Name: Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Découvrez le tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux pour isoler des types cellulaires spécifiques chez Arabidopsis thaliana. Cette méthode FACS permet des analyses transcriptionnelles spécifiques à chaque cellule.

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Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (subvention aucune. DBI 0.519.984) et le National Institutes of Health (subvention aucune. 5R01GM078279) ..

1) Préparation du matériel végétal <ol><li> Les protoplastes peuvent être dérivées de nombreuses espèces de plantes différentes et des tissus sous réserve que la bonne combinaison de la paroi cellulaire des enzymes digérant est utilisé 1. Avant une expérimentation à grande échelle est entreprise, une digestion à petite échelle de la matière est conseillé afin d'évaluer l'efficacité protoplastes du tissu, des enzymes, etc, et d'estimer les cellules pour cent positif pour le tri cellulaire. Ici, les protoplastes dérivés à partir des racines des plants d'Arabidopsis thaliana cette cellule de type expriment spécifiquement la protéine fluorescente verte (GFP) sont utilisés. L'endoderme et le centre de repos sont marquées par P RCS:: GFP et le centre de repos par P WOX5:: GFP 2,3 (figure 1). </li><li> Les plants sont cultivés en hydroponie dans phytatrays (Sigma; figure 2a) sur un filtre en nylon (250 mailles um; NITEX) qui permet la croissance des racines dans le milieu grâce à la croissance (0,22% p / v de Murashige et Skoog basale [sigma], 1% p / v de saccharose, 0,05% p / v MES [2 - (N-morpholino) acide éthanesulfonique], pH 5,7 avec KOH). Alternativement, les plantes peuvent être cultivées sur un filtre en nylon (maille 100 um) en position verticale des plaques d'agar à 1% (Figure 2b). </li><li> L'utilisation des filtres ci-dessus contribue non seulement à la récolte des racines, il facilite également facile de traitement supplémentaire des plants, si désiré. Les filtres permettent les semis à être transférés en masse pour phytatrays nouvelles ou des plaques d'agar complété par un catalyseur d'intérêt. Par exemple, l'ensemble phytatray a été utilisé pour des cellules spécifiques au type d'analyse de la réponse transcriptionnelle au traitement de l'azote dans des plants d'Arabidopsis 4. </li><li> Assurez-vous que votre microscope marqueur fluorescent est correctement exprimé (en particulier lorsque vous utilisez l'option de traitement, comme la cellule de type marqueurs spécifiques eux-mêmes pourraient être influencés par le traitement). Dans ce cas, les plants sont inspectés sous un microscope à fluorescence (Nikon, figure 1). Notez que la cellule spécifique du type lignes marqueur fluorescent devrait être caractérisé d'abord sous un microscope confocal à déterminer exactement quels types de cellules sont marquées et de déterminer la variabilité dans l'expression. </li></ol> 2) Préparation de la solution de protoplastes <ol><li> Dissoudre 1,25% p / v cellulase (Yakult), 0,3% p / v Macerozyme (Yakult), 0,4 M de D-mannitol, 20 mM de MES et 20 mM de KCl (à partir d'un stock de 1 M) dans de l'eau déminéralisée et ajuster le pH à 5,7 avec 1 M Tris / HCl pH 7,5. Cette solution sera légèrement trouble. </li><li> Chauffer la solution à 55 ° C pendant 10 minutes (la solution va devenir clair) et laisser refroidir à température ambiante avant d'ajouter 0,1% p / v de BSA (sérum albumine bovine), CaCl2 10 mM et 5 mM β-mercaptoéthanol . </li></ol> 3) Récolte et protoplastes de la matière végétale <ol><li> Les racines sont récoltées par les grattant le filet de nylon avec un scalpel et déposés dans un flacon contenant la solution protoplastes. Généralement, 10 ml de solution protoplastes est utilisée par 1500 racines des plantules. </li><li> Agiter les flacons en douceur (75 min) à température ambiante pendant une heure. Un temps d'incubation peut augmenter le rendement de protoplastes, mais va également ajouter à l'effet de lui-même protoplastes sur l'expression génique. </li><li> Filtrer la solution de protoplastes avec une passoire cellule 40 um (BD Falcon) et diviser la solution sur des tubes coniques de 15 ml (BD Falcon). </li><li> Faites tourner les tubes dans une centrifugeuse swing-seau pendant 10 minutes à 500 g. Remarquez que cette vitesse de