Summary
막 접촉 부위(MCS)를 연구하기 위한 새로운 접근법의 필요성은 이러한 세포 구조와 그 구성 요소 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 증가했습니다. 여기에서는 MCS에 상주하는 세포 소기관 내 및 세포 기관 간 단백질 복합체를 식별하고 정량화하기 위해 이전에 사용 가능한 현미경 기술을 통합하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
막 접촉 부위(MCS)는 막 융합을 포함하지 않고 병치된 세포 기관 사이의 다양한 생체 분자(즉, 칼슘 및 지질)의 동적 교환을 허용하고 조절하는 가까운 막 근접 영역입니다. MCS는 세포 항상성에 필수적이며, 그 기능은 종종 다량체 단백질 복합체로 존재하는 상주 성분에 의해 보장됩니다. MCS는 종종 지질 합성 및 세포 칼슘 저장의 주요 부위인 소포체(ER)를 포함하며, 고전적인 소포 수송 경로에서 제외되는 미토콘드리아와 같은 세포 소기관에 특히 중요합니다. 지난 몇 년 동안 ER과 미토콘드리아 사이의 MCS는 그 기능이 세포 대사/생체 에너지에 큰 영향을 미치기 때문에 광범위하게 연구되었습니다. 이러한 접촉 부위에서 막 밧줄, 칼슘 채널 및 지질 전달 단백질을 포함한 여러 단백질이 확인되기 시작했으며, 따라서 이러한 MCS 구성 요소를 연구하기 위한 새로운 방법론과 기술적 접근의 필요성이 높아졌습니다. 여기에서는 근접 결찰 분석(PLA), 미토콘드리아 염색 및 3D 이미징 분할을 포함하는 결합된 기술 접근 방식으로 구성된 프로토콜을 설명하며, 이를 통해 물리적으로 서로 가까운(>40nm) 단백질을 검출할 수 있으며 ER-미토콘드리아 MCS에서 동일한 멤브레인에 상주합니다. 예를 들어, 우리는 이전에 ER-미토콘드리아 및 ER-원형질막 MCS에서 상호 작용하고 국소화되는 것으로 밝혀진 두 개의 ER 고정 지질 전달 단백질인 ORP5 및 ORP8을 사용했습니다. ORP5-ORP8 PLA를 세포 이미징 소프트웨어 분석과 연관시킴으로써, 미토콘드리아 표면으로부터 ORP5-ORP8 복합체의 거리를 추정하고, ORP5-ORP8 PLA 상호작용의 약 50%가 미토콘드리아에 근접한 ER 서브도메인에서 발생한다는 것을 결정할 수 있었다.
Introduction
세포 기관 간 통신은 진핵 세포의 특징입니다. 세포 소기관이 소통하는 한 가지 방법은 밧줄, 지질 전달 단백질 및 칼슘 채널과 같은 구조적 및 기능적 단백질에 의해 유지되는 두 세포 기관 사이의 가까운 막 대립인 막 접촉 부위(MCS)를 형성하는 것입니다1. MCS는 유사하거나 다른 세포 기관 사이에서 확립될 수 있으며 세포 항상성을 유지하는 데 중요한 세포 구성 요소의 교환을 매개합니다. 현재까지 소포체(ER)-미토콘드리아, ER-원형질막(PM) 및 ER-지질 액적(LD) 접촉을 포함한 여러 MCS가 확인되었습니다1. 그 중 ER과 미토콘드리아 사이에 형성되는 것들(MERCS)은 지질과 칼슘 항상성을 포함한 여러 세포 기능의 조절에 관여하기 때문에 가장 많이 연구된 것 중 하나이다2. 미토콘드리아는 고전적인 소포 수송 경로에서 크게 제외되기 때문에 MERCS와 분자 성분에 의존하여 ER에서 주요 지질 또는 지질 전구체를 가져옵니다. MERCS를 통한 이러한 지질의 비소포 수송은 적절한 미토콘드리아 지질 조성과 기능적 및 구조적 완전성의 유지를 보장합니다3.
