Summary
Потребность в новых подходах к изучению сайтов контакта мембран (МКС) возросла в связи с возрастающим интересом к изучению этих клеточных структур и их компонентов. Здесь мы представляем протокол, который объединяет ранее доступные технологии микроскопии для идентификации и количественного определения внутриорганелловых и межорганелловых белковых комплексов, которые находятся в MCS.
Abstract
Сайты контакта с мембраной (MCS) представляют собой области близкого расположения мембран, которые позволяют и регулируют динамический обмен различными биомолекулами (т.е. кальцием и липидами) между сопоставленными органеллами без участия слияния мембран. МКС необходимы для клеточного гомеостаза, а их функции обеспечиваются резидентными компонентами, которые часто существуют в виде мультимерных белковых комплексов. MCS часто вовлекают эндоплазматический ретикулум (ER), основной участок синтеза липидов и клеточного хранения кальция, и особенно важны для органелл, таких как митохондрии, которые исключены из классических везикулярных транспортных путей. В последние годы МКС между ЭР и митохондриями были широко изучены, поскольку их функции сильно влияют на клеточный метаболизм/биоэнергетику. В этих местах контакта начали идентифицироваться несколько белков, в том числе мембранные тросы, кальциевые каналы и белки переноса липидов, что повышает потребность в новых методологиях и технических подходах для изучения этих компонентов MCS. Здесь мы описываем протокол, состоящий из комбинированных технических подходов, которые включают анализ с бесконтактным лигированием (PLA), окрашивание митохондрий и сегментацию 3D-визуализации, которые позволяют обнаруживать белки, которые физически близки друг к другу (>40 нм) и находятся на одной мембране в ER-митохондриях MCS. Например, мы использовали два ER-закрепленных белка переноса липидов, ORP5 и ORP8, которые, как было показано ранее, взаимодействуют и локализуются в ER-митохондриях и ER-плазматических мембранах. Связав PLA ORP5-ORP8 с программным анализом программного обеспечения для визуализации клеток, удалось оценить расстояние комплекса ORP5-ORP8 от поверхности митохондрий и определить, что около 50% взаимодействия ORP5-ORP8 PLA происходит в субдоменах ER в непосредственной близости от митохондрий.
Introduction
Межорганеллярная коммуникация является определяющей характеристикой эукариотических клеток. Одним из способов, с помощью которого органеллы взаимодействуют, является образование участков мембранного контакта (MCS), которые представляют собой тесные мембранные оппозиции между двумя органеллами, которые поддерживаются структурными и функциональными белками, такими как связывания, белки переноса липидов и кальциевыеканалы. MCS могут устанавливаться между похожими или разными органеллами, и они опосредуют обмен клеточными компонентами, что важно для поддержания клеточного гомеостаза. На сегодняшний день идентифицировано несколько МКС, включая эндоплазматический ретикулум (ЭР)-митохондрии, ЭР-плазматическую мембрану (ПМ) и ЭР-липидно-капельные (ЛД) контакты1. Среди них те, которые образуются между ЭР и митохондриями (MERCS), являются одними из наиболее изученных, поскольку они участвуют в регуляции нескольких клеточных функций, включая липидный и кальциевый гомеостаз2. Поскольку митохондрии в значительной степени исключены из классических везикулярных транспортных путей, они полагаются на MERCS и их молекулярные составляющие для импорта ключевых липидов или предшественников липидов из ER. Невезикулярный транспорт этих липидов через MERCS обеспечивает поддержание надлежащего липидного состава митохондрий, а также их функциональной и структурной целостности3.
Учитывая решающее участие MCS в различных клеточных функциях, интерес к более глубокому пониманию их молекулярных компонентов значительно возрос в последние годы. Для углубления знаний о MCS было использовано несколько типов подходов, основанных на визуализации. Среди них флуоресцентный зондовый анализ с бесконтактным лигированием (PLA) широко используется в качестве индикатора обилия MCS путем обнаружения межорганелловых белок-белковых взаимодействий (в диапазоне обнаружения 40 нм) на эндогенных уровнях4. Например, MERCS были визуализированы и количественно оценены с помощью PLA между несколькими парами белков митохондрий-ER, включая VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 и PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Несмотря на то, что эта технология использовалась для обнаружения и количественной оценки межорганелловых белок-белковых взаимодействий, присутствующих в MCS 5,7,9,10,11, в большинстве исследований PLA не сочетали с окрашиванием органелл. Следовательно, количественный метод, позволяющий измерять близость между взаимодействиями PLA и ассоциированными органеллами, до сих пор не разработан. Таким образом, до сих пор в случае белков ER их взаимодействие внутри мембранных субдоменов, контактирующих с другими органеллами, не отличалось от их взаимодействия в широко распространенной сети ER.
