Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

Une méthode pour isoler des types cellulaires spécifiques du matériel végétal est démontrée. Cette technique utilise des lignes de marqueur transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des types cellulaires particuliers, cellulaire dissociation et de tri cellulaire activé par fluorescence. De plus, une installation de croissance est établi ici, qui facilite le traitement des

Cette procédure repose sur l’expression de la GFP par les plantes dans des types de cellules spécifiques, qui peuvent ensuite être isolés du reste des cellules végétales à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence ou de faits. Cet exemple utilise deux lignes de marquage exprimant dans des types de cellules spécifiques de l’Arabidopsis. Les plants de racines d’Aliana sont cultivés dans des plateaux phyto ou sur des plaques de gélose.

Leurs racines sont récoltées et traitées avec des enzymes de digestion de la paroi cellulaire. Au bout d’une heure, la solution est filtrée pour éliminer les gros débris. La solution est ensuite centrifugée et le surnageant est éliminé.

Les protoplastes positifs à la GFP sont ensuite séparés par fax. Le matériel trié peut être utilisé pour l’analyse spécifique au type de cellule, comme les profils transcriptionnels à l’échelle du génome. Bonjour, je suis Basian Barman du laboratoire de Ken Birnbaum au département de biologie de l’Université de New York.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux. Dans cet exemple, nous allons trier deux types de cellules spécifiques dans la route Arabidopsis. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier des profils transcriptionnels spécifiques à un type cellulaire.

Alors commençons. Pour commencer cette procédure, cultivez des semis de type sauvage ainsi que des semis qui ont une expression spécifique de la GFP spécifique au type cellulaire. Le promoteur de l’épouvantail qui entraîne la GFP marque l’endoderme racinaire et le centre quiescent dans un groupe de plantules.

Et dans un autre groupe, le centre de repos racinaire est marqué par les cinq marches promotrices conduisant la GFP. Les semis sont cultivés en hydroponie et des plateaux FIA sont placés sur un filtre en nylon, ce qui permet aux racines de pousser dans le milieu de croissance. Alternativement, les plantes peuvent être cultivées sur un treillis en nylon et des plaques de gélose à 1 % positionnées verticalement.

En plus d’aider à la récolte des racines, les filtres permettent aux plants d’être transférés en masse vers de nouveaux plateaux phyto ou des plaques de gélose où ils peuvent être complétés par un catalyseur d’intérêt. Cela peut être fait pour étudier les réponses transcriptionnelles spécifiques au type cellulaire aux nutriments, aux hormones ou aux traitements contre le stress. Vérifiez au microscope à fluorescence que le marqueur fluorescent est exprimé comme prévu.

Assurez-vous que le modèle d’expression du marqueur est cohérent dans les conditions de traitement appliquées, car il peut changer à la suite du traitement. Procéder à la récolte et à la préparation des protoplastes. Commencez par préparer la solution de protoplastes.

Combinez 1,25 % de cellulase en poids par volume, 0,3 % de poids par volume, de maser zyme, 0,4 molaire, de D, de mannitol, de 20 millimolaires, de MES et de 20 millimolaires, de KCL dans de l’eau déminéralisée et ajustez le pH à 5,7 avec une molaire de tris HCL à pH de 7,5. Cette solution sera légèrement trouble. Ensuite, chauffez la solution à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes.

La solution deviendra claire, la laissera refroidir à température ambiante, puis ajoutera 0,1 % de poids par volume BSA 10 millimolaires de chlorure de calcium et cinq millimolaires d’éthanol bêta-me capto récolter des semis d’une semaine à partir d’un plateau phyto. Dans le cas de l’épouvantail, de la ligne GFP ou de huit plaques de quatre jours marches de semis 5G FP. Grattez les racines du treillis de nylon avec un scalpel, puis déposez-les dans un récipient avec une solution de protoplastes.

