Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

L’objectif général de cette procédure est d’observer le mouvement des protéines marquées par fluorescence à la surface des cellules végétales à l’aide de la microscopie à épifluorescence à angle variable. Ce vaisseau peut nous aider à progresser dans le domaine de la biologie cellulaire végétale, comme le fonctionnement des protéines à la surface des cellules plaques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de visualiser en temps réel la dynamique des protéines d’attaque fluorescentes avant de commencer la procédure.

Calibrez le centrage et la mise au point laser du microscope selon les instructions du fabricant. Ensuite, utilisez un chemin de lumière libre de lentille d’objectif pour localiser le centre du plafond de la salle de microscopie et marquez la position avec un joint coloré. Ensuite, illuminez le plafond avec une lentille d’objectif et déplacez la région éclairée en position centrale.

Ensuite, concentrez le laser et ajustez la position du laser au centre du plafond. Le centrage et la focalisation du laser sont très importants pour la réussite de l’observation au microscope épiscopal à angle variable ou VAEM. Les utilisateurs doivent être formés par un professionnel de l’entreprise de microscope avant de commencer une expérience.

Lorsque le microscope est prêt, versez 30 microlitres de tampon basal au centre d’une lame de verre de 76 x 26 millimètres. Ensuite, utilisez des ciseaux à dissection pour retirer une co-plombine d’un semis de sept jours et faites flotter la co-plombine avec le côté observation vers le haut sur la goutte tampon basale. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de tampon basal au centre d’un tampon de 18 x 18 millimètres.

Protégez la vitre et retournez la vitre de protection. Une légère tension superficielle empêchera la goutte de tomber, en tenant le verre de protection avec une pince à épiler sur un bord. Placez le bord opposé sur la glissière en verre de sorte que le tampon soit au-dessus de l’entrée du co.

Maintenez ensuite le bord de la vitre de protection sur la diapositive. Ajustez la position de la goutte de manière à ce qu’elle soit directement au-dessus de l’échantillon d’oléine et laissez tomber le verre de protection. S’il n’y a pas de bulles d’air, utilisez des mouchoirs non pelucheux pour essuyer l’excès de tampon et transférez immédiatement la préparation au microscope.

À l’aide de l’éclairage en fond clair, sélectionnez les cellules à observer. Ensuite, confirmez que la protéine fluorescente peut être observée et utilisez l’éclairage par épifluorescence pour définir la position de l’axe Z à la surface de la cellule. Pour effectuer VAEM, utilisez le boîtier du contrôleur pour incliner l’angle d’entrée du faisceau laser.

Progressivement tout en surveillant attentivement l’image en direct. Au départ, l’image apparaîtra floue. Au fur et à mesure que l’angle du laser augmente, l’image VAEM devient moins floue, produisant finalement une image claire.

À ce stade, arrêtez d’augmenter l’angle du laser. Maintenant, très bien. Réglez l’angle d’entrée du laser pour obtenir une meilleure image, en ajustant les paramètres optiques et du capteur d’image si nécessaire.

Ensuite, à l’aide du logiciel de microscope commercial, acquérez un film sous forme de fichier d’image TIFF de plusieurs pages. Ici, la vidéo montre des points étiquetés GFP clignotant à la surface des cellules du modèle STA. Pour quantifier le temps de séjour DOT étiqueté GFP à l’aide de Fidji, allez dans le menu d’ouverture de fichier et ouvrez le fichier de conseil de plusieurs pages acquis.

Utilisez l’outil de sélection de ligne droite pour placer une ligne du côté qui vous intéresse. Ensuite, utilisez le plugin image stacks dynamic res slice pour générer une image graphique. Au fur et à mesure que la ligne change, l’image du graphique change dynamiquement.

Enregistrez l’image en tant que fichier TIFF sous le menu fichier, enregistrer en tant que tiff. Ensuite, pour effectuer une réduction du bruit, allez dans le menu des filtres de processus Flou gaussien et appliquez un filtre gaussien aux images du chronographe. Le paramètre de rayon sigma doit être réglé si nécessaire.

À l’aide de l’outil de réglage du seuil d’image, segmentez les régions du signal par seuillage et ouvrez le menu Analyser les mesures. Ensuite, vérifiez le rectangle englobant dans la fenêtre des mesures définies, en sélectionnant le nombre minimum de pixels possible. Ensuite, dans le menu analyser, analyser les particules.

Mesurez le temps du point d’intérêt par rapport à l’axe Y, vérifiez les résultats d’affichage et ajoutez aux zones de gestion pour afficher les valeurs des données. Enfin, dans le menu du tableau des résultats, sélectionnez fichier, enregistrez sous et traitez l’ensemble de données des durées d’image de point à l’aide du logiciel d’analyse approprié. Ici, les temps de séjour de 185 GFP patrouillent un point de 12 cellules subsidiaires indépendantes en huitième édition, tels que mesurés par l’analyse graphique chm, sont indiqués comme illustré dans le graphique.

La fonction de densité ajustée a révélé que la plupart des points de patrouille GFP résidaient dans une cellule subsidiaire pendant entre deux et 10 secondes avec un pic d’environ 3,5 secondes. Cela suggère une endocytose d’exocytose rapide des pompes à protons à la surface de la cellule subsidiaire. Après avoir travaillé sur cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser et de quantifier la dynamique des protéines de type aire à la surface des cellules végétales à l’aide de la microscopie à épifluorescence à angle variable.