Name: Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant lembryogenèse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Découvrez une approche de génétique inverse pour tester la redondance fonctionnelle pendant l'embryogenèse chez Danio rerio. Cette méthode utilise des morpholinos et des souches rapporteuses pour quantifier la spécification des lignées cellulaires.

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Nous remercions les membres du laboratoire Evans pour leur aide dans la préparation de cette présentation. Le morpholinos utilisés ici ont été à l&#39;origine validée par le Dr Audrey Holtzinger. TE est soutenu par des subventions du National Institutes of Health (HL064282 et HL056182). Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Institut pour la protection des animaux et du Comité utilisation, du Collège médical Weill Cornell.

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

Dans l&#39;expérience décrite ici, on a combiné deux morpholinos, chacune d&#39;elles génèrent à eux seuls une gamme distincte de phénotypes, et a trouvé un phénotype tout à fait différent quand ils ont été co-injectés ensemble. Bien sûr, nous avions besoin d&#39;une justification pour faire cette expérience, en premier lieu. Nous supposions que les deux gènes pourraient compenser les uns les autres pour une fonction plus tôt, dans cette spécification cas cardiaques. C&#39;est parce que les gènes sont fortement liés (et...

<table><tbody><tr><td>Éclosoirs pour poissons et séparateurs</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Épuisettes pour poissons</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau du système</td><td></td><td></td><td>60 mg d'Instant Ocean&amp;#8221; par litre d’eau dH2O</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri de 100 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Tireuse d’aiguilles pour micropipettes</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre de 3,5&quot;</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>Microbroyeur</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>Oculaire de microscope à grille</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>Micromètre</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Agarose ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Spательule</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Balançoire</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Coupelles jetables pour pesée</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>Micro-ondes classique</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacon Erlenmeyer</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre gradué</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>Pipetteur automatique</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>Solution de rinçage à 70 % d’éthanol</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir d’azote N2</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Morpholino ciblant le site d’épissage de &lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt;</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Bloqueur du site de départ ATG de gata5</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Bloqueur du site de départ ATG de la longue isoforme de &lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt;</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur jetable</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Méthanesulfonate de tricaine</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>Pinces effilées</td><td>Dumont</td><td></td><td>Taille 55</td></tr><tr><td>Lames creuses pour microscopie</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l&#39;embryogenèse

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

La fonction des gènes durant l&#39;embryogenèse est généralement définie par une perte de fonction des expériences, par exemple par mutagenèse ciblée (KO) chez la souris. Dans le modèle de poisson zèbre, efficaces techniques de génétique inverse ont été développées en utilisant la micro-injection d&#39;morpholinos antisens spécifiques du gène. Morpholinos cibler un ARNm grâce à l&#39;appariement de bases spécifiques et la fonction des gènes bloquer transitoirement par la traduction ou de l&#39;inhibition de l&#39;épissage pendant plusieurs jours lors de l&#39;embryogenèse (à plat). Cependant, chez les vertébrés tels que souris ou le poisson-zèbre, certaines fonctions des gènes peut être obscurcie par ces approches en raison de la présence d&#39;un autre gène qui compense la perte. Cela est particulièrement vrai pour les familles de gènes contenant des gènes soeur qui sont co-exprimés dans les mêmes tissus en développement. Dans le poisson-zèbre, une compensation fonctionnelle peut être testée de manière relativement haut-débit, par co-injection de morpholinos que knockdown cible des deux gènes simultanément. De même, en utilisant morpholinos, une interaction génétique entre deux gènes peut être démontrée par knockdown des deux gènes ensemble à des sous-niveaux de seuil. Par exemple, morpholinos peut être titrée de telle sorte que ni le knockdown individuelles génère un phénotype. Si, dans ces conditions, la co-injection des deux morpholinos provoque un phénotype, une interaction génétique est indiquée. Ici nous démontrons comment montrer la redondance fonctionnelle dans le contexte de deux facteurs de transcription GATA liées. Facteurs GATA sont essentiels pour la spécification des progéniteurs cardiaques, mais ce n&#39;est révélée que par la perte des deux Gata5 et Gata6. Nous montrons comment réaliser des expériences de micro-injection, de valider les morpholinos, et évaluer le phénotype compensé cardiogenèse.

La fonction des gènes peut être obscurci dans la perte de fonction des expériences s&#39;il ya compensation par un autre gène. Le modèle de poisson zèbre offre un relativement haut-débit moyen de révéler de telles redondance fonctionnelle dans les embryons vivants.

Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l&#39;embryogenèse

La fonction d'un gène pendant l'embryogenèse est généralement définie par des expériences de perte de fonction, par exemple par mutagenèse ciblée (knock-out) chez la souris. Dans ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer si deux gènes sont fonctionnellement redondants pour la spécification d'une lignée cellulaire définie. Cela est réalisé en premier lieu en définissant le phénotype d'absence de fonction de chaque gène individuel à l'aide de morpholinos spécifiques au gène injectés dans des embryons de poisson zèbre en développement. La deuxième étape de la procédure consiste à mettre au point un test permettant de quantifier la spécification ou la différenciation de la lignée cellulaire.Par exemple, en utilisant une souche de poisson rapporteur, comme nous le montrerons ici. La troisième étape de la procédure consiste à combiner deux morpholinos FENO pour cibler la perte de fonction des deux gènes simultanément. La dernière étape de la procédure est d'évaluer le phénotype provoqué par l'extinction double.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une perte ou un gain de fonction pour les cellules d'une lignée spécifique par l'examen du rapporteur de lignée ou l'analyse de l'expression d'un marqueur spécifique à la lignée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la combinaison d

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Un procédé de génétique inverse adapté pour un poisson zèbre pour déterminer la fonction des gènes au cours des stades ultérieurs de développement et de l'homéostasie physiologique tel que la régénération des tissus en utilisant des injections intraventriculaires de morpholinos spécifiques d'un gène.

Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve

Nous décrivons un système d’ovocytes et de coiffes animales de xénope pour le clonage d’expression de gènes capables d’induire une réponse chez l’ectoderme compétent, et discutons des techniques pour l’analyse ultérieure de ces gènes. Ce système est utile dans l’identification fonctionnelle d’un large éventail de produits géniques.

Clonage fonctionnelle en utilisant un<em&gt; Xenopus</em&gt; Système d&#39;expression de l&#39;ovocyte

L'objectif de ce protocole est de décrire un déficitaire et d'acquérir de-méthode de la fonction qui est applicable pour identifier néogénine comme un récepteur spécifique de stade qui mène à trophectoderme et la différenciation cellulaire interne de masse dans des embryons de souris préimplantatoire.

Déficitaires et approche Gain de fonction d&#39;enquêter sur les cellules précoce destin déterminants dans les embryons de souris préimplantatoire

Cet article vidéo détaille un simple dans la méthode in vivo qui peut être utilisé pour caractériser systématiquement et efficacement les composants de voies de signalisation complexes et les réseaux de régulation dans de nombreux embryons d' invertébrés.

La puissance de la simplicité: Sea Urchin Embryons comme<em&gt; In Vivo</em&gt; Modèles de développement pour l&#39;étude de la cellule cellule-à-Complex de signalisation réseau Interactions

Les protéines contiennent souvent plusieurs domaines qui peuvent exercer différentes fonctions cellulaires. knock-out gène (KO) ne considèrent pas cette diversité fonctionnelle. Nous rapportons ici un échange de cassette à médiation recombinaison (CREM) approche structure-fonction dans les cellules à base de souches embryonnaires KO qui permet la dissection moléculaire de différents domaines fonctionnels ou variants d'une protéine.

Structure-fonction des études chez la souris à l&#39;aide de cellules souches embryonnaires recombinase médiation cassette d&#39;échange

Nous présentons un protocole simple suppresseur écran fission levure. Cette méthode est efficace, sans mutagène et sélective pour les mutations qui se produisent souvent à un seul locus génomique.  Le protocole est adapté pour isoler les suppresseurs qu’atténuer les défauts de croissance dans un milieu liquide qui sont causées par une mutation ou d’une drogue.

Un écran de suppresseur de Deep-séquençage-assisted, spontanée chez la levure Scissipare Schizosaccharomyces pombe

Nous avons développé une nouvelle approche de perte de fonction qui implique l’introduction et l’intégration génomique de séquences artificielles de micro-ARN dans des embryons de poussins en utilisant l’électroporation in ovo et le système de transposon Tol2. Cette technique fournit une méthodologie robuste et stable pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement.

Approche de perte de fonction dans la rétine embryonnaire du poussin en utilisant l’expression transgénique médiée par le transposon Tol2 de microARN artificiels

Le test de la transition jour / nuit est l'un des tests les plus largement utilisés pour mesurer l'anxiété comme le comportement des souris. Ici, nous présentons un film qui montre des procédures détaillées sur la façon dont nous menons le test.

Test de transition clair / foncé pour souris

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Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

Cette vidéo montre deux couleurs monter toute l'hybridation in situ, une méthode par laquelle le profil d'expression spatiale et temporelle des deux gènes différents peuvent être visualisées dans des embryons de poulet jeunes. Cette méthode a été initialement présenté par David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil et David Ingham Ish-Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

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Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l'embryogenèse

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