다종 화학 물질 민감증이 다양한 세포 기능에 결정적으로 관여한다는 점을 감안할 때, 다종 화학 물질의 분자 성분에 대한 더 깊은 이해를 제공하는 데 대한 관심이 지난 몇 년 동안 크게 증가했습니다. MCS에 대한 지식을 발전시키기 위해 여러 유형의 이미징 기반 접근 방식이 사용되었습니다. 그 중 형광 프로브 기반 근접 결찰 분석법(PLA)은 내인성 수준에서 세포 소기관 간 단백질-단백질 상호작용(검출 범위 40nm)을 검출하여 MCS의 풍부도를 나타내는 지표로 널리 사용되고 있다4. 예를 들어, MERCS는 VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 및 PTPIP51-VAPB 5,6,7,8을 포함한 여러 미토콘드리아-ER 단백질 쌍 사이의 PLA를 사용하여 시각화 및 정량화되었습니다. 이 기술은 MCS 5,7,9,10,11에 존재하는 세포 소기관 간 단백질-단백질 상호작용을 감지하고 정량화하는 데 사용되었지만 대부분의 연구에서는 PLA와 세포 소기관 염색을 결합하지 않았습니다. 결과적으로, PLA 상호 작용과 관련 세포 기관 사이의 근접성을 측정할 수 있는 정량적 방법은 아직 개발되지 않았습니다. 따라서 지금까지 ER 단백질의 경우 다른 세포 기관과 접촉하는 막 하위 영역 내에서의 상호 작용은 널리 분포된 ER 네트워크 내에서의 상호 작용과 구별되지 않았습니다.
여기에서는 동일한 세포 기관의 막에 있는 단백질 간의 PLA 상호 작용을 감지하고 MCS에서 파트너 세포 기관의 막에 대한 근접성을 분석하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 가지 전제에 기초하여 개발되었다: 1) 과발현 조건에서, ER 지질 전달 단백질 ORP5 및 ORP8이 ER-미토콘드리아 및 ER-PM MCSs 12,13,14,15에서 공동 국소화 및 상호작용하고, ORP5가 ER-LD 접촉 16,17에서 국소화됨을 보여주는 이전 연구; 2) PLA, 컨포칼 현미경, 세포 소기관 라벨링 및 3D 이미징 분석을 포함한 기존 기술.
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Protocol
1. 미토콘드리아 염색 및 근접 결찰 분석(PLA)
- 플레이트 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa 세포, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 비필수 아미노산이 보충된 Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM)에서 유지되고 37°C에서 5%CO2, 시술 당일 75%-90% 세포 합류를 허용하는 희석액으로 24웰 플레이트의1.5에 13mm 유리 커버슬립.
참고: 참고로, HeLa 세포는 미토콘드리아 염색 및 PLA 전에 siRNA 처리 및/또는 DNA 플라스미드 형질감염과 같은 추가 처리에 제출될 수 있습니다. - 미토콘드리아 염색
- 세포를 37°C에서 미리 가온된 무혈청 배지에서 한번 세척한다. 세포를 5%CO2와 함께 37°C에서 10분 동안 예열된 무혈청 배지와 함께 인큐베이션한다.
- 1μM 적색 미토콘드리아 마커를 예열된 무혈청 배지에 준비합니다.
- 세포를 5%CO2와 함께 37°C에서 30분 동안 500 μL의 미토콘드리아 마커 용액과 함께 인큐베이션한다. 미토콘드리아 마커 치료 및 프로토콜의 다음 단계 동안 가능한 한 빛으로부터 보호되는 커버슬립에 세포를 유지하십시오.
- 배양 후, 세포를 예열 된 무혈청 배지에서 1x, 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 2x로 세척하십시오. 고정 전 긴 세척 단계가 미토콘드리아 형태에 영향을 미칠 수 있으므로 가능한 한 빨리 이 단계를 수행하십시오.
- 커버슬립에서 1x PBS를 제거하고 화학 후드 아래 실온(어둠 속)에서 30분 동안 새로 준비한 4% PFA(1x PBS)에서 배양하여 세포를 고정합니다. 500μL의 1x PBS에서 2분 동안 3회 세척합니다(일회용 피펫 또는 펌프에 연결된 진공 시스템 사용).
- 1x PBS를 제거하고, 커버슬립을 500 μL의 50mMNH4Cl과 함께 실온(암실)에서 15분 동안 인큐베이션한다. 진공 시스템을 사용하여 500μL의 1x PSB에서 2분 동안 1x 세척합니다.
- ORP5-ORP8 PLA 또는 ORP8-PTPIP51 PLA에 대한 차단 완충액 2(BB2, 2% BSA, 0.1% 정상 염소 혈청, 0.1 사포닌 in 1x PBS)의 경우 500μL의 차단 완충액 1(BB1, 1% BSA, 0.1% 사포닌 중 1x PBS)에서 2분 동안 3배 세척합니다.
- 커버슬립을 24웰 플레이트에서 습도 챔버로 옮깁니다. 커버슬립을 챔버로 옮긴 후 건조를 방지하기 위해 100μL의 BB(사용된 항체 쌍에 따라 BB1 또는 BB2)를 추가합니다.
알림: 빛으로부터 보호되는 습도 챔버는 페트리 접시(플라스틱 또는 유리)를 알루미늄 호일로 싸고 페트리 접시 주변에 젖은 종이 타월 조각을 추가하여 쉽고 빠르게 얻을 수 있습니다.
