Hybridation in situ pour la localisation précise des transcriptions dans les plantes

L'objectif général de l'expérience suivante est de visualiser les profils d'expression des ARNm au niveau cellulaire avec une haute sensibilité et spécificité. Cette visualisation est obtenue en soumettant tout d'abord des sections tissulaires fixées au formol et incluses dans la paraffine à une série de solutions destinées à éliminer la paraffine, à rendre les tissus perméables et à bloquer les groupes mineurs chargés positivement présents dans les tissus, qui pourraient produire un signal de fond. Ensuite, des sondes d'ARN marquées à la DIG, spécifiques du gène d'intérêt, sont infiltrées dans les sections tissulaires et les lames sont hybridées toute la nuit.

Ensuite, les lames sont traitées avec des ARN. Afin d'éliminer la sonde liée de manière non spécifique aux sections, puis incubées avec un anticorps anti-DIG. Cela permet la visualisation de la sonde hybridée par une réaction chimique colorimétrique.

Les résultats montrent un signal bleu foncé détectable par microscopie optique, spécifiquement dans les cellules du tissu où le gène d'intérêt est exprimé. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres analyses d'expression, telles que la R-T-P-C-R, les microréseaux ou les approches de séquençage de nouvelle génération, est que le protocole d'hybridation in situ présenté ici révèle le profil d'expression d'un gène d'intérêt dans son contexte tissulaire. Ces méthodes comprennent de nombreuses étapes qui s'apprennent mieux par des démonstrations visuelles.

Nous allons montrer comment découper et inclure les tissus, ainsi que les étapes clés du protocole de l'hybridation Al qui sont difficiles à maîtriser seul. La méthode d'inclusion des tissus fixés à la paraldéhyde varie selon le type de tissu à analyser. Le point le plus important ici est de s'assurer que les échantillons sont correctement orientés pour la coupe ultérieure.

Une méthode d'inclusion consiste à utiliser des moules et des bagues en plastique. Pour commencer cette procédure, faites chauffer les moules sur une plaque chauffante à 60 degrés Celsius, puis versez de la paraffine fondue dans les moules. Ensuite, utilisez une pince préalablement chauffée pour transférer un échantillon de tissu dans chaque moule et positionnez-le selon l'orientation souhaitée.

Déplacez soigneusement le moule depuis la plaque vers le plan de travail et placez l'anneau blanc sur le moule. Ajoutez davantage de moles et de cire. Laissez la cire refroidir et durcir progressivement avant la sectionnement.

Ramenez les blocs à température ambiante, puis taillez chaque bloc en forme de trapèze, en laissant environ un millimètre de paraffine autour de l'échantillon. Placez le bloc taillé sur le microtome de sorte que la face la plus longue des deux faces parallèles se trouve en bas. Avancez délicatement le bloc vers le couteau et assurez-vous que la surface du bloc est parallèle au plan de coupe du couteau.

Avec une épaisseur de huit à 10 micromètres. Aligner les rubans de paraffine sur une surface antiadhésive, comme du papier d’aluminium, et sélectionner les sections d’intérêt sous un microscope stéréoscopique. Ensuite, marquer les lames prob bon plus au crayon.

Ne pas utiliser de stylos sur les marqueurs car ils seront effacés pendant le protocole d'hybridation INI. Distribuer un millilitre d'eau Milli-Q propre sur chaque lame. Faire flotter délicatement les sections d'intérêt à la surface de l'eau à température ambiante.

Veillez à ce que le côté brillant soit en contact avec l'eau. Déposez lentement la lame sur un réchauffeur de lames. Régler la température entre 35 et 37 degrés Celsius.

Ce domaine de température, par opposition aux 42 degrés Celsius couramment utilisés, empêche la formation de bulles sous les coupes. Après cinq minutes, versez délicatement l'eau en un seul mouvement fluide afin que le ruban descende sur la lame. Laissez sécher les lames pendant au moins plusieurs heures ou toute une nuit à 37 degrés Celsius afin que le tissu adhère et que les coupes de tissu soient prêtes.

Pour l'hybridation in situ, ils sont d'abord déparaffinés et réhydratés afin de finaliser la déparaffinisation. Incuber les lames dans deux bains successifs de solution de histic clear pendant 10 minutes chacun. Pour réhydrater les coupes de tissu, faire passer les lames à travers une série d'éthanol de concentrations décroissantes pendant 30 secondes chacune.

Pendant le traitement par protéase, non montré dans cette vidéo, préparez un récipient en verre contenant une solution de triéthanolamine à 0,1 molaire et placez-le sur une plaque agitatrice dans une hotte. Juste avant de placer le porte-lame métallique dans la solution, ajoutez 1,25 millilitre d’anhydride acétique dans la triéthanolamine, le tampon et le bain agité. En outre, mettez en place le système de serrage et le support destinés à maintenir le porte-lame.

Réduire la vitesse du bloc chauffant, fixer la grille porte-lames sur le support et abaisser la grille dans la solution, en la maintenant surélevée au-dessus de l'agitateur magnétique. Continuer à agiter doucement pendant 10 minutes après le rinçage dans le PBS et une nouvelle déshydratation par une série d'éthanol. Les coupes tissulaires sont prêtes pour l'hybridation.

Placez les lames sur une surface propre et laissez-les sécher complètement à l'air pendant cinq à dix minutes. Préparez le mélange tampon d'hybridation de la sonde en ajoutant la sonde dénaturée à 80 microlitres de tampon d'hybridation. Pour chaque lame, mélangez soigneusement par pipetage en effectuant des mouvements de va-et-vient, en évitant de former des bulles.