centrifugation va dépendre du type de protoplastes utilisés, leur fragilité et de la quantité de débris de cellules produites pendant le traitement enzymatique. </li><li> Retirez la plupart du surnageant, remettre en suspension les protoplastes dans la solution restante et les inspecter au microscope (figure 3). </li><li> Faire usage d'un hématimètre pour estimer le nombre et la densité de protoplastes. La densité cellulaire permettra de déterminer la vitesse d'injection de l'échantillon, les événements par seconde et donc le temps total nécessaire pour trier les cellules au FACS (voir aussi rubrique 4.3). </li><li> 3.7) Soit procéder directement à FACS ou se laver et remettre en suspension les protoplastes dans une solution d'incubation, comme W5 (154 mM NaCl, 125 mM de CaCl2, 5 mM de KCl, 5 mM MES, ajuster le pH à 5,7 avec KOH) ou de solution sans le protoplastes ajoute des enzymes. Surtout quand on regarde les changements de la transcription, il est d'importance pour minimiser l'exposition des échantillons à des conditions qui pourraient influer sur l'expression des gènes, comme le changement de la mémoire tampon, les protoplastes sont maintenus po Il est donc recommandé de garder les protoplastes dans une solution de protoplastes et de procéder au FACS dès que possible. </li></ol> 4) Le tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes <ol><li> Allumez-le et préparer le trieur de cellules. Ici, un FACSAria (BD) est utilisé. </li><li> Mettre en place un flux de débit avec un 100 m &amp;u; buse m et une pression de 20 psi gaine. </li><li> La densité cellulaire et la vitesse d'injection de l'échantillon peut être ajusté à l'expérience particulière basée sur le savoir si un meilleur rendement possible, ou plus grande vitesse possible est souhaitée. Nous avons trié avec succès avec des densités atteignant 10.000.000 cellules / ml. </li><li> Utilisez l'option d'agitation de l'échantillon sur le FACS pour empêcher la sédimentation des protoplastes. Si le colmatage du FACS est un problème, il ya trois étapes de dépannage possibles: 1. Effectuer un échantillon de rétrobalayage ligne. 2. Diluer la suspension de votre protoplastes pour réduire la densité. 3. Nettoyer la solution de protoplastes en répétant l'étape de filtration (3,3) après centrifugation et resuspension. </li><li> Préparez l'appareil à mesurer diffusion vers l'avant (FSC), la diffusion latérale (SSC) et émission à 530/30 nm pour la GFP et 610/20 nm pour le spectre rouge autofluorescence (RSA) après excitation par un laser à 488 nm. Ce sont essentiellement les seuls paramètres utilisés pour isoler la GFP-positives protoplastes. Ici, les réglages de tension ont été comme suit: FSC - 60V, 250V SSC, la GFP 350V 335V et RSA. Notez que les réglages de tension optimale sera différente pour chaque FACS et sera même pas besoin d'être ajustée pendant toute la durée de la trieuse de cellules. </li><li> Commencez par mettre en place un dotplot pour diffusion vers l'avant par rapport diffusion latérale. Appliquer les réglages de tension de sorte que les événements mesurés sont centrés dans le complot. </li><li> Ensuite, créez un tracé de points de vert par rapport rouges signaux de fluorescence. Appliquer les réglages de tension de sorte que les événements mesurés donnent une population centrée en diagonale dans la parcelle en regardant une suspension de type sauvage protoplastes (non-GFP). Une suspension de protoplastes provenant d'une ligne de marqueur GFP va produire une population claires de vert fluo des événements jamais vus dans des échantillons de type sauvage. </li><li> Régler les contraintes d'ajuster la rémunération de chevauchement spectral entre la GFP et RSA. Une bonne paramètres contrainte de compensation permettra une meilleure séparation des protoplastes GFP-positives à partir des protoplastes non-GFP et de débris. Les contraintes utilisées ici sont comme suit: RSA, moins GFP 17,91%. </li><li> Mettre en place un portail d'identifier GFP-positives événements, un contrôle négatif de la non-GFP protoplastes devrait être utilisé pour aider à définir les limites de grille (figure 4). </li><li> Mettre en œuvre une coupure diffusion vers l'avant afin de laisser sortir les petits débris de l'analyse. Visualisez les événements GFP-positives dans le complot FSC vs SSC pour