В данной статье мы опишем протокол для обнаружения PLA-взаимодействий между белками, находящимися в мембране одной и той же органеллы, и анализа их близости к мембране органеллы-партнера в MCS. Этот протокол был разработан на основе двух предпосылок: 1) предыдущие исследования, показывающие, что в условиях гиперэкспрессии белки переноса липидов ER ORP5 и ORP8 совместно локализуются и взаимодействуют в ER-митохондриях и ER-PM MCS 12,13,14,15 и что ORP5 локализуется в контактах ER-LD 16,17; 2) существующие технологии, включая PLA, конфокальную микроскопию, мечение органелл и анализ 3D-изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Митохондриальное окрашивание и анализ с бесконтактным лигированием (PLA)
- Планшет 0,5 x 10 5-2 x 10 5 клеток HeLa, поддерживаемых в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина и 1% заменимых аминокислот при 37 °C с 5% CO2, в стеклянных покровных стеклах диаметром 13 мм в1,5 в 24-луночных планшетах при разведении, обеспечивающем слияние 75%-90% клеток в день процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что клетки HeLa могут быть подвергнуты дополнительному лечению, такому как лечение миРНК и/или трансфекция плазмиды ДНК, перед окрашиванием митохондриями и PLA. - Митохондриальное окрашивание
- Промойте клетки один раз в предварительно разогретой до 37 °C среде без сыворотки. Инкубируют клетки в предварительно подогретой безсывороточной среде в течение 10 мин при 37 °C с 5%СО2.
- Приготовьте 1 мкМ красный митохондриальный маркер в предварительно подогретой безсывороточной среде.
- Инкубируют клетки с 500 мкл раствора митохондриальных маркеров в течение 30 мин при 37 °C с 5% CO2. Во время обработки митохондриальными маркерами и последующих шагов протокола держите клетки на покровных стеклах максимально защищенными от света.
- После инкубации промывают клетки 1 раз в предварительно подогретой безсывороточной среде и 2 раза в 1 растворе в фосфатно-солевом буфере (PBS). Выполняйте этот шаг как можно быстрее, так как длительные этапы промывки перед фиксацией могут повлиять на морфологию митохондрий.
- Удалите 1x PBS с покровных стекол и зафиксируйте клетки, инкубируя их в свежеприготовленном 4% PFA (в 1x PBS) в течение 30 минут при комнатной температуре (в темноте) под химическим колпаком. Промывайте 3 раза в течение 2 минут в 500 мкл 1x PBS (с помощью одноразовых пипеток или вакуумной системы, подключенной к насосу).
- Извлеките 1x PBS и инкубируйте покровные стекла с 500 мкл 50 мМ NH4Cl в течение 15 минут при комнатной температуре (в темноте). Промыть 1x в течение 2 минут в 500 мкл 1x PSB с помощью вакуумной системы.
- Промыть 3 раза в течение 2 мин в 500 мкл блокирующего буфера 1 (BB1, 1% BSA, 0,1% сапонин в 1x PBS) для ORP5-ORP8 PLA или блокирующего буфера 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% нормальной козьей сыворотки, 0,1 сапонина в 1x PBS) для ORP8-PTPIP51 PLA.
- Переложите покровные стекла с 24-луночной пластины во влажную камеру. После переноса покровных стекол в камеру добавьте 100 мкл BB (BB1 или BB2, в зависимости от используемых пар антител), чтобы избежать сухости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Камеру влажности, защищенную от света, можно легко и быстро получить, завернув чашку Петри (пластиковую или стеклянную) в алюминиевую фольгу и добавив несколько кусочков влажного бумажного полотенца по периферии чашки Петри.