Prélèver le tampon d'hybridation de la sonde. Mélanger sur le bord droit de la lame. Abaisser progressivement une lamelle sur la lame, en veillant à ce que la solution d'hybridation recouvre toutes les sections sans aucune bulle.

Tapotez doucement la lamelle du doigt à l'endroit où se forment les bulles afin de les déplacer de toutes les sections tissulaires. Ne retirez pas la lamelle, car cela endommagerait les sections. Placez les lames dans une chambre humide contenant du papier Watman humidifié avec de l’eau UE et partiellement recouvert de paraffine.

Fermez hermétiquement la boîte et incubez les lames à la température d'hybridation souhaitée, généralement entre 50 et 55 degrés Celsius pendant 16 à 20 heures. À la fin du protocole d'hybridation, retirez soigneusement les lamelles des lames. La lamelle peut simplement tomber lorsqu'on place la lame à la verticale, mais dans le cas contraire, ne tirez pas sur la lamelle car cela endommagerait les sections.

Au lieu de cela, immergez la lame dans du SSC à 0,2 fois, tiède, pendant une à deux minutes pour enlever la lamelle après avoir retiré les lamelles, placez les lames dans un porte-lame et rincez-les plusieurs fois dans du SSC à 0,2 fois à 55 degrés Celsius. Après le traitement par les ARNs, transférez les lames du porte-lame vers le fond d'une boîte en plastique plate et recouvrez-les d'un volume minimal de solution de blocage. Incubez les lames pendant 45 minutes à température ambiante sur une plateforme agitée lentement.

Ensuite, appliquez un volume minimal de solution d'anticorps directement sur chaque lame. Incubez les lames à l'abri de la lumière pendant deux à trois heures à température ambiante. Une fois l'incubation terminée, transférez les lames dans une boîte plate propre et lavez-les quatre fois avec un volume minimal de tampon de lavage sur une plateforme agitée à température ambiante.

Rincez les lames une fois dans le TBS et deux fois dans le tampon TN afin d'appliquer la solution de coloration fraîchement préparée sur les lames. Versez d'abord la solution de coloration dans un petit récipient en plastique pour pesée. Ensuite, placez deux lames l'une contre l'autre, les coupes étant face à face.

Plongez le sandwich dans la solution, en laissant l'effet capillaire remonter la solution. Égouttez les lames sur un essuie-tout. Remplissez les lames avec la solution de coloration.

Encore une fois, il peut être nécessaire de tapoter les lames au fur et à mesure de l'écoulement de la solution afin d'éviter les bulles ; placez ensuite les lames dans une boîte en plastique et conservez-les à température ambiante à l'abri de la lumière. Des résultats représentatifs obtenus avec différentes sondes et tissus d'arabidopsis sont présentés ici. Le signal violet permet une visualisation directe, avec une résolution cellulaire, du patron d'expression du gène d'intérêt.

Le panneau A montre la localisation des transcrits de Meli dans l'apex caulinaire végétatif. Remarquez la présence d'un signal bleu violet dans l'indéterminé du méristème et l'absence de signal dans les feuilles environnantes. Les panneaux B à 2D sont des sections d'embryons d'arabidopsis au stade torpille, où B montre l'expression de covata trois dans les quelques cellules souches embryonnaires.

C montre une expression de T ML one dans la couche épidermique, et D montre l'absence de signal dans des sections hybridées avec un ARN contrôle négatif aléatoire. Ces images suivantes présentent les résultats obtenus avec différentes sondes sur des tissus de maze. Le panneau E montre la localisation de STM Humalog knotted one dans l'embryon de maze en développement.

Remarquez le signal intense spécifiquement dans les tiges embryonnaires et les sections longitudinales des racines à travers l'apex de la gaine végétative, qui montrent que ARF three A est exprimé sur la surface axiale inférieure de la feuille dans le panneau F, et que l'homologue A T ML un, OCL four, est exprimé spécifiquement dans l'épiderme, dans le panneau G. Comme prévu, aucun signal d'hybridation n'a été observé pour la sonde témoin négative dans le panneau H. Les résultats attendus des différents points de contrôle durant la transcription in vitro des sondes sont présentés ici. Les sondes d'hybridation in situ sont vérifiées sur un gel ARAZ standard après la transcription in vitro, après traitement par les ADNases et purification subséquente de la réaction de transcription in vitro, puis après hydrolyse au carbonate. Lorsqu'elles sont prêtes à l'emploi, les sondes de plus de 250 paires de bases de longueur, telles que la sonde un, produiront, suite à l'hydrolyse au carbonate, une gamme de fragments plus petits.

Cette figure présente les résultats de la qualification colorimétrique et métrique de sondes par une analyse de dilutions en dot blot, allant de 10 à la puissance moins un à 10 à la puissance moins cinq, d'une sonde témoin à 100 nanogrammes par microlitre, ainsi que de trois nouvelles sondes marquées à la DIG. Ces sondes sont déposées sur une membrane de transfert, puis incubées avec un anticorps anti-DIG et soumises au test. L'analyse suggère une concentration estimée à 100 nanogrammes par microlitre pour la sonde deux, 10 nanogrammes par microlitre pour la sonde trois et 1 nanogramme par microlitre pour la sonde quatre, indiquant que la sonde quatre est peu susceptible de produire un bon signal de hybridation. Enfin, ces sections longitudinales de l'apex de la gaine végétative provenant de Mace offrent une comparaison entre un signal de fond non spécifique et un panel de sondes fonctionnant correctement.

A montre un signal de fond non spécifique tandis que le panneau B montre un signal spécifique d'hybridation in situ double pour la sonde OC five dans la couche cellulaire externe. Après avoir visionné ceci, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer bon nombre des étapes délicates des protocoles d'hybridation initiale afin de pouvoir déterminer les profils d'expression temporels et précis des gènes de votre choix.