aider à déterminer le placement de la coupure. Ici, le seuil était fixé à 5000. Notez que le FACS comptera les débris que les événements de tri et d'un échantillon avec un niveau élevé de débris peuvent avoir un pour cent événements différents GFP positives que prévu. Ce n'est pas nécessairement un problème. Cependant, le plus de débris dans l'échantillon, plus le tri va prendre. </li><li> Selon l'expérience et l'abondance du type de cellule à analyser, de définir le mode de précision FACS, soit pour un rendement optimal ou la pureté optimale des cellules triées. </li><li> Pour l'extraction d'ARN, de préparer des tubes de prélèvement (1,5 ml microtubes de) avec la quantité appropriée de tampon d'extraction d'ARN. Avec cette configuration, 20000 évènements de tri donnera un volume total d'environ 100 ul qui ont été triés pour 350 pi de tampon d'extraction (RNeasy Micro Kit, QIAGEN). Mélanger les échantillons après l'achèvement de la sorte que la suspension de cellules peuvent mettre en commun au sommet. </li><li> Conserver les échantillons ou de procéder directement à extraction de l'ARN. Analyses microarray réussies ont été préformé avec l'ARN extrait d'aussi peu que 500 événements triés. Ici, nous avons utilisé un kit d'extraction RNeasy Micro (QIAGEN), le système WT-Ovation Pico amplification de l'ARN et FL-Ovation ADNc Biotine Module V2 (NuGEN). </li></ol> Les résultats représentatifs Un phytatray d'environ 1500 RCS d'une semaine, âgé P: semis GFP a donné environ 60 000 protoplastes (tel que mesuré par hématimètre). 2,6% des 65 000 évènements FACS-transformés ont été définis comme étant GFP-positives et ont été triés (figure 4b). Huit plaques d'environ 1500 de quatre jours, âgé de P WOX5:: GFP plants chacun (12 000 au total) a donné environ 30.000.000 protoplastes (tel que mesuré par hématimètre). 0,063% des 16.000.000 d'événements FACS-traitées ont été définis comme étant GFP-positives et ont été triés (figure 4C). 10.000 manifestations triées sont généralement utilisés pour l'extraction de l'ARN et peut produire de 20 à 140 ng d'ARN total (figure 5). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Cellulaire spécifique du type lignes de marqueur GFP dans la racine d'Arabidopsis. Microscopie à fluorescence images ont été prises avec un contraste d'interférence différentiel (DIC) et une GFP sur un microscope à Eclipse 90i (Nikon) fonctionnant sur ​​le logiciel Metamorph (Molecular Devices) de filtrage. Les images DIC et GFP ont été superposées à des fins de visualisation. Les deux lignes de marqueur utilisé dans cette expérience visuelle sont présentés;a) P RCS:: GFP et b) P WOX5:: GFP. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Plants conditions de croissance. Ont été cultivées dans un contrôleur de l'environnement hydroponique dans phytatrays (a) ou sur gélose positionnée verticalement (b). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Protoplastes de plantes exprimant la GFP. Microscopie à fluorescence images ont été prises avec un contraste d'interférence différentiel (DIC) et un filtre GFP sur un microscope à Eclipse 90i (Nikon) fonctionnant sur ​​le logiciel Metamorph (Molecular Devices). Les images DIC et GFP ont été superposées à des fins de visualisation. Les flèches indiquent une cellule éclatement, les débris cellulaires et d'un protoplaste GFP-positives. La distance entre deux lignes blanches est de 50 um. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Fluorescence tri cellulaire activé de la GFP-positives protoplastes protoplastes issus de type sauvage (a) P RCS.:: GFP (B) ou P WOX5:: GFP (c) des lignes de marqueur ont été analysés et triés avec un FACSAria (BD) en utilisant les portes définies sur un dotplot de vert (530/30 nm; axe des x) par rapport à rouge (610/20 nm; axe Y) de fluorescence. 100 000 événements sont présentés dans chaque parcelle. Les événements relevant de la porte de tri GFP sont surlignés en vert. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Représentant des extractions d'ARN à partir 10.000 cellules triées. Les cellules ont été triées directement dans l'ARN d'extraction du tampon (QIAGEN), l'ARN a été purifié et vérifiées pour la concentration, la pureté et l'intégrité sur un bioanalyseur 2100 (Agilent). Trois répliques pour les deux lignes de marqueur sont affichées.

