Analyse de cellules souches pluripotentes en utilisant cryocoupes de corps embryoïdes

Première partie, Introduction. Bonjour, je m’appelle Rafael. Je suis postdoctorant au laboratoire du professeur Stevens Hans à l’Université fédérale de Rio de Janeiro au Brésil.

Bonjour, je m’appelle Ismail. Je suis assistante de recherche, également professeure. Dans cette vidéo, nous allons montrer comment préparer des sections claires des corps Android.

Alors commençons. Deuxième partie, matériaux et équipements. Pour cette procédure, nous aurons besoin d’un milieu d’enrobage pour les échantillons congelés.

4 % Solution d’aldéhyde paraforme pour la fixation des cellules, solutions de saccharose pour la cryoprotection. Une aiguille à la pointe légèrement courbée, un stéréomicroscope pour une meilleure visualisation de l’EBS et un agitateur. Troisième partie.

Ici, les corps d’embryons humains sont cultivés dans des plaques de culture non adhérentes. À l’aide d’une pipette, nous regroupons tous les corps embryonnaires aussi près que possible les uns des autres afin de les transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Les EBS sont soigneusement récoltés et transférés dans le tube.

Il est important de collecter tous les ebs car il n’y a pas une grande quantité de matériel. Après la décantation des EBS, le milieu de culture est soigneusement jeté. Vous devriez pouvoir voir la pastille au fond du tube. Nous pouvons maintenant passer à la procédure de fixation.

L’EBS sera fixé dans une solution d’aldéhyde paraforme à 4 % dans du PBS ou une solution saline tamponnée au phosphate. Il est important de remettre en suspension le granulé avec une solution PFA. Les EBS sont ensuite fixés dans une solution de fixation pendant 30 minutes.

Après la fixation, la solution de PFA est soigneusement retirée. En prenant soin d’éviter que Resus ne suspende l’EBS et ne le remplace par une solution à 10 % de saccharose dans du PBS pour initier la cryoprotection de l’ebs, le matériau est conservé pendant 30 minutes dans cette solution. Ensuite, nous retirons soigneusement la solution de saccharose à 10 % et remettons l’EBS en suspension dans une solution de saccharose à 20 %.

Encore une fois, les EBS sont conservés pendant 30 minutes dans cette solution. Enfin, la solution de saccharose à 20 % est retirée et remplacée par une solution de saccharose à 30 % dans du PBS où elle est conservée pendant 30 minutes de plus. Nous pouvons maintenant passer à l’orientation et au blocage de ebs.

Dans notre laboratoire, nous utilisons des enveloppes de capsules vides comme moules. Pour le blocage de l’ebs, il est important d’enduire les parois internes de la pointe d’une solution de saccharose avant de collecter l’ebs. Maintenant, nous pouvons soigneusement collecter les EBS et attendre qu’ils décantent jusqu’au bas de la pointe.

Ensuite, les EBS sont placés au centre du bloc. Il doit s’agir de la position finale d’EBS à l’intérieur du bloc. À l’aide d’un stéréomicroscope et d’une pointe fine, nous recueillons et déchargeons autant de solution de saccharose que possible.

En prenant toujours soin de ne pas collecter les ebs. À l’aide d’une aiguille à la pointe légèrement courbée, tous les EBS sont positionnés au centre du bloc. Enfin, la solution de saccharose restante est recueillie à l’aide de morceaux de papier filtre.

L’emplacement spécifique de l’EBS dans le bloc est très important pour obtenir des tranches de bonne qualité. Voici un exemple de mauvais positionnement EB à l’intérieur de la coquille. Après le positionnement de l’EBS et l’élimination de la solution de saccharose, la coquille est remplie d’OCT en commençant par les bords, tout en prenant toujours soin d’éviter que Resus ne suspende l’ebs.

Les bulles restantes sont retirées à l’aide d’une pipette et les coquilles sont agitées pendant 15 minutes. Suite à l’agitation. Le bloc OCT est gelé dans de la neige carbonique.

À ce stade, vous pouvez soit stocker le bloc enveloppé dans une feuille d’aluminium à moins 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie, soit passer à la quatrième partie du cryostat, Coupe. Pour réaliser les sections cryogéniques, vous aurez besoin d’une lame jetable ou permanente, de lames de verre prétraitées à l’OCT et à la poly L lysine. Le bloc OCT est retiré du congélateur et conservé à l’intérieur du cryostat jusqu’à ce qu’il atteigne moins 20 degrés Celsius.

Le bloc est ensuite positionné sur le support et aligné parallèlement au bord de la lame. Les échantillons EB sont beaucoup plus petits que la plupart des autres échantillons de tissus, il est donc très important de s’assurer que toute la surface du bloc touche la lame en même temps, minimisant ainsi la perte de matériau. Après avoir été positionné, le bloc est coupé en tranches de 10 micromètres, et celles-ci sont collectées directement sur les lames de verre.

Les lames peuvent soit être stockées, de préférence à moins 70 degrés Celsius, soit utilisées le même jour. Le matériau peut être coloré pour l’immunohistochimie ou l’immunofluorescence. Conclusion. La méthode décrite dans le présent document fournit un protocole raisonnablement peu coûteux et facile à suivre pour obtenir des sections minces de cryostat de corps embryonnaires développés à partir de lignées de cellules souches humaines H nine ou US P one de souris.

Les coupes cryogéniques résultantes peuvent être utilisées dans une grande variété de procédures afin d’analyser l’expression des protéines ou la morphologie de l’EB.