- Анализ на бесконтактное лигирование (PLA)
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол PLA соответствует инструкциям производителя с небольшими изменениями.- Инкубация первичных антител
- Приготовьте рабочий раствор первичных антител. Разбавьте анти-ORP5 кролика (1:150) плюс мышиный анти-ORP8 (1:200) в BB1, мышиный анти-ORP8 (1:200) плюс кроличий анти-PTPIP51 (1:200) в BB2 и кролик анти-ORP5 (1:150) плюс мышиный анти-PTPIP51 (1:200) в BB1. Приготовьте (не менее) 40 мкл раствора первичных антител на покровное стекло (например, 0,27 мкл кроличьего анти-ORP5, 0,2 мкл мышиного анти-ORP8, 39,53 мкл BB1).
- Удалите BB из предыдущей промывки (шаг 1.2.8) с помощью вакуумной системы и добавьте 40 мкл раствора первичных антител к покровным стеклам. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре в защищенной от света влажной камере.
- Промывайте покровные стекла 3 раза в течение 5 минут 100 мкл соответствующего BB с помощью вакуумной системы.
- Инкубация зонда PLA
- Приготовьте рабочий раствор зондов PLA. Разведите кроличьи щупы PLA PLUS (1:5) и мышиного MINUS (1:5) в BB и перемешайте. Для каждого покровного стекла приготовьте (не менее) 40 мкл раствора зонда PLA (например, 8 мкл кроличьего зонда PLUS PLA, 8 мкл мышиного зонда MINUS PLA, 24 мкл BB). Перед использованием дайте раствору зонда PLA постоять 20 минут при комнатной температуре.
- Удалите BB с покровных стекол (из шага 1.3.2) с помощью вакуумной системы и добавьте 40 мкл раствора зонда PLA к покровным стеклам. Инкубировать в течение 1 ч при температуре 37°C во влажностной камере, защищенной от света.
- Промывайте покровные стекла 2 раза в течение 5 минут в 100 мкл 1x буфера для промывки А при комнатной температуре.
- Лигатура
- Разведите 5-кратный лигирующий буфер до 1:5 в сверхчистой воде и перемешайте. Для каждого покровного стекла приготовьте (не менее) 40 мкл лигового раствора (8 мкл 5-кратного лигаторного буфера, 31 мкл сверхчистой воды).
- Добавьте лигазу (1 Ед/мкл, входит в комплект PLA) к 1 лигированному буферу, приготовленному на предыдущем этапе, в разведении 1:40, и перемешайте.
- С помощью вакуумной системы удалить 1 промывочный буфер А (из шага 1.3.4), добавить к покровным стеклам 40 мкл раствора лигазы и инкубировать в течение 30 мин при температуре 37 °C во влажностной камере, защищенной от света.
- Промыть покровные стекла 2 раза в течение 2 минут в 100 мкл 1x буфера для промывки A при комнатной температуре с помощью вакуумной системы.
- Полимеризация
- Разбавьте 5-кратный буфер усиления 1:5 в сверхчистой воде и перемешайте. Для каждого покровного стекла приготовьте (не менее) 40 мкл раствора для амплификации (8 мкл буфера для амплификации 5x, 31,5 мкл сверхчистой воды).
- Добавьте полимеразу (10 Ед/мкл, входит в комплект PLA) к полимеризационному буферу 1x, приготовленному на предыдущем этапе, в разбавлении 1:80, и перемешайте.
- С помощью вакуумной системы удалить 1 промывочный буфер А (из шага 1.3.6), добавить к покровным стеклам 40 мкл раствора полимеразы и инкубировать в течение 1 ч 40 мин при 37 °C во влажностной камере, защищенной от света.
- Удалить раствор полимеразы с покровных стекол и промыть 2 раза в течение 10 мин в 100 мкл 1 промывочного буфера B при комнатной температуре во влажностной камере, защищенной от света.
- Промыть покровные стекла 1 раз в течение 1 мин в 100 мкл 0,001 промывочного буфера B при комнатной температуре в камере влажности, защищенной от света.
- Устанавливают покровные стекла на предметные стекла для микроскопии, используя монтажную среду с DAPI (концентрация 1,6-0,4 мкг/мл). Запечатайте лаком для ногтей.
- Инкубация первичных антител
2. Получение изображения
- Наблюдайте за результатами PLA и получайте изображения с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии с 63-кратным объективом для погружения в масло с помощью прилагаемого программного обеспечения.