<ol><li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).</li>
<li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127, 595-603 (2000).</li>
<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+fluorescent+selection+permits+precise%2C+rapid%2C+and+in-depth+overexpression+analysis+in+plant+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts.</a> Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).</li>
<li>Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
</ol>

Les protoplastes peuvent, en principe, être dérivé d&#39;une variété de tissus végétaux, l&#39;optimisation des conditions favorables permettra d&#39;améliorer grandement la qualité et la quantité d&#39;ARN. Tant la solution protoplastes et le tampon d&#39;incubation élective utilisés auront une influence sur cet aspect. Beaucoup de différentes protéines fluorescentes peuvent être utilisés, selon les capacités de la FACS utilisé, par exemple, la GFP, RFP, YFP, CFP ou de leurs nombre...

<table><tbody><tr><td>Maille en nylon de 250 &amp;mu;m</td><td>Sefar Filtration</td><td>NITEX 03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>Maille en nylon de 100 &amp;mu;m</td><td>Sefar Filtration</td><td>NITEX 03-100/47</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri carrées</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-10k</td><td></td></tr><tr><td>Phytatrays</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1552</td><td></td></tr><tr><td>Milieu basal de Murashige et Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>Solution mère à 10 M</td></tr><tr><td>Microscope Eclipse 90i</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellulase R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8041</td><td>Solution mère à 1 M</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2536</td><td>Solution mère à 1 M</td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>Labline Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre cellulaire de 40 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifugeuses de 1,5 ml</td><td>VWR international</td><td>20170-38</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNeasy micro</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Système d'amplification d'ARN WT-Ovation Pico</td><td>NuGEN</td><td>3300_12</td><td></td></tr><tr><td>Module biotine FL-Ovation d'ADNc V2</td><td>NuGEN</td><td>4200_12</td><td></td></tr></tbody></table>

tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Haute résolution, le type spécifique de cellules d&#39;analyse de l&#39;expression génique améliore considérablement la compréhension de la régulation du développement et des réponses aux stimuli de l&#39;environnement dans tout organisme multicellulaire. Hybridation in situ et la visualisation gène rapporteur peut dans une certaine mesure être utilisés à cette fin, mais pour une grande résolution quantitative RT-PCR ou haut-débit à l&#39;échelle d&#39;analyse du transcriptome à l&#39;isolement de l&#39;ARN à partir des types cellulaires particuliers sont requis. Cellulaire dissociation des tissus exprimant un marqueur fluorescent protein dans un type cellulaire spécifique et ultérieures de tri cellulaire par fluorescence (FACS), il est possible de collecter des quantités suffisantes de matériel pour l&#39;extraction d&#39;ARN, d&#39;ADNc analyse de synthèse / amplification et de biopuces. Un vaste ensemble de cellules spécifiques au type de lignes rapporteur fluorescent est disponible à la communauté scientifique des plantes. Dans ce cas, deux lignes de marqueur de la racine d&#39;Arabidopsis thaliana sont utilisées: P RCS:: GFP (endoderme et le centre de repos) et P WOX5:: GFP (centre de repos). Un grand nombre (des milliers) de jeunes plants sont cultivés en hydroponie ou sur plaques de gélose et d&#39;obtenir du matériel récolté assez de racines pour une analyse ultérieure. Cellulaire de dissociation de la matière végétale est obtenue par digestion enzymatique de la paroi cellulaire. Cette procédure permet l&#39;utilisation de haute osmolalité induite par plasmolyse et cellulases disponibles dans le commerce, pectinases et hémicellulases pour libérer protoplastes dans la solution. FACS de GFP-positives cellules permet l&#39;utilisation de la visualisation des verts contre les spectres d&#39;émission rouge de protoplastes excité par un laser à 488 nm. GFP-positives protoplastes peuvent être distingués par leur ratio est passé du vert à l&#39;émission de rouge. Les protoplastes sont généralement triés directement dans un tampon d&#39;extraction de l&#39;ARN et stockés pour un traitement ultérieur à une date ultérieure. Cette technique se révèle être simple et réalisable. Par ailleurs, il est démontré qu&#39;il peut être utilisé sans difficulté d&#39;isoler un nombre suffisant de cellules pour l&#39;analyse du transcriptome, même pour des types de cellules très rares (par exemple les cellules du centre de repos). Enfin, une installation de croissance des semis d&#39;Arabidopsis est démontré que le traitement permet simple des plantes avant de tri cellulaire (par exemple pour le type spécifique de cellules d&#39;analyse des réponses au stress biotiques ou abiotiques). Supplémentaires éventuelles utilisations des FACS des protoplastes végétaux sont discutées.