- 근접 결찰 분석(PLA)
알림: PLA 프로토콜은 제조업체의 지침을 약간 수정하여 따릅니다.- 1차 항체 배양
- 1 차 항체 작업 용액을 준비하십시오. BB1에서 토끼 항-ORP5(1:150)와 마우스 항-ORP8(1:200), BB2에서 마우스 항-ORP8(1:200)과 토끼 항-PTPIP51(1:200), BB1에서 토끼 항-ORP5(1:150) 및 마우스 항-PTPIP51(1:200). 커버슬립당 40μL의 1차 항체 용액을 준비합니다(예: 토끼 항-ORP5 0.27μL, 마우스 항-ORP8 0.2μL, BB1 39.53μL).
- 진공 시스템을 사용하여 이전 세척(단계 1.2.8)에서 BB를 제거하고 40μL의 1차 항체 용액을 커버슬립에 추가합니다. 빛으로부터 보호되는 습도 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 진공 시스템을 사용하여 해당 BB 100μL로 커버슬립을 5분 동안 3번 세척합니다.
- PLA 프로브 인큐베이션
- PLA 프로브 작업 솔루션을 준비합니다. 토끼 PLUS(1:5) 및 마우스 MINUS(1:5) PLA 프로브를 BB에 희석하고 혼합합니다. 각 커버슬립에 대해 (최소한) 40μL의 PLA 프로브 용액(예: 8μL의 토끼 PLUS PLA 프로브, 8μL의 마우스 MINUS PLA 프로브, 24μL의 BB)을 준비합니다. PLA 프로브 용액을 사용하기 전에 실온에서 20분 동안 그대로 두십시오.
- 진공 시스템을 사용하여 커버슬립(1.3.2단계)에서 BB를 제거하고 40μL의 PLA 프로브 용액을 커버슬립에 추가합니다. 빛으로부터 보호되는 습도 챔버에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 실온에서 1x 세척 버퍼 A 100μL에서 커버슬립을 5분 동안 2배 세척합니다.
- 결찰
- 5x 결찰 완충액을 초순수에 1:5로 희석하고 혼합합니다. 각 커버슬립에 대해 (최소한) 40μL의 결찰 용액(8μL의 5x 결찰 완충액, 31μL의 초순수)을 준비합니다.
- 이전 단계에서 준비한 1x 결찰 완충액에 리가아제(1U/μL, PLA 키트에 제공됨)를 1:40의 희석액으로 추가하고 혼합합니다.
- 진공 시스템을 사용하여 커버슬립(1.3.4단계부터)에서 세척 버퍼 A 40개를 제거하고 커버슬립에 40μL의 리가아제 용액을 추가한 다음 빛으로부터 보호되는 습도 챔버에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 진공 시스템을 사용하여 실온에서 100μL의 1x 세척 버퍼 A에서 2분 동안 커버슬립을 2배 세척합니다.
- 중합
- 초순수에 5x 증폭 버퍼를 1:5로 희석하고 혼합합니다. 각 커버슬립에 대해 (최소한) 40μL의 증폭 용액(8μL의 5x 증폭 버퍼, 31.5μL의 초순수)을 준비합니다.
- 중합효소(10U/μL, PLA 키트에 제공됨)를 이전 단계에서 제조한 1x 중합 완충액에 1:80의 희석액으로 첨가하고 혼합합니다.
- 진공 시스템을 사용하여 커버슬립(1.3.6단계부터)에서 1x 세척 버퍼 A를 제거하고 커버슬립에 40μL의 중합효소 용액을 추가한 다음 빛으로부터 보호되는 습도 챔버에서 37°C에서 1시간 40분 동안 배양합니다.
- 커버슬립에서 중합효소 용액을 제거하고 빛으로부터 보호되는 습도 챔버에서 실온에서 1x 세척 버퍼 B 100μL에 10분 동안 2배 세척합니다.
- 빛으로부터 보호되는 습도 챔버에서 실온에서 100μL의 0.001x 세척 버퍼 B에서 1분 동안 커버슬립을 1회 세척합니다.
- DAPI(농도 1.6-0.4 μg/mL)가 있는 장착 매체를 사용하여 현미경 검사용 유리 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 매니큐어로 밀봉하십시오.
- 1차 항체 배양
2. 이미지 획득
- PLA 결과를 관찰하고 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 63x 오일 이멀젼 대물렌즈와 함께 형광 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.
- 405nm 레이저 다이오드 또는 백색광 레이저를 사용하여 형광 여기를 설정하고 GaAsP PMT 또는 하이브리드 검출기로 스펙트럼 창을 수집합니다. 각 초점면(300nm에 걸쳐)에서 PLA(λex = 488nm, λem = 505-560nm) 및 미토콘드리아(λex = 543nm, λem = 606-670nm)에 대한 형광 신호를 수집합니다.