Utilisez environ 10 millilitres de solution de protoplastes pour 1500 plantules. Agitez doucement les flacons à 75 tr/min à température ambiante pendant une heure. Un temps d’incubation plus long peut augmenter le rendement des protoplastes, mais ajoutera également à l’effet des protoplastes eux-mêmes sur l’expression des gènes.

Maintenant que les protoplastes sont libérés, utilisez une crépine de cellules de 40 micromètres pour filtrer la solution et divisez la suspension des protoplastes entre des tubes coniques de 15 mil. Il est important de générer une suspension de protoplastes propre sans trop de débris pour éviter l’encrassement des faits et minimiser le temps nécessaire au tri des cellules. Centrifuger les tubes dans une centrifugeuse à godets oscillants à 500 G pendant 10 minutes à température ambiante.

Notez que la vitesse de centrifugation dépend de la constitution de la section de la plante donnant les protoplastes et de la quantité de débris cellulaires produits lors du traitement enzymatique. Après la centrifugation, retirez la majeure partie du surnageant et remettez doucement en suspension la pastille contenant les protoplastes dans le petit volume de solution de protoplastes restants. Enfin, comptez les protoplastes à l’aide d’un hémocytomètre et déterminez leur densité pour calculer le rendement et décider des paramètres de course.

Après le comptage, inspectez les protoplastes. Vérifiez leur intégrité, le niveau d’expression de la GFP et le contenu des débris cellulaires contaminants. Ensuite, passez à la télécopie.

Si ce n’est pas le cas, passez directement par télécopieur. Les protoplastes peuvent être lavés, remis en suspension et stockés dans une solution d’incubation telle qu’une solution de placage de protochromie sans enzymes ajoutées ou une solution W five. Allumez le trieur de cellules et l’ordinateur du poste de travail.

Ici, nous utilisons une friture fabriquée par Becton Dixon and Company. Utilisez un XPBS comme fluide de gaine et exécutez la procédure de démarrage fluidique. Installez une buse de 100 micromètres et réglez une pression de gaine de 20 PSI.

Mettez en place un flux d’écoulement stable et calibrez le délai de chute. Notez que l’étalonnage n’est pas indiqué dans cette procédure. Les suspensions de protoplastes d’une densité allant jusqu’à 10 millions de cellules par mil peuvent être triées avec succès.

Afin d’éviter la sédimentation des protoplastes, utilisez l’option d’agitation de l’échantillon sur les faits. Si l’engorgement des faits est un problème, il y a trois étapes de prise de vue possibles. Tout d’abord, effectuez un retour de vidage de la ligne d’échantillonnage.

Deuxièmement, diluez votre suspension de protoplastes pour réduire la densité. Troisièmement, nettoyez la solution de protoplastes en répétant l’étape de filtration après la centrifugation et la suspension du réus. Seuls quatre paramètres sont utilisés pour distinguer les protoplastes positifs à la GFP des protoplastes négatifs à la GFP et les débris cellulaires après excitation par un laser de 488 nanomètres La diffusion vers l’avant est un indicateur de la taille des particules, la diffusion latérale comme indicateur de la granularité des particules.

Émission à 530 nanomètres comme mesure de la fluorescence verte et émission à 610 nanomètres comme mesure de l’autofluorescence du spectre rouge. Commencez par configurer un graphique à points pour la dispersion directe par rapport à la diffusion latérale. Appliquez le réglage de tension de sorte que les événements mesurés soient centrés dans le graphique.

Les protoplastes positifs à la GFP se distinguent par leur rapport accru entre l’émission verte et l’émission rouge par rapport aux événements d’autofluorescence. Configurez uniquement un graphique à points avec la fluorescence verte par rapport à l’autofluorescence du spectre rouge. Appliquez les paramètres de tension de manière à ce que les événements mesurés donnent lieu à une seule population diagonale dans le graphique.