Une méthode pour isoler des types cellulaires spécifiques du matériel végétal est démontrée. Cette technique utilise des lignes de marqueur transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des types cellulaires particuliers, cellulaire dissociation et de tri cellulaire activé par fluorescence. De plus, une installation de croissance est établi ici, qui facilite le traitement des<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semis avant le tri cellulaire.

Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

L'analyse de l'expression génique à haute résolution et spécifique au type cellulaire améliore considérablement la compréhension de la régulation du développement et des réponses aux facteurs environnementaux...

Cette procédure repose sur l'expression de la GFP chez des plantes dans des types cellulaires spécifiques, qui peuvent ensuite être isolées à partir des autres cellules végétales par tri cellulaire activé par fluorescence, ou FACS. Cet exemple utilise deux lignées marqueuses exprimant la GFP dans des types cellulaires spécifiques d'Arabidopsis. Les semis de racines d'Arabidopsis sont cultivés dans des plaques phyto ou sur des boîtes de gélose.Leurs racines sont récoltées et traitées avec des enzymes digestives de la paroi cellulaire. Après une heure, la solution est filtrée pour éliminer les débris grossiers. Ensuite, la solution est centrifugée et le surnageant est retiré.Les protoplastes positifs pour la GFP sont ensuite séparés par FACS. Le matériel trié peut être utilisé pour des analyses spécifiques à un type cellulaire, telles que les profils transcriptionnels à l'échelle du génome. Bonjour, je suis Basian Barman du laboratoire de Ken Birnbaum, Département de biologie de l'Université de New York.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de tri cellulaire activé par fluorescence de protoplastes végétaux. Dans cet exemple, nous allons trier deux types cellulaires spécifiques dans la racine d'Arabidopsis. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les profils transcriptionnels spécifiques à chaque type cellulaire.Commençons. Pour commencer cette procédure, faites pousser des plantules de type sauvage ainsi que des plantules exprimant de manière spécifique à un type cellulaire la GFP. Le promoteur de scarecrow contrôlant l'expression de la GFP marque l'endoderme racinaire et le centre quiescent dans un groupe de plantules.Et dans un autre groupe, le centre quiescent de la racine est marqué par le promoteur walks five qui contrôle l'expression de la GFP. Les plantules sont cultivées de manière hydroponique dans des plaques FIA placées sur un filtre en nylon, ce qui permet aux racines de traverser le filtre et de croître dans le milieu de croissance. Alternativement, les plantes peuvent être cultivées sur un treillis en nylon et sur des plaques d'agar à 1 % positionnées verticalement.En plus de faciliter la récolte des racines, les filtres permettent de transférer en masse les semis vers de nouvelles boîtes phyto ou vers des plaques d'agar où ils peuvent être supplémentés avec un catalyseur d'intérêt. Cette étape peut être réalisée afin d'étudier les réponses transcriptionnelles spécifiques à un type cellulaire en réponse à des nutriments, des hormones ou des traitements de stress. Observer au microscope à fluorescence pour vérifier que le marqueur fluorescent est exprimé comme attendu.Vérifiez que le profil d'expression du marqueur est constant dans les conditions de traitement appliquées, car il peut être modifié par le traitement. Procédez ensuite à la récolte et à la préparation des protoplastes. Commencez par préparer la solution de protoplastes.Combiner 1,25 % poids par volume de cellulase, 0,3 % poids par volume de maser zyme, 0,4 molaire de D-mannitol, 20 millimolaires de MES et 20 millimolaires de KCl dans de l’eau déminéralisée, puis ajuster le pH à 5,7 à l’aide d’une solution de Tris-HCl 1 molaire à pH 7,5. Cette solution sera légèrement trouble. Ensuite, chauffer la solution à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes.La solution deviendra limpide ; laissez-la refroidir à température ambiante, puis ajoutez du BSA à 0,1 % poids par volume, du chlorure de calcium à 10 millimolaire et du bêta-mécaptoéthanol à 5 millimolaire. Récoltez des semis âgés d'une semaine provenant d'un plateau phyto. Dans le cas de la lignée GFP scarecrow, ou de huit plaques de semis GFP 5G âgés de quatre jours, grattez les racines du maillage en nylon à l’aide d’un scalpel, puis déposez-les dans un récipient contenant une solution de protoplastes.Utilisez environ 10 millilitres de solution de protoplastes pour 1500 plantules. Agitez doucement les flacons à 75 tr/min à température ambiante pendant une heure. Un temps d'incubation plus long peut augmenter le rendement en protoplastes, mais renforcera également l'effet des protoplastes eux-mêmes sur l'expression génique.