Hybridation in situ pour la localisation précise des transcriptions dans les plantes

L’objectif général de l’expérience suivante est de visualiser les modèles d’expression de l’ARNm au niveau cellulaire avec une sensibilité et une spécificité élevées. Ceci est réalisé en prélevant d’abord des coupes de tissus formels et fixes et intégrés à la paraffine à travers une série de solutions pour éliminer la cire perme les tissus et bloquer les groupes mineurs chargés positivement dans les tissus qui peuvent produire un signal de fond. Par la suite, une sonde d’ARN marquée DIG spécifique du gène d’intérêt est infiltrée dans les coupes de tissus et les lames sont hybridées pendant la nuit.

Ensuite, les lames sont traitées avec des ARN. A pour retirer la sonde non spécifiquement liée des sections, puis incuber avec un anticorps anti-DIG. Cela permet de visualiser la sonde hybridée par une réaction chimique métrique couleur.

Les résultats montrent un signal bleu foncé détectable par la microscopie optique, en particulier dans les cellules du tissu dans lesquelles le gène d’intérêt est exprimé. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos autres approches d’analyse d’expression, telles que R-T-P-C-R, microrayons ou Next Generation Sequencing est que le protocole d’hybridation I présenté ici révèle le modèle d’expression d’un gène d’intérêt dans son contexte tissulaire. Ces méthodes comprennent de nombreuses étapes qui sont mieux apprises par des démonstrations visuelles.

Nous montrerons comment sectionner et intégrer les tissus ainsi que les étapes clés du protocole Al Hybridization pro qui sont difficiles à maîtriser par vous-même. La méthode d’enrobage des tissus fixés au paraldéhyde variera en fonction du type de tissu à analyser. Le point le plus important ici est de s’assurer que les échantillons sont correctement orientés pour le sectionnement ultérieur.

Une méthode d’intégration consiste à utiliser des moules et des anneaux en plastique. Pour commencer cette procédure, réchauffez les moules sur une plaque chauffante à 60 degrés Celsius, puis versez de la paraffine fondue dans les moules. Ensuite, à l’aide d’une pince chauffée, transférez un échantillon de tissu dans chaque moule et orientez-le dans la position souhaitée.

Déplacez délicatement le moule de la plaque vers le banc et placez l’anneau blanc sur le moule. Ajoutez du mol et de la cire supplémentaires. Laissez la cire refroidir et durcir progressivement avant de sectionner.

Réchauffez les blocs à température ambiante, puis coupez chaque bloc en forme de trapèze, en laissant environ un millimètre de cire autour de l’échantillon. Placez le bloc coupé sur le microtome de sorte que la plus longue des deux faces parallèles se trouve en bas. Amenez délicatement le bloc vers l’avant de la lame et assurez-vous que la surface du bloc est parallèle à la section de la lame.

Comme une épaisseur de huit à 10 microns. Alignez les rubans de cire sur une surface antiadhésive, telle qu’une feuille d’aluminium, et sélectionnez les sections d’intérêt sous une lunette de dissection. Ensuite, marquez les diapositives prob bon plus avec un crayon.

N’utilisez pas de stylos sur les feutres car ils seront effacés lors du protocole d’hybridation INI deux. Répartissez un millilitre d’eau propre milli Q sur chaque lame. Faites flotter avec précaution les sections d’intérêt à la surface de l’eau à température ambiante.

Assurez-vous que le côté brillant fait face à l’eau. Transférez lentement la diapositive sur un chauffe-diapositives. Réglé à 35 à 37 degrés Celsius.

Cette plage de température, par opposition aux 42 degrés Celsius couramment utilisés, empêche la formation de bulles sous les sections. Après cinq minutes, versez l’eau avec précaution mais d’un seul mouvement fluide afin que le ruban soit abaissé sur le toboggan. Laissez sécher les lames pendant au moins plusieurs heures ou toute la nuit à 37 degrés Celsius afin que le tissu adhère pour préparer des coupes de tissus.

Pour l’hybridation in situ, ils sont d’abord depa et réhydratés pour la finalisation depa. Incuber les lames en deux changements de solution transparente histique pendant 10 minutes chacune. Pour réhydrater les sections de tissus, passez les lames à travers une série de concentrations décroissantes d’éthanol pendant 30 secondes chacune.

Pendant le traitement à la protéase, qui n’est pas montré dans cette vidéo, préparez un plat en verre avec une solution d’amine de triathlon 0,1 molaire et placez-le sur une plaque à mélanger dans une hotte. Immédiatement avant de placer le support de glissière métallique dans la solution, ajoutez 1,25 millilitre d’anhydride acétique dans l’amine, le tampon et la cage d’escalier du triathlon. De plus, installez le système de serrage et le support pour maintenir le support de glissière.

Réduisez la vitesse du Starr, fixez le support coulissant sur le support et abaissez le support dans la solution, en le maintenant au-dessus de la barre d’agitation. Continuez à remuer lentement pendant 10 minutes après avoir été rincé au PBS et déshydraté à nouveau à travers une série d’éthanol. Les coupes de tissus sont prêtes pour l’hybridation.

Placez les lames sur une surface propre et laissez sécher complètement à l’air libre pendant cinq à 10 minutes. Préparez le mélange de tampon d’hybridation de la sonde en ajoutant la sonde dénaturée à 80 microlitres de tampon d’hybridation. Pour chaque lame, bien mélanger par pipetage et éviter de faire des bulles.

Pipeter le tampon d’hybridation de la sonde. Mélangez sur le bord droit de la diapositive. Abaissez progressivement une lamelle sur le toboggan, en veillant à ce que la solution d’hybridation couvre toutes les sections sans aucune bulle.

