Name: Analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil Self-Made Cytospin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Découvrez une méthode d'immunocytochimie pour les cellules souches pluripotentes humaines utilisant un appareil cytospin artisanal. Cette technique permet de créer une monocouche cellulaire pour l'observation et la quantification fiable des marqueurs de surface.

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Un financement partiel de ce travail a été fourni par NSF-CAREER 0744556 (Rao) et une bourse par le biais de l&#39;éducation VCU-HHMI Programme de sciences et de la recherche (Pascual).

Partie 1: Coloration Suspension immunocytochimique <ol><li> Les cellules sont récoltées dans une suspension cellulaire unique. </li><li> Les cellules sont ensuite transférés dans des microtubes de 1,5 2mL et centrifugé à 200g pendant 4 minutes. </li><li> Les cellules sont lavées par l&#39;aspiration à surnageant, remis en suspension dans 1ml de PBS - (sans Mg 2 + et Ca 2 +) et ensuite centrifugé à nouveau à 200g pendant 4 minutes. Cela devrait être fait deux fois. </li><li> Après lavage, les cellules sont alors fixées par remise en suspension eux dans 1 ml de paraformaldéhyde 4% (PFA) à température ambiante pendant 10 minutes. </li><li> Les cellules sont lavées à nouveau deux fois avec 1 mL de PBS -. </li><li> Après le lavage des cellules bloc, en re-suspension eux dans 1 ml de solution Block (6% serum/94% PBS -). Incuber ces à température ambiante pendant 45 minutes. </li><li> Après, centrifuger les tubes à 200g pendant 4 minutes et aspirer à la solution de bloc. Re-suspendre les cellules dans 1 ml de la solution d&#39;anticorps primaire (faite avec la solution de bloc à la dilution recommandée). Les cellules peuvent être soit mis à incuber à température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant une nuit avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec 1 ml de solution de bloc. </li><li> Après, rétablir la suspension des cellules dans 1 ml de solution d&#39;anticorps secondaire (faite avec la solution de bloc à la dilution recommandée) et incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Après 1 heure, les cellules doivent ensuite être lavés à nouveau deux fois avec 1 ml de solution de bloc. </li><li> Après lavage avec une solution Block, laver les cellules à nouveau avec 1ml de PBS -. </li><li> Après les différents lavages, rétablir la suspension des cellules dans 1 ml de DAPI colorant nucléaire (1:10.000 dilution du DAPI dans PBS -) et incuber à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Après 5 minutes, centrifuger les tubes à 200g pendant 4 minutes. Aspirer le DAPI solution de colorant nucléaire et de remettre en suspension les cellules dans 1ml de PBS -. </li></ol> Incorporation de hPSCs dans les diapositives générées par un appareil cytospin: Partie 2 <ol><li> Diapositives en plastique sont préparés en faisant la quantité désirée de trous dedans avec une perceuse. Le diamètre doit être au plus 1 mm plus grand que le diamètre le plus large de la pointe micropipette (s) à être utilisé. </li><li> Le papier filtre est coupé à des paramètres de la glissière en plastique avec des ciseaux. </li><li> Les trous sont ensuite réalisés dans le papier filtre. La taille du trou (s) doit être assez grand pour que la pointe de micropipette (s) se range à travers elle. </li><li> Après, l&#39;une des diapositives préparées en plastique est placé sur le dessus et une lame de verre dans placées au bas du papier filtre coupe (figure 1). Les couches sont sécurisés avec du ruban adhésif. </li><li> Un maximum de 100 ul (selon la densité désirée monocouche) de la suspension cellulaire teinté de la Partie 1 est ensuite placée dans le haut de la pointe micropipette (s). </li><li> Si nécessaire, l&#39;appareil avec une solution de cellules peuvent être pesés et un contrepoids de poids similaire créé. </li><li> L&#39;appareil cytospin et contrepoids peuvent sont ensuite placés dans une centrifugeuse de bureau et centrifugé à 200g pendant 4 minutes. </li><li> Après centrifugation, l&#39;appareil est soigneusement démonté cytospin d&#39;une manière qui ne marche pas déloger les cellules de la lame de verre. </li><li> Si nécessaire, l&#39;excès entourant PBS - sur le côté verre dans aspirés hors. </li><li> Les cellules peuvent ensuite être visualisées en utilisant un microscope à fluorescence pour vérifier si la monocouche cellulaire désiré a été atteint. </li></ol> Partie 3: montage diapos <ol><li> Une goutte de la presse de montage souhaité est placé directement dans le centre de chaque zone contenant des cellules. </li><li> Après, une lamelle est doucement descendu sur les diapositives en essayant d&#39;éviter les bulles d&#39;air, si possible. </li><li> L&#39;excès des médias de montage est ensuite retiré de diapositives. </li><li> Après, les côtés de l&#39;lamelles sont scellées avec du vernis à ongle. </li><li> Les diapositives peuvent être conservés dans une zone de stockage dans le noir avant que les résultats sont observés et documentés. </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