3. 미토콘드리아와 관련된 PLA 반점의 이미지 처리 및 평가
- 세포 구성 요소 간의 거리 맵을 생성하는 이미지 분석용 소프트웨어를 사용하여 공초점 이미지를 처리합니다. 아래 단계에 따라 PLA 스팟과 미토콘드리아 네트워크의 3D 재구성을 생성하고 세포 이미징 소프트웨어를 사용하여 이들 사이의 거리에 액세스합니다(그림 1).
- 3D 거리 지도 확장 설치
- XT 옵션이 있는 세포 분석 소프트웨어 패키지와 MATLAB 소프트웨어를 모두 설치하거나 웹 사이트에서 무료로 다운로드할 수 있는 MATLAB 컴파일러 런타임(MRC)만 설치합니다.
- 다음과 같이 XTension이 시작될 때 MATLAB이 시작되도록 세포 분석 소프트웨어를 설정합니다. Imaris (Mac OS X) 또는 Edit(편집 ) 메뉴(Windows)에서 Preferences( 기본 설정)를 선택하고 Custom Tools(사용자 지정 툴 ) 패널로 변경한 다음 경로를 설정합니다.
Windows의 경우 C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB.exe Mac OS X의 경우 /Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab입니다.
- 소프트웨어로 이미지 가져 오기
- 컨포칼 스택 이미지를 . IMS 파일을 Arena 섹션을 통해 직접 또는 일괄 변환을 허용하는 독립 실행형 파일 변환기를 사용합니다.
- 가져온 후 이미지가 제대로 보정되었는지 확인하십시오. Edit > Image Properties > Image Geometry(이미지 형상 편집)를 클릭하고 X 및 Y의 복셀 크기가 실제 이미지에 예상되는 픽셀 크기와 일치하는지(획득 소프트웨어의 이미지 보정 참조) Z의 복셀 크기가 Z-스택을 생성하기 위해 현미경으로 적용한 단계와 일치하는지 확인합니다. 값이 올바르지 않으면 다음 단계에서 거리를 올바르게 추정할 수 있도록 값을 수정합니다.
- 메뉴에서 다른 채널의 대비를 조정하십시오 디스플레이 조정 편집을 클릭하여 디스플레이 조정> 디스플레이 조정을 표시합니다. 각 채널을 독립적으로 조정하여 각 색상의 표시를 최적화합니다. 이 단계는 이미지 값에 직접적인 영향을 미치지는 않지만 정확한 임계값을 설정하거나 약한 물체를 감지하는 데 필수적입니다.
- Edit > Crop 3D 옵션을 사용하여 이미지를 잘라내어 분석을 단일 셀로 제한합니다. 동일한 시야에서 다른 셀을 분석하려면 동일한 이미지를 다시 한 번 열고 다르게 자릅니다.
- ORP5-ORP8 스팟 검출
- 새 스팟 추가 옵션을 클릭하여 ORP5 및 ORP8 상호 작용 위치에서 생성된 PLA 신호를 감지하면 새 객체 세트가 생성되고 스팟 감지 마법사가 열립니다.
- 스팟 감지를 수행할 채널을 선택합니다.
- 추정된 XY 직경(물체 크기가 다른 경우 범위를 조정해야 함)을 조정하여 스폿 감지 알고리즘이 관심 있는 물체를 찾는 데 도움을 줍니다. 선택한 값이 너무 높으면 주변 물체가 융합됩니다. 값이 너무 작으면 하나의 신호가 여러 객체로 간주되거나 비정상적인 신호가 감지될 수 있습니다.
- Background Subtraction(배경 빼기)을 클릭하여 스팟 감지 전에 이미지 배경을 제거하여 관심 개체 주변의 로컬 대비를 향상시킵니다.
- 품질(물체 중심의 강도)을 임계값 매개변수 및 소프트웨어 자동 임계값으로 유지하여 스팟 감지 임계값을 조정하거나 이 값을 약간 수정하여 모든 물체를 감지합니다. 스폿 검출이 완료되면 검출 파라미터를 저장하고 이를 다시 사용하여 다른 이미지를 처리합니다.
- 미토콘드리아 네트워크 검출
- 미토콘드리아 네트워크를 감지하여 Add new Surfaces(새 표면 추가)를 클릭하여 표면 렌더링을 생성하고 표면 감지 마법사를 엽니다.
- 지표면 작성을 수행할 채널을 선택합니다.
- 가우스 필터를 적용하면 매끄럽게 (Smooth ) 확인란을 클릭하고 표면에서 관찰 할 수있는 가장 작은 세부 사항을 나타내는 임계 값을 설정하여 더 매끄러운 표면을 얻을 수 있습니다.
