Analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil Self-Made Cytospin

Bonjour, je m’appelle Rick Pasqua, étudiant au Laboratoire d’ingénierie des cellules souches du Département de chimie et des sciences de la vie de l’Université du Commonwealth de Virginie. Dans cette vidéo, je vais démontrer comment notre laboratoire utilise un appareil de spin STO peu coûteux et fabriqué par nos soins pour créer une monocouche observable de cellules souches pluripotentes humaines pour la quantification des marqueurs de surface cellulaire. Étant donné que de nombreux protocoles immunochimiques sont adaptés aux CSP h cultivées dans des lames de chambre en tant que colonies, des problèmes peuvent survenir lors de la caractérisation de l’expression des biomarqueurs au niveau cellulaire individuel.

Le fait d’avoir les cellules dans une monocouche aide non seulement à l’analyse visuelle de celles-ci, mais peut-être aussi à quantifier leur expression, l’appareil de spin sinusal utilisé par nos laboratoires peut être construit à l’aide de matériaux trouvés dans la plupart des laboratoires n’a besoin que d’un petit échantillon de cellules et n’a besoin d’aucun type de réactif spécifique. Et plus important encore, il est capable de reproduire de manière fiable une propagation de cellules uniques pour l’observation. Voici quelques-unes des choses dont vous aurez besoin pour construire l’appareil cytosine.

Lames en plastique, comme elles ne doivent pas nécessairement être propres, vous pouvez utiliser de vieilles lames de chambre si vous le souhaitez. Lames de verre pré-nettoyées. Ceux-ci doivent être nettoyés car c’est là que la monocouche cellulaire sera créée.

Papier filtre, n’importe quel type devrait faire, et pointes de micro-pipette. Des pointes d’un à 10 microlitres sont ce que notre laboratoire utilise avant que la construction puisse commencer. Des trous doivent d’abord être percés dans les glissières en plastique.

Cela peut être fait à l’aide d’une perceuse à colonne. Le diamètre des trous dépend de la taille de la pointe de la micro-pipette et doit être à peu près la largeur de la section la plus large de la pointe utilisée pour une pointe standard de une à 10 micro-pipettes. Celle-ci devrait être d’environ sept millimètres.

Le nombre de trous que vous créez dans les lames en plastique dépend entièrement de l’utilisation que vous comptez en faire. Pour la coloration immunochimique de notre laboratoire, par exemple, nous utilisons généralement deux trous, l’un pour la coloration positive et l’autre pour le contrôle du bruit de fond négatif. Ces diapositives peuvent être réutilisées pour un nombre indéfini de temps.

Pour le papier filtre, il suffit d’en découper un morceau selon les paramètres de la glissière en plastique. Utilisez les trous de la lame comme référence pour faire des trous sur le papier filtre. La taille du trou sur le papier filtre doit être suffisamment grande pour que la pointe de la micro-pipette puisse s’adapter parfaitement, comme illustré ici.

Nous devons ensuite découper le nombre approprié de pointes de micro-pipette, une pour chaque trou d’environ la moitié de sa longueur. Celui-ci servira de base à la lame de verre pour laquelle la monocouche cellulaire sera créée. Ensuite, le papier filtre sera placé par-dessus.

Le papier filtre servira à absorber tout excès de matière provenant de la coloration en suspension. Celui-ci sera ensuite surmonté par la glissière en plastique qui servira de support solide à l’appareil. Celui-ci peut ensuite être scellé sur les quatre côtés avec du ruban adhésif ménager ordinaire.

Enfin, des pointes de micropipettes entières sont ensuite insérées dans les pointes coupées de l’appareil. C’est là que seront placés les échantillons cellulaires suivant la coloration en suspension. Il peut également être utile de marquer d’abord l’endroit où se trouvent les pointes coupées sur la diapositive de verre pour une reconnaissance plus pratique.

Le protocole de coloration immunochimique en suspension utilisé par notre laboratoire implique la première récolte de cellules souches dans une suspension cellulaire unique, généralement par enzymatique, à l’aide de trypsine ou de tampons de dissociation cellulaire non enzymatiques à base d’EDTA. Les cellules sont ensuite transférées sur un ml de microtubes à centrifuger de deux ml et leur milieu de croissance standard. Ceux-ci sont ensuite centrifuges à 200 G pendant quatre minutes.

La même vitesse de centrifugation sera utilisée pour toutes les étapes de lavage et d’essorage ultérieures. Le milieu est ensuite aspiré manuellement, soyez très prudent lors de l’aspiration pour vous assurer que la pastille cellulaire n’est pas dérangée. Celui-ci est ensuite lavé avec un ml de PBS, en l’essorant deux fois et en l’aspirant à chaque fois.