- Установите возбуждение флуоресценции с помощью лазерного диода с длиной волны 405 нм или лазера белого света и соберите спектральные окна с помощью GaAsP PMT или гибридных детекторов. В каждой фокальной плоскости (300 нм) регистрируются флуоресцентные сигналы для PLA (λex = 488 нм, λem = 505-560 нм) и митохондрий (λex = 543 нм, λem = 606-670 нм).
3. Обработка изображений и оценка пятен PLA, ассоциированных с митохондриями
- Обработайте конфокальные изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений, которое генерирует карты расстояний между клеточными компонентами. Выполните следующие действия, чтобы создать 3D-реконструкцию пятен PLA и митохондриальной сети и получить доступ к расстоянию между ними с помощью программного обеспечения для визуализации клеток (рис. 1).
- Установка расширения 3D карты расстояний
- Установите как пакет программного обеспечения для анализа клеток с опцией XT, так и программное обеспечение MATLAB или только среду выполнения компилятора MATLAB (MRC), которую можно бесплатно загрузить с веб-сайта.
- Настройте программное обеспечение для анализа ячеек на запуск MATLAB при запуске XTension следующим образом: в меню Imaris (Mac OS X) или Edit (Windows) выберите Preferences, перейдите на панель Custom Tools , а затем задайте путь:
C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe для Windows или/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab для Mac OS X.
- Импортируйте изображения в программное обеспечение
- Преобразуйте изображения конфокального стека в . IMS, либо непосредственно через раздел Arena, либо с помощью автономного конвертера файлов , который позволяет выполнять пакетное преобразование.
- После импорта убедитесь, что изображения остаются правильно откалиброванными. Нажмите кнопку Edit > Image Properties > Image Geometry и убедитесь, что размер воксела соответствует в X и Y размеру пикселя, ожидаемому для фактического изображения (см. калибровку изображения в программном обеспечении для съемки), и что размер воксела в Z соответствует шагу, приложенному микроскопом для создания Z-стека. Если значения неверны, измените их, чтобы обеспечить правильную оценку расстояний на следующих шагах.
- Отрегулируйте контрастность различных каналов в меню Display Adjustment, нажав на Edit > Show Display Adjustment. Настройте каждый канал независимо, чтобы оптимизировать отображение каждого цвета. Этот шаг не влияет напрямую на значения изображения, но необходим для установки точных пороговых значений или обнаружения слабых объектов.
- Ограничьте анализ одной ячейкой, обрезав изображение с помощью опций Редактировать > Обрезать 3D. Чтобы проанализировать другую ячейку в том же поле зрения, откройте то же изображение еще раз и обрежьте его по-другому.
- Обнаружение пятен ORP5-ORP8
- Чтобы обнаружить сигналы PLA, сгенерированные в месте взаимодействия ORP5 и ORP8, нажмите на опцию Add New Spots , которая создает новый набор объектов и открывает мастер обнаружения пятен.
- Выберите канал, на котором должно выполняться точечное обнаружение.
- Отрегулируйте предполагаемый диаметр XY (диапазон должен быть скорректирован, если размер объекта отличается), чтобы помочь алгоритму обнаружения пятен найти интересующие объекты. Обратите внимание, что если выбранное значение слишком велико, соседние объекты будут объединены. Если значение слишком мало, один сигнал может рассматриваться как несколько объектов, или могут быть обнаружены аберрантные сигналы.
- Нажмите на Вычитание фона , чтобы удалить фон изображения перед обнаружением пятна и усилить локальный контраст вокруг интересующих объектов.
- Отрегулируйте порог обнаружения пятен, сохранив качество (интенсивность в центре объекта) в качестве параметра порога и программного автоматического порога, или немного измените это значение, чтобы обнаружить все объекты. После завершения обнаружения пятен сохраните параметры обнаружения и повторно используйте их для обработки других изображений.
- Обнаружение митохондриальных сетей
- Найдите митохондриальную сеть для создания рендеринга поверхности, щелкнув Add new Surfaces , чтобы создать новый объект, и откройте мастер обнаружения поверхности.
- Выберите канал, на котором должно быть выполнено создание поверхности.