- 배경 빼기를 수행하여 로컬 대비를 향상시키고 임계값 단계를 돕습니다.
- 임계값을 조정하여 신호의 강도에 따라 미토콘드리아 네트워크를 감지합니다. 임계 값을 올바르게 설정하기 어려운 경우 이전 단계로 돌아가 부드러움과 배경 빼기 정도를 조정하는 것이 좋습니다.
- 필요한 경우 표면에 필터를 적용하여 임계값으로 인한 작은 잔류물을 제거합니다. 이렇게 하려면 분류 표면 창에서 복셀 수 필터를 선택하고 상한 및 하한 임계값을 사용하여 관심 있는 개체만 유지합니다. 표면 생성이 끝나면 생성 매개변수를 저장하고 이를 다시 사용하여 다른 이미지를 처리합니다.
- 미토콘드리아 주변의 3D 거리 지도 생성
- 이전에 생성된 미토콘드리아 표면 외부의 거리 맵을 다음과 같이 생성합니다. 장면 트리 상자에서 미토콘드리아 표면을 선택합니다. 이미지 처리 > 표면 기능 > 거리 변환을 클릭합니다. 이렇게 하면 Matlab XTension이 호출되어 사용자에게 맵을 객체 표면의 외부 또는 내부에서 계산할지 여부를 선택하도록 요청합니다.
- Outside Surface Object(외부 표면 개체)를 선택하여 PLA 스팟과 미토콘드리아 표면 사이의 거리를 측정합니다. 거리 맵이 생성되면 디스플레이 조정 패널에 새 채널로 나타납니다. 이 채널에서 모든 픽셀은 가장 가까운 미토콘드리아까지의 거리에 해당하는 값을 갖습니다.
- 가장 가까운 미토콘드리아에서 물체의 거리 추출
- 각 지점에서 가장 가까운 미토콘드리아까지의 거리를 측정하고 가장 가까운 미토콘드리아를 식별하고 시각화하려면 장면 트리 상자에서 이전에 생성된 지점을 선택합니다.
- 통계 및 상세 로그에서 특정 값을 선택합니다(각 지점에 대해 하나의 측정값을 얻기 위해). 중심 강도 Ch=X (X는 거리 맵 채널 번호에 해당)를 선택합니다. 이것은 거리 지도에서 가장 가까운 미토콘드리아까지의 거리에 해당하는 각 지점 중심의 값을 측정합니다.
- 창의 왼쪽 하단에 있는 플로피 디스크 아이콘을 클릭하여 데이터를 .csv 파일로 내보냅니다.
- 미토콘드리아까지의 거리를 기준으로 스팟의 하위 모집단을 추출하려면 씬 트리에서 스폿을 선택하고 필터 탭을 클릭합니다.
- 이 창에서 중심 강도 Ch=X를 기반으로 새 필터를 다시 한 번 추가하고 하한 임계값을 0μm로, 상위 임계값을 0.380μm로 설정하여 미토콘드리아에서 380nm 미만 떨어진 지점을 추출합니다.
참고: 380nm의 임계값은 1차 항체와 2차 항체(30nm) 간의 연관성과 PLA 증폭 신호(350nm)의 FWHM(full width at half maximum)의 절반을 포함하는 PLA 반응을 기반으로 추정되었습니다. - 선택한 스팟에 초점을 맞추려면, 예를 들어 뚜렷한 색상을 지정하려면 [새 스팟에 선택 영역 복제] 버튼을 눌러 복제 단계를 수행합니다.
