Optogénétique du poisson-zèbre : activation des neurones somatosensoriels génétiquement modifiés pour étudier les réponses comportementales des larves

- Chez les larves de poisson-zèbre, un stimulus visuel peut activer les neurones somatosensoriels et déclencher une réponse de fuite. Il existe deux types de neurones de ce type dans la larve, les neurones trijumeaux et Rohon-Beard. Nous pouvons manipuler l’activité de ces neurones en les modifiant pour exprimer des canaux ioniques transgéniques sensibles à la lumière. Cette approche s’appelle l’optogénétique.

Pour réaliser cette technique, montez une larve transgénique avec la face dorsale vers le haut dans du gel d’agarose et placez-la sous un microscope à dissection. À l’aide d’une lame de rasoir, détachez une partie cunéiforme d’agarose autour du jaune et de la queue. Remplissez cette zone avec de l’eau d’œuf. Retirez l’agarose du tronc et de la queue de la larve.

Positionnez l’extrémité d’un câble optique près du tronc où se trouve le corps cellulaire du neurone de Rohon-Beard. Délivrez une impulsion de lumière laser bleue. Lors de l'exposition à la lumière bleue, les canaux ioniques transgéniques sensibles à la lumière dans la membrane du neurone s'ouvrent, permettant aux ions d'entrer, déclenchant un potentiel d'action qui déclenche la réponse d'échappement. Enregistrez le comportement de la larve à l'aide d'une caméra à haute vitesse.

Dans l’exemple de protocole, nous allons monter les larves pour activer le neurone Rohon-Beard, exprimant une variante de la channelrhodopsine et observer la réponse comportementale.

- Préparez 1,5 % d’agarose à bas point de fusion dans de l’eau doublement distillée et stockez-la dans un bloc thermique à 42 degrés Celsius pour éviter qu’elle ne se solidifie. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférez l’une des larves dans un tube d’agarose à faible point de fusion à 1,5 % avec le moins d’eau bleue de l’embryon possible. Transférez ensuite la larve dans une goutte d’agarose sur une petite boîte de Pétri.

À l’aide d’un microscope à dissection, positionnez la larve, côté dorsal vers le haut. Lorsque l’agarose est solidifiée, utilisez une lame de rasoir fine pour couper l’agarose des deux côtés de la larve. Remplissez la zone entourant l’agarose avec de l’eau bleue embryonnaire.

Ensuite, faites deux coupes diagonales des deux côtés du jaune, en faisant attention de ne pas entailler la larve. Ensuite, retirez l’agarose du tronc et de la queue de la larve.

Montez maintenant la caméra haute vitesse sur la lunette de dissection et connectez la caméra à l’ordinateur. Allumez ensuite l’ordinateur et la caméra haute vitesse. Ouvrez le logiciel d’imagerie vidéo et ajustez les paramètres de l’appareil photo. Ensuite, connectez le câble optique, le laser et le stimulateur ensemble. Allumez ensuite le stimulateur et réglez-le sur un maximum de 5 volts et une durée d’impulsion de 5 millisecondes. Ensuite, allumez le laser.

Ensuite, utilisez le microscope de dissection fluorescent pour positionner l’extrémité du câble optique près d’un corps cellulaire neuronal avec l’expression ChEF-tdTomato. Délivrez une impulsion de lumière bleue pour activer le neurone sensoriel. Ensuite, enregistrez les réponses à l’aide d’une caméra à grande vitesse réglée à 500 ou 1 000 images par seconde et répétez les expériences avec au moins 1 minute entre les activations pour éviter l’accoutumance.

Pour libérer la larve, séparez l’agarose à l’aide d’une pince et veillez à ne pas blesser l’animal. Transférez-le ensuite dans de l’eau d’embryon bleu frais. On peut laisser les animaux se développer davantage, et la procédure peut être répétée à des stades plus anciens. L’embryon pourrait également être remonté pour une imagerie confocale à haute résolution de la cellule activée afin de corréler le comportement avec la structure cellulaire.