Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

L'objectif général de cette procédure est d'observer le déplacement de protéines marquées par fluorescence à la surface des cellules végétales à l'aide d'une microscopie en épifluorescence à angle variable. Ce dispositif peut nous aider à progresser dans le domaine de la biologie cellulaire végétale, notamment en élucidant le fonctionnement des protéines à la surface des cellules végétales. Le principal avantage de cette technique est qu'elle nous permet de visualiser en temps réel la dynamique de protéines fluorescentes avant de commencer la procédure.

Étalonner le centrage et la mise au point du laser du microscope conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, utiliser un trajet optique libre de l'objectif pour localiser le centre du plafond de la salle de microscopie et marquer la position avec un scellant de couleur. Puis, éclairer le plafond à l'aide de l'objectif et déplacer la zone éclairée jusqu'à la position centrale.

Ensuite, focalisez le laser et ajustez précisément sa position au centre du plafond. Le centrage et la mise au point du laser sont très importants pour une observation réussie au microscope épiscopique à angle variable (VAEM). Les utilisateurs doivent être formés par un technicien qualifié de la société fabricante du microscope avant de commencer une expérience.

Lorsque le microscope est prêt, déposer 30 microlitres de tampon basal au centre d'une lame en verre de 76 par 26 millimètres. Ensuite, utiliser des ciseaux de dissection pour prélever un côlon de bouture d'une plantule âgée de sept jours et placer le côlon de bouture côté observation vers le haut sur la goutte de tampon basal. Ajouter ensuite 30 microlitres de tampon basal au centre d'un couvre-objet de 18 par 18 millimètres.

Couvrez le verre et retournez-le. La tension superficielle empêchera doucement la goutte de tomber ; tenez le verre de couverture avec des pinces sur un bord. Placez le bord opposé sur la lame de verre de manière à ce que le tampon se trouve au-dessus de l'entrée du co.

Ensuite, en maintenant le bord de la lame couvre-objet sur la lame porte-objet, ajustez la position de la goutte pour qu'elle se trouve directement au-dessus de l'échantillon d'oléine, puis laissez tomber la lame couvre-objet. S'il n'y a pas de bulles d'air, utilisez des mouchoirs sans peluches pour essuyer l'excès de tampon et transférez immédiatement la préparation au microscope.

À l’aide de l’éclairage en champ clair, sélectionnez les cellules à observer. Ensuite, vérifiez que la protéine fluorescente est visible et utilisez l’éclairage en fluorescence épiscopique pour régler la position selon l’axe Z au niveau de la surface cellulaire. Pour réaliser la microscopie à angle variable (VAEM), utilisez la boîte de commande afin d’incliner l’angle d’entrée du faisceau laser.

Progressivement, tout en surveillant attentivement l'image en direct. Au départ, l'image apparaîtra floue. À mesure que l'angle du laser augmente, l'image VAEM deviendra moins floue, produisant finalement une image nette.

À ce stade, cessez d'augmenter l'angle du laser. Réglez maintenant finement l'angle d'entrée du laser pour obtenir une meilleure image, en ajustant les paramètres optiques et du capteur d'image selon les besoins.

Ensuite, à l’aide du logiciel commercial du microscope, acquérez un film sous forme de fichier image TIFF multipage. Ici, le film montre des points marqués par la GFP qui clignotent à la surface des cellules modèles STA. Pour quantifier le temps de séjour des points marqués par la GFP à l’aide de Fiji, accédez au menu ouvrir du fichier, puis ouvrez le fichier TIFF multipage acquis.

Utilisez l'outil de sélection de ligne droite pour placer une ligne sur le côté d'intérêt. Ensuite, utilisez le plugin d'image dynamique par tranches de piles d'images pour générer une image du graphique. Lorsque la ligne change, l'image du graphique change dynamiquement.

Enregistrez l'image au format TIFF dans le fichier, via le menu Enregistrer sous TIFF. Ensuite, pour effectuer une réduction du bruit, accédez au menu Filtres du traitement Fltrage gaussien et appliquez un filtre gaussien aux images chronographiques. Le paramètre du rayon sigma doit être ajusté selon les besoins.

À l'aide de l'outil de réglage du seuil d'image, segmentez les régions de signal par seuillage et ouvrez le menu analyser les mesures définies. Ensuite, cochez le rectangle englobant dans la fenêtre des mesures définies, en sélectionnant le nombre minimal de pixels possible. Puis, dans le menu analyser, sélectionnez analyser les particules.

Mesurez la durée du point d'intérêt par rapport à l'axe Y, vérifiez les résultats affichés et ajoutez-les aux zones de gestion pour visualiser les valeurs des données. Enfin, dans le menu du tableau des résultats, sélectionnez Fichier, Enregistrer sous, puis traitez le jeu de données des durées des images de points à l’aide du logiciel d’analyse approprié. Ici, les temps de séjour de 185 points GFP Patrol1 provenant de 12 cellules subsidiaires indépendantes chez huit édin, mesurés par analyse graphique chm, sont présentés comme illustré sur le graphique.

La fonction de densité ajustée a révélé que la majorité des points GFP Patrol1 résidaient dans une cellule subsidiaire entre deux et dix secondes, avec un pic d'environ 3,5 secondes. Cela suggère une exocytose et une endocytose rapides des pompes à protons à la surface de la cellule subsidiaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de visualiser et de quantifier la dynamique des protéines de type ary à la surface des cellules végétales à l'aide de la microscopie épifluorescente à angle variable.