- Примените фильтр по Гауссу, чтобы получить более гладкую поверхность, установив флажок Сглаживание (Smooth ) и установив пороговое значение, указывающее мельчайшие детали, наблюдаемые на поверхности.
- Выполните вычитание фона, чтобы усилить локальные контрасты и помочь с пороговым шагом.
- Отрегулируйте порог для обнаружения митохондриальной сети в зависимости от интенсивности сигнала. Если сложно правильно установить порог, рекомендуется вернуться к предыдущему шагу, чтобы отрегулировать степень сглаживания и вычитания фона.
- При необходимости нанесите на поверхность фильтр для удаления мелких остатков, образовавшихся от порога. Для этого выберите фильтр Number of Voxels в окне классификации поверхности и поиграйте с верхним и нижним порогами, чтобы оставить только интересующие объекты. После завершения создания поверхности сохраните параметры создания и повторно используйте их для обработки других изображений.
- Генерация 3D-карты расстояний вокруг митохондрий
- Создайте карту расстояний за пределами митохондриальной поверхности, созданную ранее, следующим образом. Выберите поверхность митохондрий в окне дерева сцены. Нажмите на Image Processing > Surfaces Function > Distance Transformation. Это вызовет Matlab XTension, который попросит пользователя выбрать, должна ли карта вычисляться снаружи или внутри поверхности объекта.
- Выберите Outside Surface Object, чтобы измерить расстояние между пятнами PLA и поверхностью митохондрий. После создания карта расстояний отображается в виде нового канала на панели настройки отображения. В этом канале каждый пиксель имеет значение, соответствующее расстоянию до ближайшей митохондрии.
- Выделение расстояний объектов от ближайших митохондрий
- Чтобы измерить расстояние от каждой точки до ближайшей митохондрии, а также определить и визуализировать ближайшие из них, выберите точки, ранее созданные в поле дерева сцены.
- В статистике и подробном журнале выберите Конкретные значения (Specific Values ) (чтобы получить по одному измерению для каждой точки). Выберите Center Intensity Ch=X (где X соответствует номеру канала карты расстояний). Это позволит измерить значение центра каждой точки, которое соответствует его расстоянию до ближайшей митохондрии на карте расстояний.
- Экспортируйте данные в виде файла .csv, нажав на значок дискеты в левом нижнем углу окна.
- Чтобы извлечь подпопуляцию пятен на основе их расстояний до митохондрий, выберите пятна в дереве сцены и щелкните вкладку Фильтры .
- В этом окне добавьте новый фильтр, основанный на Center Intensity Ch=X, и извлеките пятна на расстоянии менее 380 нм от митохондрий, установив нижний порог на 0 мкм и верхний порог на 0,380 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порог в 380 нм был оценен на основе реакции PLA, включающей ассоциацию между первичными и вторичными антителами (30 нм) плюс половина полной ширины при половине максимума (FWHM) сигналов усиления PLA (350 нм). - Чтобы сфокусироваться на выделенных пятнах и, например, придать им особый цвет, выполните шаг дублирования, нажав кнопку «Дублировать выделение в новые области ».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью описанного выше протокола мы выявили сайты взаимодействия двух ER-закрепленных белков переноса липидов ORP5 и ORP8 и оценили их встречаемость в мембранных субдоменах ER, контактирующих с другими органеллами, в частности, с митохондриями. Для этого митохондриальная сеть в клетках HeLa была окрашена красным митохондриальным маркером, а зеленые пятна ORP5-ORP8 PLA были обнаружены после фиксации с помощью первичных антител анти-ORP5 и анти-ORP8, специфичность которых ранее проверялась методом иммунофлуоресценции15. Конфокальные изображения показали, что эндогенные взаимодействия ORP5-ORP8 PLA в клетках HeLa происходили в ретикулярной ER, кортикальной ER и в субдоменах ER в тесном контакте с митохондриями, обычно называемых митохондриально-ассоциированными ER-мембранами (MAMs; Рисунок 2А). Для количественной