verband met het feit dat het alleen kan worden gebruikt in vaste monsters, en de verwerving van een duidelijk, specifiek en kwantificeerbaar PLA-signaal vereist de beschikbaarheid van antilichamen die zeer specifiek zijn voor het eiwit van belang15. Bovendien vereist de 3D-beeldvormingsanalyse voor afstandsschatting specifieke software die mogelijk niet in alle laboratoria direct beschikbaar is.
Met name enkele van de hierboven genoemde nadelen kunnen worden aangepakt door gebruik te maken van recent beschikbare technologieën. Conventionele confocale microscopie kan bijvoorbeeld worden vervangen door beeldvormingstechnieken met een hoger resolutieniveau, zoals Airyscan of gestructureerde verlichte microscopie (SIM)17, en het gebrek aan goede primaire antilichamen voor de eiwitten van belang kan worden ondervangen door endogene eiwitten stabiel te labelen met behulp van de CRISPR-Cas9-technologie18. Ten slotte kan de kwaliteit en specificiteit van de antilichamen en PLA-signalen worden geverifieerd met behulp van de volgende controles: 1) het testen van de primaire antilichamen door immunofluorescentie en western blot in controlecellen en in cellen waarin het eiwit van belang is uitgeput of overexpressie; 2) het uitvoeren van PLA in cellen waarin een of beide eiwitten van belang zijn uitgeput; 3) het uitvoeren van PLA in cellen die de eiwitten van belang co-overexpresseren; 4) het uitvoeren van PLA terwijl beide antilichamen voor de eiwitten van belang worden weggelaten; 5) het uitvoeren van PLA met slechts één van de twee antilichamen voor de eiwitten van belang; 6) het uitvoeren van PLA met incubatie met hetzelfde IgG als de soort waaruit de primaire antilichamen werden gegenereerd. Om hun specificiteit te beoordelen, werden de antilichamen die in dit protocol werden gebruikt, getest door immunofluorescentie en western blot in controlecellen en in cellen die werden behandeld met siRNA gericht op ORP5 15, ORP815 of PTPIP51 (figuur 3B en Guyard etal.17). Bovendien is de anti-ORP5- en anti-ORP8-specificiteit beoordeeld in cellen die EGFP-gelabelde ORP5 of ORP8 tot expressie brengen door de Pearson-coëfficiënt tussen het antilichaamdetectiesignaal en het EGFP-signaal15 te evalueren. De specifieke kenmerken van de anti-ORP5 15, anti-ORP8 15 en anti-PTPIP51 (figuur 1 en figuur 3C) antilichamen werden verder geanalyseerd in cellen waarin deze eiwitten waren uitgeput, wat leidde tot een afname van PLA-signalen. Van belang is dat de antilichaamconcentratie die geschikt is voor immunofluorescentiekleuring meestal ook geschikt is voor PLA; afhankelijk van de gebruikte antilichamen kunnen echter enkele aanpassingen in de blokkerende oplossing en/of in de antilichaamconcentraties worden aangebracht om de PLA-kleuring te verbeteren. De ORP5-ORP8 en ORP8-PTPIP51 PLA-kleuring werd verbeterd na aanpassing van de blokkeringsoplossing. Om mitochondriale en PLA-kleuring van hoge kwaliteit te verkrijgen, is het essentieel om confocale beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen met lage achtergrondsignalen, die belangrijk zijn om 3D-modulatie te vergemakkelijken. Confocale beelden met hoge achtergrondimpactdrempelaanpassingen beïnvloeden bijvoorbeeld de nauwkeurigheid van de 3D-modulatie van het mitochondriale netwerk of PLA.
Kortom, het hier gepresenteerde protocol maakt de lokalisatie en kwantificering mogelijk van PLA-eiwitinteracties op specifieke MERCS-subdomeinen (interacties tussen eiwitten gelokaliseerd in cis binnen hetzelfde membraan dat betrokken is bij MCS'en of tussen eiwitten gelokaliseerd in trans binnen de naast elkaar geplaatste membranen) door gebruik te maken van meercellige organellabeling en het genereren van afstandskaarten in 3D gereconstrueerde confocale beelden. Hoewel de hier beschreven procedures technisch eenvoudig en relatief snel zijn in vergelijking met andere methoden om eiwitinteracties bij MERCSs te detecteren, zijn de verkregen gegevens zeer reproduceerbaar. Bovendien is dit protocol net zo veelzijdig als de antilichamen die beschikbaar zijn voor de eiwitten van belang en als de markers die beschikbaar zijn om de organellen te kleuren. Daarom kan het worden toegepast op een breed scala aan paren eiwitten en verschillende organellen en MCS'en.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), het ATIP-Avenir Program, de Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548), en de Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plantenwetenschappen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
References
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287 (2019).
- Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
- Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
- Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).
- Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
- Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).
- Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).
- Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
- Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
- Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
- Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757 (2017).
- Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).
- Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).
- Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
