Overview
A microbiota de drosophila impacta o desenvolvimento, imunidade e fisiologia do animal. Este vídeo descreve um método para quantificar bactérias de moscas, determinando a colônia formando unidades a partir de preparações corporais inteiras. O protocolo em destaque demonstra a técnica com moscas, criadas sob condições gnóbiticas usando quatro espécies bacterianas.
Protocol
Este protocolo é um trecho de Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobitic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Ovos descolados e transferência para dieta estéril
- Prepare o armário de biossegurança pulverizando o interior (incluindo os lados) com 70% de etanol. Limpe o fundo com um tecido de laboratório e esterilize o capô com luz UV por ~15 min. Esterilize todos os suprimentos não biológicos (copos de espécime, pincel, fórceps, recipiente de resíduos, 400 ml de água esterilizada e 100 ml de hipoclorito de sódio de 0,6%) pulverizando com etanol e imediatamente colocando no armário de biossegurança. Esterilize com luz UV por 15 minutos.
- Inicie a primeira de 2 lavagens de hipoclorito de sódio colocando a bucha com os ovos em um copo de espécime de 120 ml ou outro recipiente estéril. Despeje lentamente ~90 ml de solução de hipoclorito de sódio de 0,6% na bucha até logo abaixo da borda.
- Enxágüe ovos por 2,5 min. Suspender periodicamente os ovos usando fórceps para mover a bucha para cima e para baixo na solução de hipoclorito.
- Transfira a bucha diretamente para um segundo copo de espécime, pré-preenchido com alvejante de 90 ml, dentro do armário de biossegurança.
- Repita o passo 1.3 dentro do armário de biossegurança. No final do segundo tratamento alvejante, os ovos devem começar a aderir aos lados da bucha.
- Realizar etapas 1.7-1.8 no gabinete de biossegurança.
- Descarte o alvejante e lave a bucha com água estéril 3 vezes. Suspenda os ovos várias vezes durante cada lavagem movendo a bucha com fórceps. Até o final da terceira lavagem, a maioria dos ovos deve ser anexada ao lado da bucha.
- Usando um pincel esterilizado em etanol, transfira ovos do lado da bucha para a dieta estéril. Transfira ovos individualmente ou em pequenos lotes. Aponte para 30-50 ovos por frasco. Deixe as tampas soltas para permitir que o oxigênio entre no tubo. Se os frascos permanecerem axenic, transfira para uma incubadora de insetos; caso contrário, adicione bactérias como abaixo.
2. Faça moscas gnóbiticas usando 4 espécies bacterianas
- Preparar bactérias
- Prepare um armário de biossegurança esterilizado com suprimentos necessários (pipetas, caixas de ponta de pipeta, tubos de centrífuga esterilizados, caldo MRS e racks de tubo de ensaio) como na etapa 1.1. Limpe o lado de fora dos tubos de ensaio com um lenço de laboratório encharcado de etanol antes de colocar no armário de biossegurança.
- Pelotar as bactérias primeiro transferindo 500 μl de crescimento noturno para um tubo microfuge estéril. Se a densidade bacteriana for baixa, adicione até 1,5 ml a cada tubo ou remova sequencialmente sobrenante e adicione cultura extra ao mesmo tubo. Remova amostras do armário de biossegurança e centrífuga por 10 minutos a 10.000 x g. Use pontas de filtro para evitar contaminação entre amostras.
- Determine a densidade de cada cultura medindo OD600. Se usar um leitor de placas multi-bem, transfira 200 μl de cada cultura para uma placa de 96 poços em diluições de 1, 2 e 4 vezes.
- Determine a quantidade de mMRS em que diluir cada pelota celular (2.1.2) usando um especttômetro de leitura de placa e as seguintes equações. Planeje adicionar caldo suficiente para inocular 50 μl a cada frasco de mosca.
- Colete leituras OD600 para uma diluição de 1:1, 1:2 e 1:4 de cada cultura bacteriana em um espectótmetro de leitura de placas. Selecione a diluição para cada cepa bacteriana que produz um valor OD600 entre 0,1 e 0,2 e use este valor e seu fator de diluição correspondente como 'O' e 'D' nas fórmulas dadas em 2.1.4.2 ou 2.1.4.3.
- Se usar as 4 espécies descritas aqui, normalize as células para densidades equivalentes da unidade formadora de colônias (CFU)/ml (conversão OD600 para CFU determinada anteriormente em Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) usando esta equação:
E = ((O-B) x V x D)/C
onde E = volume para resuspend pelotas em (μl), O = OD600 bactérias, B = OD600 mídia em branco, D = diluição do fold, V = cultura bacteriana μl antes da centrifugação, C = OD600 de constante predeterminada. Consulte Arquivo de Código Suplementar para exemplos de cálculos usando essas equações. Para espectrômetros que em branco automaticamente, use "O" no lugar de "O-B".