оценки взаимодействий ORP5-ORP8 PLA, происходящих в MAM, расстояние каждого пятна PLA от митохондрий было оценено с помощью анализа 3D-изображений. Используя порог расстояния 380 нм, анализ 3D-визуализации показал, что около 50% эндогенных взаимодействий ORP5-ORP8 PLA были обнаружены в MAM (рис. 2A,B). Остальные 50% взаимодействий были распределены между кортикальным и ретикулярным ER15. Чтобы подтвердить специфичность PLA, эксперименты ORP5-ORP8 PLA были проведены либо в клетках, обработанных миРНК, нацеленными на ORP5 и ORP8 (отрицательный контроль), либо на клетках, совместно экспрессирующих ORP5 и ORP8 (положительный контроль). Даунрегуляция ORP5 и ORP8 индуцировала массовое снижение общего количества сигналов PLA (в MAM, в ретикулярной ER и в кортикальной ER; 2A,C), в то время как их совместная экспрессия приводила к увеличению PLA (рис. 2A,C), подтверждая специфичность ORP5-ORP8 PLA. Тем не менее, интересно, что процент ORP5-ORP8 PLA взаимодействий, происходящих в MAM в клетках с ко-гиперэкспрессией ORP5 и ORP8, был аналогичен тому, который наблюдался в клетках, где эти белки экспрессировались на эндогенных уровнях (рис. 2B), что подтверждает их существование в качестве комплекса в MAM. Для дальнейшего подтверждения присутствия ORP5 и ORP8 в мембранных субдоменах ER, находящихся в тесном контакте с митохондриями, был проведен дополнительный количественный анализ PLA между ORP5 или ORP8 и внешним белковым PTPIP51 митохондриальной мембраны, известным партнером по связыванию ORP5 и ORP813. Сигналы PLA были обнаружены как в парах ORP5-PTPIP51, так и в парах ORP8-PTPIP51, и их средние значения были аналогичны паре ORP5-ORP8 PLA, подтверждая локализацию ORP5 и ORP8 в МКС ER-митохондрий (рис. 3).
Наконец, в недавних работах нашей лаборатории, используя аналогичный подход в клетках HeLa, трансфицированных PHPLCd-RFP или mcherry-PLN1 для маркировки PM или LD соответственно, мы смогли проанализировать возникновение взаимодействий ORP5-ORP8 PLA в контактах ER-PM и идентифицировать трехсторонний сайт контакта между митохондриями, ER и LDs (рис. 4)15. 17. См.
Рисунок 1: Рабочий процесс для идентификации сигналов PLA в непосредственной близости от митохондрий. Во-первых, конфокальные стеки сегментируются для идентификации фокусов (пятен) PLA и митохондриальной сети (поверхностей). Затем вычисляются 3D-карты расстояний по направлению к внешней стороне поверхностей (митохондрий), что позволяет измерить расстояние от каждого пятна до ближайшей митохондрии. Наконец, пятна PLA классифицируются на две популяции (красную и зеленую) на основе порога близости 380 нм, установленного на основе точности системы обнаружения. Эта цифра была изменена по материалам Monteiro-Cardoso et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения комплекса ORP5-ORP8, экспрессируемого на эндогенных уровнях, локализующихся в контактах ER-митохондрий. (A) Конфокальная серия ORP5-ORP8 PLA и соответствующие 3D-реконструкции. Масштабные линейки: 10 мкм и 2 мкм (расширенные изображения). (B) Количественное определение очагов ORP5-ORP8 PLA в тесном контакте с митохондриями. Endo, n = 33 клетки, и Overexp ORP5+ORP8, n = 27 клеток. Данные представлены в виде среднего ± SEM (стандартная ошибка среднего). Это изображение было изменено по материалам Monteiro-Cardoso et al.15. (C) Количественная оценка общего количества очагов ORP5-ORP8 PLA. Endo, n = 38 клеток, siORP5+siORP8, n = 38 клеток и Overexp ORP5+ORP8, n = 35 клеток. Данные представлены в виде среднего ± SEM (стандартная ошибка среднего). Это изображение было изменено по материалам Monteiro-Cardoso et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения сигналов PLA между ORP5 или ORP8 с митохондриальным белком PTPIP51. (A) Конфокальные серии были использованы для создания 3D-реконституций и карт расстояний, чтобы подтвердить, что взаимодействие ORPR5 или ORP8 PLA с PTPIP51 происходит при тесных контактах ER-митохондрий. Масштабные линейки: 10 мкм и 2 мкм (расширенные изображения). (B) PTPIP51 иммунофлуоресцентные конфокальные изображения (одна фокальная плоскость) в контроле и клетках HeLa, обработанных миРНК-таргетными PTPIP51. Масштабные линейки: 10 мкм и 2 мкм (расширенные изображения). (C) Конфокальные изображения ORP5-PTPIP51 и ORP8-PTPIP51 PLA в контроле и клетки HeLa, обработанные миРНК-таргетными PTPIP51. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Примеры 3D-реконструкций, используемых для локализации комплекса ORP5-ORP8 PLA на контактах ER-PM и ER-митохондрии-LD. (A) Конфокальное изображение и соответствующее 3D-восстановление клетки HeLa с ORP5-ORP8 PLA, представленным зелеными пятнами, PM, отмеченным PHPLCd-RFP, представленным эритроцитами, и митохондриями, отмеченными Mito-BFP, представленными синими поверхностями. Слева и в центре: изображение всей ячейки HeLa. Изображение справа: изображение увеличенной области внутри ячейки. (B) Конфокальное изображение и соответствующее 3D-воссоздание увеличенной области клетки HeLa с ORP5-ORP8 PLA, представленным зелеными пятнами, LD, отмеченными mCherry-PLN1, представленными красными поверхностями, и Mito-BFP, представленным синими поверхностями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол был разработан для идентификации и количественной оценки межорганелловых взаимодействий белков PLA в MCS, в частности в MERCS. Новизна протокола заключается в том, что он сочетает PLA с мечением нескольких органелл, конфокальной микроскопией и анализом 3D-изображений для локализации и количественной оценки PLA-взаимодействий между двумя белками, находящимися в одной и той же мембране, в данном случае в пределах мембраны ER в непосредственной близости от мембраны митохондрий (MAM) или с MAM и LDs одновременно. Этот протокол может быть использован в качестве инструмента для валидации белков, которые потенциально локализуются в определенных MERCS, а также в других MCS.
С момента своей разработки в 2006 году PLA между ER и митохондриальным белком широко использовался для количественного определения MERCS 7,9,10,11. Тем не менее, использование PLA в качестве индикатора обилия MERCS в клетках должно быть тщательно проверено с помощью подходов с высоким разрешением. Например, абляция SAM50, митохондриального белка, который не влияет на количество MERCS (количественно определяемое с помощью электронной микроскопии)15, также не изменяет PLA-взаимодействия между белком ER ORP8 и митохондриальным белком TOM20, но уменьшает взаимодействия PLA между ORP8 и митохондриальным белком Metaxin2 без снижения уровня их экспрессии.. Эти результаты показывают, что взаимодействия PLA могут быть специфичными для пары белков, используемых в анализе, и не могут быть использованы в качестве единственного параметра для оценки распространенности MERCS.
Тем не менее, PLA является доказанным чувствительным подходом к обнаружению in situ эндогенных белковых взаимодействий. В отличие от других методов детектирования на основе флуоресцентных зондов, включая расщепление GFP и FRET, или подходы к визуализации с высоким разрешением, PLA не требует гиперэкспрессии меченых белков, избегая присущих экспериментальных артефактов, таких как изменение физических свойств целевых органелл15. Обнаружение белковых взаимодействий с помощью PLA также имеет преимущества по сравнению с другими методами иммунодетекции, такими как коиммунопреципитация с вестерн-блоттингом. В то время как PLA позволяет количественно определять одиночные флуоресцентные пятна на уровне одной клетки, коиммунопреципитация требует большого количества биологического материала и позволяет проводить только относительное количественное определение белка, извлеченного из пула гетерогенных клеток, для котороготрудно получить соответствующий контроль нагрузки. Дополнительным преимуществом использования PLA в сочетании с окрашиванием органелл и конфокальной микроскопией перед коиммунопреципитацией является то, что первый подход позволяет локализовать белковые взаимодействия на субклеточном уровне.