L’étape suivante consiste à réparer les cellules à l’aide de 4 % de paires de réactifs de formaldéhyde ou de PFA nécessaires à la fabrication de cette vidéo. Les cellules sont incubées dans la solution de formaldéhyde à 4 % et laissées à température ambiante pendant 10 minutes. Il est recommandé d’effectuer cette étape avant la suspension extracellulaire ex, coloration pour l’utilisation de l’appareil de spin cyto.

Ensuite, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS pour éliminer les traces de PFA. La cellule doit ensuite être bloquée pour éviter une coloration non spécifique. Après les lavages PBS à l’étape précédente, aspirez le lavage et ajoutez un ml de solution de blocage.

Il faut ensuite le laisser à température ambiante pendant environ 45 minutes. En attendant la solution bloquante, vous pouvez préparer l’anticorps primaire en le diluant à la solution de dilution et de blocage recommandée. Conservez-le à quatre degrés Celsius.

Une fois que les cellules ont été dans la solution de blocage pendant environ 45 minutes, tournez vers le bas et aspirez-la et mettez-les en suspension dans la solution d’anticorps primaire. Afin de détecter la liaison non spécifique et le contrôle de l’arrière-plan, il est préférable de conserver au moins un échantillon négatif. Aucun anticorps primaire n’a été appliqué et est simplement en suspension dans le PBS.

Tous les échantillons sont laissés à température ambiante pendant environ une heure. Si vous le souhaitez, les cellules fixes peuvent être laissées en suspension dans la solution d’anticorps primaire pendant la nuit et lavées deux fois avec une solution de blocage. La solution d’anticorps secondaire peut être préparée pendant le lavage.

Les anticorps secondaires sont généralement sensibles à la lumière, donc si possible, tamisez les lumières de laboratoire et couvrez tous les récipients utilisés avec du papier d’aluminium, ceci est fait pour empêcher le blanchiment par fluorescence. Les réactifs antifa peuvent être incorporés dans le protocole, mais des précautions doivent être prises lors de leur utilisation car cela peut entraîner un bruit de fond plus élevé comme l’anticorps primaire dilué à la concentration recommandée dans une solution bloquante. Appliquer un vis à tous les échantillons, qu’un primaire y ait été ajouté ou non une fois le lavage terminé.

Laissez-le reposer dans un endroit sombre, comme à l’intérieur d’un bocal, pendant environ une heure. Lavez deux fois les cellules avec un ml de solution de blocage. La cellule devrait maintenant être prête pour la coloration nucléaire avec un colorant DPI.

Préparez d’abord la solution DPI à une dilution de un à 10 000 dans du PBS, lavez les cellules dans un ml de PBS une fois, puis réanimez-les, suspendez-les dans le dpi et laissez-les reposer à température ambiante pendant environ cinq à 10 minutes. Comme l’anticorps secondaire, le DAPI est sensible à la lumière, alors faites les ajustements nécessaires pour éviter la fluorescence et le blanchiment. Laver une fois avec un ml de PBS et enfin, reus.

Suspendez à nouveau dans un ml PBS. Celui-ci devrait alors être prêt à être utilisé avec un appareil de spin cyto. Placez au maximum 100 microlitres de la solution à cellule unique dans le haut des pointes des micropipettes.

Une quantité inférieure est cependant recommandée pour éviter un débordement ou une goutte inutile. Après. Placez un appareil de spin cyto et le contrepoids dans une centrifugeuse de bureau et faites tourner à 1000 tr/min pendant quatre minutes. Ensuite, démontez soigneusement l’appareil de spin cyto de manière à minimiser le risque de délogement des cellules de la lame de verre.

Vérifiez que la position debout a eu lieu sous microscope à fluorescence avant le montage. Il s’agit de photos prises d’une monocouche de cellules BG 1 V colorées avec des marqueurs de surface SSCA à quatre cellules de l’appareil de spin cyto. Remarquez à quel point les cellules sont isolées les unes des autres, ce qui rend possible l’observation et l’enregistrement d’une seule cellule.

Ce qui est bien avec ce protocole, c’est qu’il est capable de reproduire des cellules monocouches, ce qui est faisable, rentable et facilement adaptable pour toute analyse de routine de cultures de cellules souches. Donc, avec cela, j’espère que vous dessinerez cette vidéo et que vous trouverez le protocole d’utilisation dans vos propres recherches.