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 두 개의 ER 고정 지질 전달 단백질인 ORP5 및 ORP8의 상호 작용 부위를 감지하고 다른 세포 기관, 특히 미토콘드리아와 접촉하는 ER 막 하위 도메인에서 발생을 평가했습니다. 이를 위해 HeLa 세포의 미토콘드리아 네트워크를 적색 미토콘드리아 마커로 염색하고, 1차 항체인 항-ORP5 및 항-ORP8을 사용하여 고정 후 ORP5-ORP8 PLA 녹색 반점을 검출했으며, 이들의 특이성은 이전에 면역형광법15로 테스트되었습니다. 공초점 이미지는 HeLa 세포의 내인성 ORP5-ORP8 PLA 상호작용이 망상 ER, 피질 ER 및 일반적으로 미토콘드리아 관련 ER 막(MAM; 그림 2A). MAM에서 발생하는 ORP5-ORP8 PLA 상호작용을 정량화하기 위해, 미토콘드리아로부터 각 PLA 스폿의 거리를 3D 이미지 분석을 이용하여 평가하였다. 380nm의 거리 임계값을 사용하여 3D 이미징 분석을 통해 내인성 ORP5-ORP8 PLA 상호작용의 약 50%가 MAM에서 검출된 것으로 나타났습니다(그림 2A, B). 상호 작용의 나머지 50%는 피질과 망상 ER 사이에 분포되었습니다15. PLA의 특이성을 검증하기 위해, ORP5-표적 및 ORP8-표적 siRNAs(음성 대조군)로 처리된 세포 또는 ORP5 및 ORP8을 공동 과발현하는 세포(양성 대조군)에서 ORP5-ORP8 PLA 실험을 수행하였다. ORP5 및 ORP8 하향 조절은 PLA 신호의 총 수를 크게 감소시켰습니다(MAM, 망상 응급실 및 피질 응급실에서; 그림 2A, C), 이들의 동시 과발현은 PLA의 증가를 초래했으며(그림 2A, C), ORP5-ORP8 PLA의 특이성을 확인했습니다. 그러나 흥미롭게도 ORP5와 ORP8을 공동 과발현하는 세포의 MAM에서 발생하는 ORP5-ORP8 PLA 상호 작용의 비율은 이러한 단백질이 내인성 수준에서 발현된 세포에서 관찰된 것과 유사했으며(그림 2B), MAM에서 복합체로서의 존재를 뒷받침합니다. 미토콘드리아와 밀접하게 접촉하는 ER 막 서브도메인에서 ORP5 및 ORP8의 존재를 추가로 확인하기 위해, ORP5 또는 ORP8과 ORP5 및 ORP8의 알려진 결합 파트너인 외부 미토콘드리아 막 단백질 PTPIP51 사이의 추가적인 정량적 PLA 분석을 수행하였다13. PLA 신호는 ORP5-PTPIP51 및 ORP8-PTPIP51 커플 모두에서 검출되었으며, 평균 수치는 ORP5-ORP8 PLA 커플과 유사하여 ER-미토콘드리아 MCS에서 ORP5 및 ORP8 국소화를 확인했습니다(그림 3).
마지막으로, 우리 연구실의 최근 연구에서, PHPLCd-RFP 또는 mcherry-PLN1로 형질감염된 HeLa 세포에서 유사한 접근법을 사용하여 PM 또는 LD를 각각 표시함으로써 ER-PM 접촉에서 ORP5-ORP8 PLA 상호작용의 발생을 분석하고 미토콘드리아, ER 및 LD 사이의 3방향 접촉 부위를 식별할 수 있었습니다(그림 4)15, 17.
그림 1: 미토콘드리아에 근접한 PLA 신호를 식별하기 위한 워크플로. 먼저, 공초점 스택을 분할하여 PLA 초점(반점)과 미토콘드리아 네트워크(표면)를 식별합니다. 그런 다음 표면 외부(미토콘드리아)를 향해 3D 거리 맵을 계산하여 가장 가까운 미토콘드리아에서 각 지점의 거리를 측정할 수 있습니다. 마지막으로, PLA 스폿은 검출 시스템의 정밀도를 기반으로 설정된 380nm의 근접 임계값을 기반으로 두 개의 개체군(적색 및 녹색)으로 분류됩니다. 이 수치는 Monteiro-Cardoso et al.15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: ER-미토콘드리아 접촉에서 국한된 내인성 수준에서 발현된 ORP5-ORP8 복합체의 대표 이미지. (A) ORP5-ORP8 PLA 공초점 시리즈 및 각각의 3D 재구성. 스케일 바: 10 μm 및 2 μm(확장 이미지). (B) 미토콘드리아와 밀접하게 접촉하는 ORP5-ORP8 PLA 병소의 정량화. Endo, n = 33 세포 및 Overexp ORP5+ORP8, n = 27 세포. 데이터는 평균 ± SEM(평균의 표준 오차)으로 표시됩니다. 이 이미지는 Monteiro-Cardoso et al.15에서 수정되었습니다. (C) 총 ORP5-ORP8 PLA 병소의 정량화. Endo, n = 38 세포, siORP5+siORP8, n = 38 세포 및 Overexp ORP5+ORP8, n = 35 세포. 데이터는 평균 ± SEM(평균의 표준 오차)으로 표시됩니다. 이 이미지는 Monteiro-Cardoso et al.15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: ORP5 또는 ORP8과 미토콘드리아 단백질 PTPIP51 사이의 PLA 신호의 대표 이미지. (A) 공초점 시리즈를 사용하여 ORPR5 또는 ORP8 PLA와 PTPIP51 간의 상호 작용이 ER-미토콘드리아 밀접 접촉에서 발생하는지 확인하기 위해 3D 재구성 및 거리 맵을 생성했습니다. 