NOTA: As constantes predeterminadas (unidades OD600, normalizadas para 107 CFU ml-1, constantes derivadas em Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) são as seguintes: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077). - Se estiver usando outras espécies bacterianas (não há constante de CFU/OD600), normalize a densidade para OD600 = 0,1 usando esta equação:
E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
NOTA: As unidades são as mesmas da etapa 2.1.4.2. Consulte Arquivo de Código Suplementar para exemplos de cálculos usando essas equações.
- No gabinete de biossegurança, remova o supernasce com uma ponta de pipeta e resuspenque a pelota em mMRS fresco ou PBS conforme calculado na etapa 2.1.4.2.
- Bactérias Inoculadas
- Transfira 50 μl da bactéria para os tubos cônicos com dieta estéril e ovos descorioados em armário de biossegurança. Adicione bactérias após a transferência de óvulos para evitar contaminação entre frascos.
- Coloque tubos inoculados em uma incubadora a 25 °C.
3. Medir a carga/teste da CFU para a esterilidade
- Para medir a carga da UFC em toda a carga corporal homogeneiza, transfira 5 moscas (5-7 dias após a eclosão) para um tubo de microfuça de 1,7 ml contendo 125 μl de contas cerâmicas e 125 μl de caldo mMRS. Homogeneize moscas usando um homogeneizador de tecido por 30 segundos a 4,0 M/seg.
- Alternativamente, omitir contas e homogeneizar a mão em tubos de microcentrifuuge com pilões plásticos por 1 min.
- Se quantificar a microbiota intestinal, a superfície esteriliza as moscas para remover micróbios exógenos. Transfira moscas para um tubo de microcentrifuge contendo 100 μl 70% de etanol por 1 min, etanol aspirado e transferência para um novo tubo de microcentrifuge para homogeneizações. Se o conteúdo de DNA do intestino for medido, enxágue por 1 min com hipoclorito de sódio de 0,6% antes da lavagem do etanol.
- Diluir o homogeneizar com 875 μl mMRS, vórtice por 5 segundos, e pipet 120 μl de homogeneizar no primeiro poço de uma placa de microtiter.
- Realize duas diluições sequenciais 1:8 utilizando 10 μl homogeneizar e 70 μl mrs nos próximos dois poços.
- Retire 10 μl do primeiro poço e adicione-o ao segundo poço contendo 70 μl MRS. Misture o conteúdo do segundo bem bem bem, transfira 10 μl do segundo poço para o terceiro poço contendo 70 μl mrs, e misture bem. Isso leva a 3 concentrações totais dos 1.000 μl homogeneados originais: não diluídos, 1:8 e 1:64.
- Transfira 10 μl de cada diluição para uma placa mMRS (usando uma tubulação multicanal, se desejar). Incline-se ligeiramente o prato para espalhar a diluição vários milímetros abaixo da superfície do ágar e permitir que o líquido seque antes de mover a placa. O líquido seca rapidamente na placa se as placas têm 2 dias de idade, reduzindo a mistura de duas gotículas vizinhas.
- Incubar a 30 °C por 1-2 dias. Remova as placas da incubadora uma vez distintas, colônias individuais são visíveis, e contam a partir de uma diluição com 10-100 colônias isoladas.
- Calcular CFU por mosca usando a equação E = C x D/P x V/F, onde E = CFU por mosca, C = número de colônias contadas, D = diluição, P = μl banhado, V = volume de mosca homogeneizada, e F = número de moscas homogeneizadas.
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Representative Results
Arquivo de código suplementar: Cálculos amostrais. Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | |
Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | |
Agar | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | |
Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | |
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | |
Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | |
Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | |
Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | |
Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | |
Plastic Bushing | Home Depot | 100404002 | |
Plastic Bushing Cap | Home Depot | 100153897 | |
Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
50 ml Centrifuge Tubes | TrueLine Centrifuge Tubes | TR2003 | |
Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | |
Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | |
Filter Pipette Tips, 300 µl | USA Scientific | 1120-9810 | |
Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | |
Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | |
Paintbrush | Walmart | 5133 | |
Forceps | Fisher | 08-882 | |
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | |
Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | |
Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | |
Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | |
Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | |
MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | |
96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | |
1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Filter Pipette Tips, 1,000 µl | USA Scientific | 1122-1830 | |
96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | |
Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | |
Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | |
Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 |