Lors de l’examen d’une suspension de protoplastes de type sauvage, les PROTOPLASTS positifs à la GFP devraient produire une population claire d’événements fluorescents verts jamais vus dans des échantillons de type sauvage. Définissez des contraintes de compensation pour ajuster le chevauchement spectral entre la fluorescence verte et l’autofluorescence du spectre rouge. En utilisant une suspension PROTOPLASTS positive GFP, des paramètres de contraintes de compensation appropriés permettront une meilleure séparation des protoplastes positifs GFP des protoplastes non GFP et les débris mettront en place une porte pour identifier les événements positifs GFP.

Il est conseillé d’emporter avec vous des PROTOPLASTS non GFP chaque fois que vous préparez une expérience de tri pour aider à définir les limites des portes. Enfin, définissez un seuil de diffusion vers l’avant afin d’exclure les petits débris de l’analyse. La visualisation des événements positifs à la GFP dans le graphique de dispersion vers l’avant par rapport au graphique de dispersion latérale aidera à déterminer où le seuil doit être défini.

Les paramètres définis dans cette première exécution des faits peuvent être réutilisés pour les tris futurs. De légers ajustements seront nécessaires pour l’utilisation quotidienne des faits. Pour l’extraction de l’ARN, préparez des tubes de collecte contenant un tampon d’extraction d’ARN au maximum, utilisez un volume de tri de 100 microlitres à un tampon d’extraction de 350 microlitres comme guide.

20 000 tris donnent un volume total de tri d’environ 100 microlitres. Maintenant que les paramètres et les modes de fonctionnement du fax sont réglés et que les tubes de collecte sont prêts, commencez à trier les protoplastes une fois le tri terminé. Mélangez les tubes de prélèvement d’échantillons car les suspensions cellulaires peuvent s’accumuler au sommet, aussi peu que 500 événements triés peuvent être utilisés pour l’analyse des microréseaux après l’extraction de l’ARN et l’amplification du CD NA.

Ici, nous utilisons le kit de micro-extraction RNEZ, le système d’amplification d’ARN WT ovation PICO et le module de biotine F ovation CD NA V deux. Voici les résultats typiques de fax pour les protoplastes dérivés de semis non GFP Scarecrow, GFP et W 5G FP 100 000 événements sont présentés dans chaque graphique à points de fluorescence verte sur l’axe x par rapport à la fluorescence rouge. Sur l’axe Y, les événements relevant de la porte de tri GFP sont surlignés en vert.

Ceci est un résumé du rendement typique des protoplastes à partir des plantules exprimant soit la GFP de l’épouvantail marquant l’endoderme racinaire et le centre de repos, soit des marches 5G FP marquant le centre de repos de la racine. Il y a moins de cellules dans le centre quiescent de la racine par rapport à l’endoderme racinaire. Par conséquent, bien qu’il ait commencé avec plus de protoplastes, le rendement des cellules exprimant la GFP est plus faible dans le type de marche 5G FP par rapport au type GFP de l’épouvantail montré ici sont des résultats typiques d’extraction d’ARN d’échantillons triples.

Chaque échantillon correspond à l’ARN extrait de 10 000 événements. L’ARN extrait est analysé sur un bioanalyseur montrant les pics ribosomiques pour les échantillons GFP de l’épouvantail en haut et les échantillons 5G FP en dessous de l’ARN extrait peut être utilisé pour l’analyse des microréseaux. Ce nuage de points des niveaux d’expression logarithmique deux démontre la similitude entre deux répétitions.

Nous venons de vous montrer comment effectuer un tri cellulaire activé par fluorescence de protoplastes végétaux pour une analyse spécifique au type de cellule. Cette technique est applicable à de nombreux tissus et espèces végétales différents. De bons rendements avec une faible teneur en débris et des protoplastes sains donneront de meilleurs résultats en aval dans les analyses transcriptionnelles ainsi que dans d’autres analyses.

N’oubliez pas non plus qu’il est important de garder les conditions de croissance du matériel végétal identiques pour la comparaison entre les échantillons triés. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.