कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंसका एकल कोशिका विघटन: लाइव कोशिकाओं को अलग करने की एक विधि

Overview

यह वीडियो एक एकल सेल निलंबन में पूरे कीड़े को अलग करने की विधि का वर्णन करता है जो यूएफएस या अक्षुण्ण कोशिकाओं के इम्यूनोप्रिपिपिटेशन के लिए उपयुक्त है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल जर्मनी एट अल, राउंडवार्म कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस, जे विस एक्सपी (2019) से विशिष्ट न्यूरॉन आबादी का अलगाव से एक अंश है।

1. सेल अलगाव के लिए वृद्ध कीड़े की तैयारी और संग्रह

नोट: नीचे समझाया ट्रांसजेनिक unc-17से कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स के अलगाव है:: GFP तनाव (OH13083) कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (CGC) से प्राप्त मिनेसोटा विश्वविद्यालय में तनाव भंडार । कवक या बैक्टीरिया से प्रदूषण को रोकने के लिए बाँझ स्थितियों को बनाए रखना अनिवार्य है।

1. टी स्टियरनागल द्वारा वर्णित ब्लीचिंग विधि के माध्यम से कीड़े को तैयार करें और सिंक्रोनाइज़ करें। उम्र बढ़ने के प्रयोगों के लिए, अंडा उत्पादन को कम करने और अंडे की हैचिंग को गिरफ्तार करने के लिए फ्लोरोडेऑक्सीयूरिडीन (FuDR) के 25 माइक्रोन पानी समाधान युक्त सूत्रकृमि विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेटों पर प्लेट कीड़े। प्रदूषण या अंडे की हैचिंग को रोकने के लिए नियमित रूप से आगर प्लेटों का निरीक्षण करें क्योंकि इससे अविश्वसनीय परिणाम होंगे।
   नोट: UNC-17के लिए:: GFP कोशिकाओं, आम तौर पर तीन १०० मिमी x 15 मिमी एनजीएम प्लेटों ब्याज की कोशिकाओं की एक पर्याप्त राशि को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
2. कीड़े इकट्ठा करें और सेल अलगाव के लिए बफ़र्स तैयार करें।
   1. एक 15 एमएल शंकु नली में कीड़े ले लीजिए। एम 9 बफर के 1.5 एमएल (1 एमएम एमजीएसओ_4,85 एमएम एनएसीएल, 42 एमएम एनए_{2 एचपीओ47एच 2}ओ, 22 एमएम_{केएच2}पीओ, पीएच 7.0) और 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज के साथ प्लेट से कीड़े धोएं 1,600 x g। सुपरनेट को त्यागें और M9 बफर के 1 एमएल के साथ कीड़े धोएं। अधिक से अधिक ई. कोलाई संदूषण को हटाने के लिए कुल पांच बार के लिए अपकेंद्रित्र दोहराएं और धोएं।
      नोट: इस कदम पर एम्पिसिलिन जैसे एंटीबायोटिक्स (५० μg/mL) जोड़ने से बैक्टीरियल संदूषण को कम करने में मदद मिल सकती है ।
   2. दो नमूनों के लिए, सोडियम डोडेसिल सल्फेट-डायियोथ्रेइटोल (एसडीएस-डीटीटी) लाइसिस बफर के 2 एमएल तैयार करें: 200 mM DTT, 0.25% (w/v) एसडीएस, 20 mM HEPES (पीएच 8.0), और 3% (w/v) सुक्रोज।
   3. आइसोलेशन बफर (118 एमसीएम एनएसीएल, 48 एमसीएम केसीएल, 2 एमएमएम सीसीएल 2, 2 एमएमएम एमजीसीएल_2,25 एमएम एचईपीई [पीएच 7.3]) के 15 एमएल तैयार करें और इसे बर्फ पर स्टोर करें।
      नोट: प्रत्येक प्रयोग से पहले एसडीएस-डीटीटी लाइसिस बफर और आइसोलेशन बफर दोनों को ताजा किया जाना चाहिए।
3. क्यूटिकल व्यवधान और एकल सेल अलगाव
   1. 1,600 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए स्टेप 1.2.1 में सेंट्रलाइज जानवर एकत्र किए गए। M9 मीडिया के 1 एमएल में सभी सुपरनेट्ट निकालें और कीड़े को निलंबित करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
   2. 5 मिनट के लिए 1,600 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के साथ गोली कीड़े।