Aux fins de notre laboratoire, un plat de 35mm de cultures de cellules souches cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est alloué pour la procédure de marquage immunocytochimique pour une utilisation avec l&#39;appareil cytospin. Les cellules sont ensuite collectées par le biais du enzymatique repiquage, en supprimant autant de la couche MEF que possible, en une suspension à cellule unique. Si plus une isolation efficace de cellules souches à partir de la couche MEF est souhaitée, les colonies peuve...

<table><tbody><tr><td>Chambre Lab Tek Permanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>Matériau pour lames en plastique réutilisées</td></tr><tr><td>Lames Microscope Superfrost/Plus Prénettoyées</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Pointes filtrantes de 0,1-10&amp;mu;L</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture pour microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>Milieu de montage</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal Anti-SSEA-4 de souris</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>Anticorps primaire pour la coloration SSEA-4</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal Anti-SSEA-3 de rat</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>Anticorps primaire pour la coloration SSEA-3</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 IgG de chèvre anti-souris</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Anticorps secondaire pour la coloration SSEA-4</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 IgG de chèvre marqué anti-rat</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Anticorps secondaire pour la coloration SSEA-3</td></tr><tr><td>DAPI, chlorhydrate</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil self-made cytospin

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) qui incluent des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et humains cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) sont des sources de cellules passionnante en raison de leur auto-renouvellement illimité des capacités et leur potentiel de se différencier en plusieurs types cellulaires. L&#39;état pluripotent des hPSCs est généralement évaluée par des techniques telles que qPCR, immunocytochimie, et par d&#39;autres<em&gt; In vitro</em&gt; Et<em&gt; In vivo</emLes stratégies de différenciation&gt; en plusieurs types cellulaires. Parmi ces derniers, des techniques immunocytochimiques ont été développés pour la caractérisation de routine de l&#39;état indifférencié de hPSCs basée sur l&#39;analyse des biomarqueurs candidats intracellulaire et la surface des cellules. Compte tenu du fait que grandir en tant hPSCs colonies, des problèmes surgissent dans la quantification de l&#39;expression de ces marqueurs au niveau des cellules individuelles sur une base routinière. Analyses par cytométrie en flux permettent d&#39;aborder cette question, mais nécessitent un nombre de cellules et l&#39;utilisation de réactifs qui ne sont normalement pas propice à l&#39;évaluation de la qualité de contrôle de routine des cultures HPSC. Ainsi, le développement de moyens pratiques et reproductibles de créer des échantillons de cellules monocouche avec intégrité préservée pour l&#39;évaluation marqueur a de nombreux avantages en matière de recherche sur les cellules souches. Cela profite grandement analyse immunocytochimique des cellules individuelles en raison de la monocouche peut être facilement observés et quantifiés pour l&#39;expression de marqueurs spécifiques. Pour atteindre cet objectif, un appareil de self-made cytospin a été construit et optimisé pour une utilisation avec la coloration immunocytochimique. Deux marqueurs de surface cellulaire (SSEA3/SSEA4) d&#39;expression ont été analysés dans une ligne de la variante BG01 cellules souches dans le but de ce protocole.

Suspension coloration immunocytochimique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) pour les marqueurs de surface cellulaire (SSEA-3/SSEA-4) a été réalisé basée sur l&#39;utilisation d&#39;un appareil de self-made cytospin de créer une monocouche de cellules d&#39;observation et de quantification.

Analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil Self-Made Cytospin

Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh), qui comprennent les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPih), sont des cellules passionnantes...