С другой стороны, заметные недостатки этого протокола связаны с дальностью обнаружения PLA около 40 нм, что больше, чем у MERCS, и с максимальным разрешением, достигаемым конфокальной микроскопией около 250 нм, что затрудняет однозначную идентификацию мест контакта. Однако здесь порог в 380 нм был использован для оценки пятен PLA, связанных с поверхностями митохондрий, на основе размера реакции PLA, включая ассоциацию первичных и вторичных антител (30 нм) плюс половину FWHM сигналов амплификации PLA (350 нм). Еще одно ограничение PLA связано с тем, что его можно использовать только в фиксированных образцах, а получение отчетливого, специфического и поддающегося количественной оценке сигнала PLA требует наличия антител, которые высокоспецифичны к интересующему белку15. Кроме того, для анализа 3D-изображений для оценки расстояния требуется специальное программное обеспечение, которое может быть доступно не во всех лабораториях.
Примечательно, что некоторые из упомянутых выше недостатков могут быть устранены с помощью недавно появившихся технологий. Например, традиционная конфокальная микроскопия может быть заменена методами визуализации с более высоким уровнем разрешения, такими как Airyscan или структурированная иллюминированная микроскопия (SIM)17, а недостаток хороших первичных антител к интересующим белкам может быть преодолен путем стабильного мечения эндогенных белков с помощью технологии CRISPR-Cas918. Наконец, качество и специфичность антител и сигналов PLA могут быть проверены с помощью следующих контрольных инструментов: 1) тестирование первичных антител методом иммунофлуоресценции и вестерн-блоттинга в контрольных клетках и в клетках, в которых интересующий белок был истощен или чрезмерно экспрессирован; 2) выполнение PLA в клетках, в которых один или оба интересующих белка истощены; 3) выполнение PLA в клетках, совместно экспрессирующих интересующие белки; 4) выполнение PLA с пропуском обоих антител к интересующим белкам; 5) выполнение PLA с использованием только одного из двух антител к интересующим белкам; 6) проведение PLA с инкубацией с теми же IgG, что и виды, из которых были получены первичные антитела. Для оценки их специфичности антитела, использованные в этом протоколе, были протестированы методом иммунофлуоресценции и вестерн-блоттинга в контрольных клетках и в клетках, которые были обработаны миРНК, нацеленной на ORP5 15, ORP815 или PTPIP51 (рис. 3B и Guyard et al.17). Кроме того, специфичность анти-ORP5 и анти-ORP8 была оценена в клетках, экспрессирующих ORP5 или ORP8, меченые EGFP, путем оценки коэффициента Пирсона между сигналом обнаружения антител и сигналом EGFP15. В дальнейшем была проанализирована специфичность антител к ORP515, анти-ORP815 и анти-PTPIP51 (рис. 1 и рис. 3C) в клетках, в которых эти белки были истощены, что приводило к снижению сигналов PLA. Следует отметить, что концентрация антител, подходящая для иммунофлуоресцентного окрашивания, обычно также подходит для PLA; однако, в зависимости от используемых антител, могут быть сделаны некоторые корректировки в блокирующем растворе и/или в концентрациях антител для улучшения окрашивания PLA. Окрашивание ORP5-ORP8 и ORP8-PTPIP51 PLA было улучшено после корректировки блокирующего раствора. Для получения качественного митохондриального и PLA окрашивания необходимо получить высококачественные конфокальные изображения с низким фоновым сигналом, что важно для облегчения 3D-модуляции. Например, конфокальные изображения с высоким фоном влияют на пороговые корректировки и, следовательно, влияют на точность 3D-модуляции митохондриальной сети или PLA.
В заключение, протокол, представленный здесь, позволяет локализовать и количественно определить взаимодействия белков PLA в конкретных поддоменах MERCS (взаимодействия между белками, локализованными в цис-образной мембране в пределах одной и той же мембраны, участвующими в MCS, или между белками, локализованными в транс-мембранах ) с помощью мечения многоклеточных органелл и создания карт расстояний на 3D-реконструированных конфокальных изображениях. Несмотря на то, что описанные здесь процедуры технически просты и относительно быстры по сравнению с другими методологиями обнаружения белковых взаимодействий в MERCS, полученные данные обладают высокой воспроизводимостью. Кроме того, этот протокол так же универсален, как и антитела, доступные для интересующих белков, и как маркеры, доступные для окрашивания органелл. Таким образом, он может быть применен к широкому спектру пар белков и нескольких органелл и MCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), программой ATIP-Avenir, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) и Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Науки о растениях Сакле).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
References
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287 (2019).
- Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
- Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
- Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).
- Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
- Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).
- Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).
- Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
- Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
- Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
- Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757 (2017).
- Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).
- Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).
- Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