스케일 바: 10 μm 및 2 μm(확장 이미지). (b) PTPIP51 표적으로 siRNA로 처리된 대조군 및 HeLa 세포에서 면역형광 공초점 이미지(single focal plane)를 PTPIP51. 스케일 바: 10 μm 및 2 μm(확장 이미지). (C) siRNA 표적 PTPIP51로 처리된 대조군 및 HeLa 세포에서의 ORP5-PTPIP51 및 ORP8-PTPIP51 PLA 공초점 이미지. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ER-PM 및 ER-미토콘드리아-LD 접점에서 ORP5-ORP8 PLA 복합체의 위치를 파악하는 데 사용되는 3D 재구성의 예. (A) 녹색 점으로 표시되는 ORP5-ORP8 PLA가 있는 HeLa 세포, 빨간색 세포로 표시되는 PHPLCd-RFP로 표시된 PM 및 파란색 표면으로 표시되는 Mito-BFP로 표시된 미토콘드리아의 공초점 이미지 및 각각의 3D 재구성. 왼쪽 및 중앙 이미지: 전체 HeLa 세포의 표현. 오른쪽 이미지: 셀 내부의 확대된 영역을 나타냅니다. (B) 녹색 점으로 표시되는 ORP5-ORP8 PLA가 있는 HeLa 세포의 확대된 영역의 공초점 이미지 및 각각의 3D 재구성, 빨간색 표면으로 표시되는 mCherry-PLN1로 표시된 LD 및 파란색 표면으로 표시되는 Mito-BFP. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 MCS, 특히 MERCS에서 세포 기관 간 단백질 PLA 상호작용을 식별하고 정량화하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜의 참신함은 PLA를 여러 세포 소기관의 라벨링, 컨포칼 현미경 및 3D 이미지 분석과 결합하여 동일한 멤브레인에 있는 두 단백질 간의 PLA 상호 작용을 현지화하고 정량화한다는 것입니다. 이 프로토콜은 특정 MERCS뿐만 아니라 다른 MCS에서도 잠재적으로 국소화되는 단백질을 검증하는 도구로 사용할 수 있습니다.
2006년 개발 이후, ER과 미토콘드리아 단백질 사이의 PLA는 MERCS 7,9,10,11을 정량화하는 데 널리 사용되었습니다. 그러나 PLA를 세포 내 MERCS 풍부도의 지표로 사용하는 것은 고분해능 접근 방식을 통해 신중하게 검증해야 합니다. 예를 들어, MERCS의 풍부함에 영향을 미치지 않는 미토콘드리아 단백질인 SAM50의 절제(전자 현미경으로 정량화)15는 ER 단백질 ORP8과 미토콘드리아 단백질 TOM20 사이의 PLA 상호작용을 변화시키지 않지만, 발현 수준을 감소시키지 않으면서 ORP8과 미토콘드리아 단백질 Metaxin2 사이의 PLA 상호작용을 감소시킨다 15. 이러한 결과는 PLA 상호 작용이 분석에 사용된 단백질 쌍에 특이적일 수 있으며 MERCS의 풍부함을 평가하기 위한 유일한 매개변수로 사용할 수 없음을 반영합니다.
그럼에도 불구하고 PLA는 현장 내인성 단백질 상호작용을 감지하는 입증된 민감한 접근 방식입니다. split-GFP 및 FRET를 포함한 다른 형광 프로브 기반 검출 방법이나 고분해능 이미징 접근법과 달리, PLA는 표적 세포 기관의 물리적 특성 변경과 같은 고유한 실험 아티팩트를 피하면서 태그된 단백질의 과발현을 필요로 하지 않는다15. PLA에 의한 단백질 상호작용의 검출은 또한 웨스턴 블롯과의 공동 면역침전과 같은 다른 면역검출 방법과 관련하여 이점을 제공합니다. PLA는 단일 세포 수준에서 단일 형광 스폿의 정량화를 가능하게 하는 반면, 공면역침전은 많은 양의 생물학적 물질을 필요로 하고 적절한 로딩 제어를 얻기 어려운 이종 세포 풀에서 추출된 단백질의 상대적 정량화만을 허용한다15. 공동 면역 침전에 비해 세포 소기관 염색 및 컨포칼 현미경과 결합된 PLA 사용의 또 다른 이점은 첫 번째 접근 방식이 세포 내 수준에서 단백질 상호 작용의 국소화를 허용한다는 것입니다.
반면에, 이 프로토콜의 두드러진 단점은 MERCS보다 큰 약 40nm의 PLA 검출 범위와 약 250nm의 공초점 현미경에 의해 달성되는 최대 해상도와 관련이 있어 접촉 부위를 명확하게 식별하기 어렵습니다. 그러나, 여기서, 380 nm의 역치는 1차 및 2차 항체(30 nm)의 연관성과 PLA 증폭 신호(350 nm)의 FWHM의 절반을 포함하는 PLA 반응의 크기에 기초하여 미토콘드리아 표면과 관련된 PLA 스팟을 추정하는 데 사용되었다. PLA의 또 다른 한계는 고정된 샘플에서만 사용할 수 있다는 사실과 관련이 있으며, 뚜렷하고 특이적이며 정량화 가능한 PLA 신호를 획득하려면 관심 단백질에 매우 특이적인 항체의 가용성이 필요합니다15. 또한 거리 추정을 위한 3D 이미징 분석에는 모든 실험실에서 쉽게 사용할 수 없는 특정 소프트웨어가 필요합니다.