Bonjour, je m'appelle Rick Pasqua, étudiant au laboratoire d'ingénierie des cellules souches du Département des sciences chimiques et biologiques de l'Université de Virginie du Commonwealth. Dans cette vidéo, je vais montrer comment notre laboratoire utilise un appareil de centrifugation STO peu coûteux et fabriqué maison afin de créer une monocouche observable de cellules souches pluripotentes humaines pour la quantification des marqueurs de surface cellulaire. Étant donné que de nombreux protocoles immunochimiques sont adaptés à des cellules souches pluripotentes humaines cultivées en colonies sur des lamelles-chambre, des problèmes peuvent survenir lors de la caractérisation de l'expression des biomarqueurs au niveau cellulaire individuel.Le fait d'avoir les cellules en monocouche facilite non seulement l'analyse visuelle de celles-ci, mais éventuellement aussi la quantification de leur expression. L'appareil sinus spin que nos laboratoires utilisent peut être construit à l'aide de matériaux présents dans la plupart des laboratoires, nécessite uniquement un petit échantillon de cellules et ne requiert aucun réactif spécifique. Et plus important encore, il permet de reproduire de

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Immunocytochimie est une méthode puissante pour déterminer la présence, la localisation subcellulaire, et l'abondance relative d'un antigène d'intérêt dans les cellules cultivées. Ce protocole présente un outil facile à suivre la série d'étapes qui permettent de conserver les anticorps et tirer le meilleur parti de sa coloration.

Immunocytochimie: des cellules souches humaines

Les cellules souches pluripotentes croissante en suspension se différencier en corps embryoïdes (EBS). Ici, nous montrons comment obtenir de haute qualité cryocoupes EB utile pour étudier les aspects cellulaires et moléculaires de l'embryogenèse, tout en préservant leur organisation en tant que granulats.

Analyse de cellules souches pluripotentes en utilisant cryocoupes de corps embryoïdes

Cette vidéo montre un test permettant de générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Les iPSC humaines sont amenées à former des corps embryoïdes (EB). Les EB sont cultivés sur un échafaudage polymère à l’aide d’un milieu d’induction, favorisant la différenciation en cellules souches neurales, cellules progénitrices et neurones immatures. Enfin, les EB sont intégrés dans une matrice et transférés dans un milieu d’entretien pour la formation...

Génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites

Ici, nous vous présentons notre méthode établie pour reprogrammer des cellules somatiques humaines dans CSPi humaines sans transgène avec le virus de Sendai, qui montre des résultats cohérents et une efficacité accrues.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

Cellules souches pluripotentes induites (CISP) représentent une source de tissus spécifiques au patient pour des applications cliniques et la recherche fondamentale. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour reprogrammer les cellules humaines périphériques mononucléaires du sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés en CSPi virales sans l'aide de non-intégration des plasmides épisomiques.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Ce protocole offre un moyen simple et efficace de propager des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) en utilisant uniquement des milieux conditionnés dérivés du placenta humain dans une boîte recouverte de gélatine sans supplémentation exogène supplémentaire ou substrats synthétiques spécifiques aux hPSC.

A Novel Culture Modèle de cellules souches pluripotentes humaines Propagation de gélatine dans les médias Placenta conditionné

La caractérisation régulière des cellules souches pluripotentes induites (CSPi), afin de déterminer le maintien de leur état pluripotent, est une étape importante avant que ces cellules ne soient utilisées pour d’autres applications. Nous décrivons ici une méthode de propagation à petite échelle des iPSC humaines, spécialement conçue pour permettre leur caractérisation facile et routinière par immunocytochimie.

Propagation à petite échelle des CSPi humaines dans des conditions sans sérum pour la caractérisation immunocytochimique Routine

Ce protocole présente une méthode simple en deux étapes afin de différencier les cellules souches épithéliales cornéennes limbique de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture acellulaire xeno - et chargeur. Les méthodes de culture cellulaire présentés ici permettent une production rentable, à grande échelle des cellules qualité clinique applicables à l’utilisation de la thérapie des cellules cornéenne.

Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines

Nous présentons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de modèles de développement néocortical basés sur des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) 2D et 3D, ainsi que des méthodologies complémentaires permettant une analyse qualitative et quantitative de la biogenèse et de la fonction du cilium primaire (PC).

Modèles 2D et 3D à base de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour disséquer l’implication du cilium primaire au cours du développement néocortical

Nous présentons ici un protocole pour un système automatisé de culture cellulaire. Ce système de culture automatisé réduit la main-d’œuvre et profite aux utilisateurs, y compris les chercheurs qui ne sont pas familiers avec la manipulation des cellules souches pluripotentes induites (iPS), de l’entretien des cellules iPS à la différenciation en différents types de cellules.

Système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Découvrez une méthode d'immunocytochimie pour les cellules souches pluripotentes humaines utilisant un appareil cytospin artisanal. Cette technique permet de créer une monocouche cellulaire pour l'observation et la quantification fiable des marqueurs de surface.

Analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil Self-Made Cytospin

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