Optogenetica zebrafish: attivazione del neurone somatosensoriale geneticamente modificato per studiare le risposte comportamentali larvali

- Nelle larve di zebrafish, uno stimolo visivo può attivare i neuroni somatosensoriali e innescare una risposta di fuga. Esistono due tipi di neuroni di questo tipo presenti nei neuroni larva, trigeminale e Rohon-Beard. Possiamo manipolare l'attività di questi neuroni modificandoli per esprimere canali ionici transgenici sensibili alla luce. Questo approccio è chiamato optogenetica.

Per eseguire questa tecnica, montare una larva transgenica con il lato dorsale rivolto verso l'alto in gel di agarosio e posizionarla sotto un microscopio sezionante. Utilizzare una lama di rasoio per staccare una porzione di agarosio a forma di cuneo da intorno al tuorlo e alla coda. Riempire quest'area con acqua d'uovo. Allontanare l'agarosio dal tronco e dalla coda della larva.

Posizionare la punta di un cavo ottico vicino al tronco in cui si trova il corpo cellulare del neurone Rohon-Beard. Fornire un impulso di luce laser blu. Dopo l'esposizione alla luce blu, i canali ionici transgenici sensibili alla luce nella membrana del neurone si aprono, consentendo agli ioni di entrare, innescando un potenziale d'azione che suscita la risposta di fuga. Registrare il comportamento della larva utilizzando una telecamera ad alta velocità.

Nel protocollo di esempio, monteremo le larve per attivare il neurone Rohon-Beard, esprimendo una variante di channelrhodopsin e osserveremo la risposta comportamentale.

- Fare l'1,5% di agarosio a bassa fusione in acqua doppia distillata e conservare in un blocco di calore di 42 gradi Celsius per evitare che si solidizzi. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro, trasferire una delle larve prescreen in un tubo dell'1,5% di agarosio a bassa fusione con la meno acqua embrionale blu possibile. Quindi trasferire la larva in una goccia di agarosio su una piccola piastra di Petri.

Al microscopio sezionato, posizionare il lato dorsale larva verso l'alto. Quando l'agarosio è solidificato, utilizzare una sottile lama di rasoio per tagliare l'agarosio da entrambi i lati della larva. Riempire l'area circostante l'agarosio con acqua blu embrionale.

Successivamente, effettuare due tagli diagonali di entrambi i lati del tuorlo, facendo attenzione a non intaccare la larva. In seguito, allontanare l'agarosio dal tronco e dalla coda della larva.

Ora montate la telecamera ad alta velocità sull'ambito di sezionamento e collegate la fotocamera al computer. Accendete il computer e la fotocamera ad alta velocità. Aprite il software di imaging video e regolate le impostazioni della fotocamera. Successivamente, collegate il cavo ottico, il laser e lo stimolatore insieme. Accendete lo stimolatore e impostatelo su un massimo di 5 volt e una durata dell'impulso di 5 millisecondi. Successivamente, accendete il laser. Successivamente, accendete il laser.

Utilizzare quindi il microscopio a dissezione fluorescente per posizionare la punta del cavo ottico vicino a un corpo cellulare neuronale con espressione ChEF-tdTomato. Fornire un impulso di luce blu per attivare il neurone sensoriale. Registrare quindi le risposte utilizzando una telecamera ad alta velocità impostata a 500 o 1.000 fotogrammi al secondo e ripetere gli esperimenti con almeno 1 minuto tra le attivazioni per evitare l>assuefazione.

Per rilasciare la larva, fare a pezzi l'agarosio con pinzi e fare attenzione a non ferire l'animale. Quindi trasferirlo in acqua embrionale blu fresca. Gli animali possono essere ulteriormente svilupparsi e la procedura può essere ripetuta nelle fasi più vecchie. L'embrione potrebbe anche essere rimontato per l'imaging confocale ad alta risoluzione della cellula attivata al fine di correlare il comportamento con la struttura cellulare.