특히, 위에서 언급한 단점 중 일부는 최근에 사용 가능한 기술을 사용하여 해결할 수 있습니다. 예를 들어, 기존의 컨포칼 현미경은 Airyscan 또는 구조화 조명 현미경(SIM)17과 같은 고해상도 수준의 이미징 기술로 대체될 수 있으며, 관심 단백질에 대한 우수한 1차 항체의 부족은 CRISPR-Cas9 기술18을 사용하여 내인성 단백질에 안정적으로 태그를 지정하여 극복할 수 있습니다. 마지막으로, 항체 및 PLA 신호의 품질 및 특이성은 다음의 대조군을 사용하여 검증될 수 있다: 1) 대조군 세포 및 관심있는 단백질이 고갈되거나 과발현된 세포에서 면역형광 및 웨스턴 블롯에 의한 1차 항체 시험; 2) 관심있는 단백질 중 하나 또는 둘 모두가 고갈된 세포에서 PLA를 수행하는 단계; 3) 관심 단백질을 공동발현하는 세포에서 PLA를 수행하는 단계; 4) 관심있는 단백질에 대한 두 항체를 모두 생략하면서 PLA를 수행하는 단계; 5) 관심있는 단백질에 대한 2개의 항체 중 하나만 사용하여 PLA를 수행하는 단계; 6) 1차 항체가 생성된 종과 동일한 IgG로 배양하여 PLA를 수행합니다. 이들의 특이성을 평가하기 위해, 이 프로토콜에 사용된 항체는 대조군 세포 및 ORP515, ORP815 또는 PTPIP51를 표적으로 하는 siRNA로 처리된 세포에서 면역형광 및 웨스턴 블롯에 의해 시험되었다(도 3B 및 Guyard et al.17). 또한, 항체 검출 신호와 EGFP 신호 사이의 피어슨 계수를 평가함으로써 EGFP-태깅된 ORP5 또는 ORP8을 발현하는 세포에서 항-ORP5 및 항-ORP8 특이성을 평가하였다15. 항-ORP515, 항-ORP815 및 항-PTPIP51(그림 1 및 도 3C) 항체의 특이성은 이들 단백질이 고갈된 세포에서 추가로 분석되어 PLA 신호의 감소를 유도하였다. 참고로, 면역형광 염색에 적합한 항체 농도는 일반적으로 PLA에도 적합합니다. 그러나, 사용된 항체에 따라, PLA 염색을 개선하기 위해 블로킹 용액 및/또는 항체 농도에 대한 일부 조정이 이루어질 수 있다. ORP5-ORP8 및 ORP8-PTPIP51 PLA 염색은 블로킹 용액을 조정한 후에 개선되었다. 고품질 미토콘드리아 및 PLA 염색을 얻으려면 3D 변조를 용이하게 하는 데 중요한 낮은 배경 신호로 고품질 컨포칼 이미지를 얻는 것이 필수적입니다. 예를 들어, 높은 배경 영향 임계값 조정이 있는 컨포칼 이미지는 결과적으로 미토콘드리아 네트워크 또는 PLA의 3D 변조 정확도에 영향을 미칩니다.
결론적으로, 여기에 제시된 프로토콜은 다세포 소기관 라벨링을 사용하고 3D 재구성 컨포칼 이미지에서 거리 맵을 생성함으로써 특정 MERCS 하위 도메인(MCS에 관여하는 동일한 막 내의 cis 에 국한된 단백질 간 또는 병치된 막 내의 트랜스에 국한된 단백질 간의 상호 작용)에서 PLA 단백질 상호 작용의 국소화 및 정량화를 가능하게 합니다. 여기에 설명된 절차는 MERCS에서 단백질 상호작용을 검출하는 다른 방법론에 비해 기술적으로 간단하고 상대적으로 빠르지만 얻은 데이터는 재현성이 높습니다. 또한, 이 프로토콜은 관심 단백질에 사용할 수 있는 항체와 세포 소기관을 염색하는 데 사용할 수 있는 마커만큼 다재다능합니다. 따라서 광범위한 단백질 쌍과 여러 세포 기관 및 MCS에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir 프로그램, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) 및 Fondation Vaincre Alzheimer(eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences)를 참조하십시오.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
References
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