Tapotez légèrement la couverture, coupez légèrement avec votre doigt là où des bulles se forment pour les déplacer de toutes les sections de tissus. Ne retirez pas la coupe du couvercle car cela endommagerait les sections. Placez les lames dans une chambre d’humidité contenant du papier watman humidifié avec de l’eau UE et largement recouvert de param.

Fermez hermétiquement la boîte, incubez les lames à la température d’hybridation souhaitée, généralement de 50 à 55 degrés Celsius pendant 16 à 20 heures. À la fin du protocole d’hybridation, retirez soigneusement les lamelles des lames. Le couvercle peut simplement tomber lorsque le toboggan est placé à la verticale, mais si ce n’est pas le cas, ne retirez pas le couvercle car cela endommagerait les sections.

Au lieu de cela, plongez la diapositive dans 0,2 fois SSC chaud pendant une ou deux minutes pour laver le couvercle après avoir retiré les lamelles, placez les diapositives dans un support et lavez-les plusieurs fois dans 0,2 fois SSC à 55 degrés Celsius. Après un traitement d’ARN, transférez les lames du rack au fond d’une boîte en plastique plate et recouvrez d’un volume minimal de solution de blocage. Bloquez les lames pendant 45 minutes à température ambiante sur une plate-forme à agitation lente.

Ensuite, appliquez un volume minimal de solution d’anticorps directement sur chaque lame. Incuber les lames dans l’obscurité pendant deux à trois heures à température ambiante. Une fois l’incubation terminée, transférez les lames dans une boîte plate propre et lavez-les quatre fois avec un volume minimal de tampon de lavage sur une plate-forme vibrante à température ambiante.

Rincez les lames une fois dans le TBS et deux fois dans le tampon TN et proposez d’appliquer une solution de coloration fraîchement préparée sur les lames. Tout d’abord, versez la solution de coloration dans un petit plat de pesée en plastique. Ensuite, prenez en sandwich deux diapositives avec les sections face à face.

Trempez le sandwich dans la solution, en laissant l’action capillaire tirer la solution vers le haut. Égouttez les lames sur une lingette kim. Remplissez les lames avec une solution colorante.

Encore une fois, il peut être nécessaire de tapoter les lames au fur et à mesure que la solution s’écoule pour éviter les bulles, placez les lames dans une boîte en plastique et stockez-les à température ambiante dans l’obscurité. Les résultats représentatifs obtenus avec différentes sondes et tissus d’arabidopsis sont présentés ici. Le signal violet fournit une visualisation directe à la résolution cellulaire du modèle d’expression du gène d’intérêt.

Le graphique A montre la localisation des transcrits de la pousse Meli one à l’apex de la pousse végétative. Notez la présence d’un signal bleu violet dans l’indéterminé du méristème et l’absence de signal dans les feuilles environnantes. Les panneaux B 2D sont des coupes d’embryons au stade de torpille d’arabidopsis où B montre l’expression de covata trois dans les quelques cellules souches embryonnaires.

C montre une expression de T ML un dans la couche épidermique, et D montre l’absence de signal dans les sections sondées avec un ARN de contrôle négatif aléatoire. Les images suivantes ont montré des résultats obtenus avec différentes sondes sur des tissus de labyrinthe. Le panneau E montre la localisation de l’Humalog STM noué dans l’embryon du labyrinthe en développement.

Notez que le signal fort spécifiquement dans les sections longitudinales de la tige et de la racine embryonnaires à travers l’apex de la goulotte végétative montre que l’ARF trois A est exprimé sur la surface inférieure axiale de la feuille dans le panneau F et que l’homologue A T ML un OCL quatre est exprimé spécifiquement dans l’épiderme. Dans le panel G.As attendu, aucun signal d’hybridation n’a été observé pour la sonde de contrôle négative dans le panel H.Les résultats attendus des différents points de contrôle lors de la transcription in vitro des sondes sont présentés ici. Les sondes d’hybridation in situ sont vérifiées sur un gel ARAZ standard après transcription in vitro après le traitement de l’ADN et la purification ultérieure de la réaction de transcription in vitro Après l’hydrolyse carbonatée et lorsqu’elles sont prêtes à l’emploi pour des sondes de plus de 250 paires de bases de longueur, comme la sonde une, l’hydrolyse carbonatée produira une gamme de fragments de sonde plus petits.

Cette figure montre les résultats de la qualification colorimétrique et métrique des sondes par analyse par transfert de points allant de 10 à moins un à 10 à moins cinq d’une sonde de contrôle de 100 nanogrammes par microlitre et de trois sondes nouvellement marquées DIG sont repérées sur une membrane de transfert incubée avec un anticorps anti DIG et un dosage. L’analyse suggère une concentration estimée de 100 nanogrammes par microlitre pour la sonde deux, 10 nanogrammes par microlitre pour la sonde trois et un nanogramme par microlitre pour la sonde quatre, ce qui indique qu’il est peu probable que la sonde quatre produise un bon signal inea/hybridation. Enfin, ces coupes longitudinales à travers l’apex de la goulotte végétale de Mace permettent une comparaison entre un signal de fond non spécifique et un panneau de sonde qui fonctionne bien.

A montre un signal de fond non spécifique tandis que le panneau B montre un signal d’hybridation in situ spécifique à deux pour la sonde OC cinq dans la couche cellulaire externe. Après avoir regardé ceci, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’effectuer la plupart des étapes délicates des protocoles d’hybridation d’initialisation afin que vous puissiez déterminer les modèles d’expression temporelle de pression précis de vos adolescents préférés.