À présent que les protoplastes sont libérés, utilisez un tamis cellulaire de 40 micromètres pour filtrer la solution et répartir la suspension de protoplastes entre des tubes coniques de 15 ml. Il est important d'obtenir une suspension de protoplastes propre, contenant peu de débris, afin d'éviter l'obstruction des faits et de minimiser le temps nécessaire au tri des cellules. Faites centrifuger les tubes dans une centrifugeuse à godets tournants à 500 ×g pendant 10 minutes à température ambiante.Remarquez que la vitesse de centrifugation dépend de la constitution de la section végétale fournissant les protoplastes et de la quantité de débris cellulaires produits lors du traitement enzymatique. Après la centrifugation, éliminez la majeure partie du surnageant et redispensez délicatement le culot contenant les protoplastes dans un petit volume de la solution de protoplastes restante. Enfin, comptez les protoplastes à l'aide d'un hémocytomètre et déterminez leur densité afin de calculer le rendement et de définir les paramètres des expériences à réaliser.Après le comptage, inspectez les protoplastes. Vérifiez leur intégrité, le niveau d'expression de la GFP et la présence de débris cellulaires contaminants. Ensuite, procédez à la fax.Si l'on ne passe pas directement à la télécopie. Les protoplastes peuvent être lavés, resuspendus et stockés dans une solution d'incubation telle que la solution de protoplation sans les enzymes ajoutées ou la solution W5. Allumez le trieur de cellules et l'ordinateur de la station de travail.Ici, nous utilisons un fria fabriqué par Becton Dixon and Company. Utilisez un XPBS comme fluide de gainage et exécutez la procédure de démarrage du système fluidique. Installez un orifice de 100 micromètres et réglez une pression de gainage de 20 PSI.Installez un flux stable et étalonnez le délai de goutte. Notez que l'étalonnage n'est pas illustré dans cette procédure. Des suspensions de protoplastes ayant une densité allant jusqu'à 10 millions de cellules par millilitre peuvent être triées avec succès.Afin d'éviter la sédimentation des protoplastes, utilisez l'option d'agitation de l'échantillon sur le facts. Si l'obstruction du facts pose problème, il existe trois étapes de tir possibles. Premièrement, effectuez un rinçage arrière de la ligne d'échantillon.Deuxièmement, diluez votre suspension de protoplastes afin de réduire la densité. Troisièmement, purifiez la solution de protoplastes en répétant l'étape de filtration après la centrifugation et la resuspension. Quatre paramètres seulement sont utilisés pour distinguer les protoplastes positifs pour la GFP des protoplastes négatifs pour la GFP et des débris cellulaires après excitation par un laser de 488 nanomètres : la diffusion avant est un indicateur de la taille des particules, la diffusion latérale servant d'indicateur de la granularité des particules.Émission à 530 nanomètres en tant que mesure de la fluorescence verte et émission à 610 nanomètres en tant que mesure de l'autofluorescence du spectre rouge. Commencez par configurer un diagramme de dispersion de la diffusion avant en fonction de la diffusion latérale. Appliquez le réglage de tension de sorte que les événements mesurés soient centrés dans le graphique.Les protoplastes positifs pour la GFP peuvent être distingués par leur rapport accru d'émission verte par rapport à rouge comparé aux événements présentant une autofluorescence. Ne configurez qu'un graphique de type nuage de points avec la fluorescence verte en fonction de l'autofluorescence du spectre rouge. Appliquez des réglages de tension de manière à ce que les événements mesurés forment une seule population diagonale sur le graphique.Lors de l'observation d'une suspension de protoplastes de type