   3. कीड़े के लिए एसडीएस-डीटीटी लाइसिस बफर के 200 μL जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट। यदि एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है तो कीड़े को शरीर के साथ "विंकलेड" दिखाई देना चाहिए।
      नोट: एसडीएस-डीटीटी लाइसिस बफर के लंबे समय तक संपर्क में रहने से कीड़े की मौत हो सकती है, जिसकीड़े देख कर निगरानी की जा सकती है। मृत होने वाले कीड़े बढ़ जाएंगे और कर्ल नहीं करेंगे।
   4. बर्फ के 800 μL जोड़ें ठंडे अलगाव बफर और धीरे से ट्यूब flicking द्वारा मिश्रण।
   5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए गोली कीड़े, सुपरनैंट को हटाएं और 1 मिलीलन बफर के साथ धोएं।
   6. कुल पांच बार के लिए चरण 1.3.5 दोहराएं, हर बार सावधानी से आइसोलेशन बफर को हटा दें।
   7. स्ट्रेप्टोमाइसेस ग्रिसेस (15 मिलीग्राम/एमएल)(सामग्री की तालिका)से प्रोटीज़ मिश्रण का 100μL जोड़ें जो पैलेट बफर में आइसोलेशन बफर में भंग हो और आरटी में 10−15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: एसडीएस-डीटीटी लाइसिस बफर के साथ, विस्तारित प्रोटीज पाचन के परिणामस्वरूप प्लाज्मा झिल्ली के साथ प्रोटीन का अत्यधिक दरार हो सकता है, जो चुंबकीय मोतियों के माध्यम से सतह उजागर जीएफपी के अलगाव को रोक सकता है।
   8. प्रोटीज़ मिश्रण के साथ इनक्यूबेशन के दौरान, ~ 60−70 बार के लिए 200 माइक्रोपिपेट टिप के साथ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के नीचे के खिलाफ नमूनों को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके यांत्रिक व्यवधान लागू करें। कोशिकाओं को ठीक से असंबद्ध करने के लिए लगातार दबाव के साथ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब की दीवार के खिलाफ पिपेट टिप रखें।
   9. पाचन के चरण को निर्धारित करने के लिए, पाचन मिश्रण की एक छोटी मात्रा (~ 1−5 माइक्रोन) को हटा दें, इसे ग्लास स्लाइड पर छोड़ दें और ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इसका निरीक्षण करें। इनक्यूबेशन के 5−7 मिनट के बाद, कीड़े के टुकड़े कम छल्ली दिखना चाहिए था और कोशिकाओं का एक घोल आसानी से दिखाई देगा।
   10. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोल्ड लीबोविट्ज के एल-15 माध्यम के 900 माइक्रोन के साथ रोक प्रतिक्रिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 यू/एमएल पेनिसिलिन पर अंतिम एकाग्रता और 50 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक है।
   11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा गोली अलग टुकड़े और कोशिकाओं। गोली कोशिकाओं को ठंडे एल-15-पूरक मीडिया के 1 एमएल के साथ दो बार और धोएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अतिरिक्त मलबे और क्यूटिकल को हटा दिया जाए।
   12. एल-15-पूरक मीडिया के 1 एमएल में पेलेट कोशिकाओं को फिर से 1 और 30 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें। एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर शीर्ष परत, लगभग 700−800 माइक्रोनल लें। इस परत सेल मलबे के बिना कोशिकाओं में शामिल है और ब्याज की कोशिकाओं के बाद अलगाव में इस्तेमाल किया जाएगा ।
   13. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, अलग कोशिकाओं के 10−25 माइक्रोन के सेल घनत्व को मापने के लिए स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010