sauvage, les PROTOPLASTES positifs pour la GFP devraient former une population nette d'événements fluorescents verts, jamais observée dans les échantillons de type sauvage. Réglez les paramètres de compensation afin de corriger le recouvrement spectral entre la fluorescence verte et l'autofluorescence du spectre rouge. À l'aide d'une suspension de PROTOPLASTES positifs pour la GFP, un réglage approprié des paramètres de compensation permettra une meilleure séparation des protoplastes positifs pour la GFP par rapport aux protoplastes négatifs et aux débris, et permettra de définir une fenêtre d'analyse pour identifier les événements positifs pour la GFP.Il est conseillé d'inclure des protoplastes non GFP à chaque préparation d'une expérience de tri afin de faciliter la définition des limites de la fenêtre d'analyse. Enfin, fixez un seuil de coupure de la diffusion avant afin d'exclure les petits débris de l'analyse. La visualisation des événements positifs pour la GFP sur le graphique de la diffusion avant versus la diffusion latérale aidera à déterminer l'endroit où le seuil doit être fixé.Les paramètres configurés lors de cet essai initial peuvent être réutilisés pour des triages ultérieurs. De légers ajustements seront nécessaires pour l'utilisation quotidienne des faits. Pour l'extraction d'ARN, préparez des tubes de collecte contenant du tampon d'extraction d'ARN ; utilisez au maximum un volume de tri de 100 microlitres pour 350 microlitres de tampon d'extraction, à titre indicatif.20 000 événements de tri produisent un volume total de tri d'environ 100 microlitres. Maintenant que les paramètres du trieur et les modes de fonctionnement sont réglés et que les tubes de collecte sont prêts, commencez le tri des protoplastes lorsque le tri est terminé. Mélangez les tubes de collecte d'échantillons, car la suspension cellulaire peut s'accumuler en surface ; aussi peu que 500 événements triés peuvent être utilisés pour une analyse par puces à ADN après extraction de l'ARN et amplification de l'ADN complémentaire.Ici, nous utilisons le kit de micro-extraction RNEZ, le système d'amplification ARN WT Ovation PICO et le module biotine ADN Fl Ovation V2. Voici des résultats typiques de cytométrie en flux pour des protoplastes issus de plantules non GFP Scarecrow, GFP et W 5G FP. Cent mille événements sont présentés sur chaque diagramme de dispersion, avec la fluorescence verte en abscisse et la fluorescence rouge en ordonnée. Les événements situés dans la fenêtre de tri GFP sont mis en évidence en vert.Il s'agit d'un résumé du rendement typique de protoplastes obtenu à partir de plantules exprimant soit la GFP marquant l'endoderme racinaire et le centre quiescent, soit la walks 5G FP marquant le centre quiescent racinaire. Le centre quiescent racinaire contient moins de cellules que l'endoderme racinaire. Par conséquent, malgré un départ avec un plus grand nombre de protoplastes, le rendement en cellules exprimant la GFP est plus faible dans le tri walks 5G FP par rapport au tri scarecrow GFP. Les résultats présentés ici correspondent à des extractions d'ARN typiques réalisées sur des échantillons en triplicat.Chaque échantillon correspond à l'ARN extrait de 10 000 événements. L'ARN extrait est analysé sur un bioanalyseur, montrant les pics ribosomaux pour les échantillons GFP de scarecrow en haut et les échantillons FP de walks 5G en bas. L'ARN extrait peut être utilisé ultérieurement pour une analyse par microarray. Ce graphique de dispersion des niveaux d'expression en log₂ illustre la similarité entre deux réplicats.Nous venons de vous montrer comment effectuer le tri cellulaire activé par fluorescence de protoplastes végétaux pour une analyse spécifique selon le type cellulaire. Cette technique s'applique à de nombreux tissus et espèces végétales différents. De bons rendements, avec une faible teneur en débris et des protoplastes sains, permettront d'obtenir de meilleurs résultats en aval, tant dans les analyses transcriptionnelles que dans d'autres types d'analyses.N'oubliez pas également qu'il est important de maintenir des conditions de croissance identiques pour le matériel végétal afin de permettre la comparaison entre les échantillons triés. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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