Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l'embryogenèse

L’objectif global de cette procédure est de déterminer si deux gènes sont fonctionnellement redondants pour la spécification d’une lignée cellulaire définie. Ceci est accompli en définissant d’abord le phénotype de perte de fonction de chaque gène individuel à l’aide de morphologies spécifiques au gène injectées dans des embryons de poisson-zèbre en développement. La deuxième étape de la procédure consiste à mettre au point un test permettant de quantifier la spécification ou la différenciation de la lignée cellulaire.

Par exemple, en utilisant une souche de poisson rapporteur, comme nous le montrerons ici. La troisième étape de la procédure consiste à combiner deux FENO morphes pour cibler la perte de fonction des deux gènes simultanément. La dernière étape de la procédure consiste à évaluer le phénotype causé par le double knockdown.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la perte ou le gain de fonction pour les cellules d’une lignée spécifique par l’examen du rapporteur de lignée ou l’analyse de l’expression pour un marqueur spécifique de la lignée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la combinaison de knock-outs dans le modèle murin, est que deux ou même trois gènes peuvent être ciblés dans le modèle de poisson simplement en combinant des morphos validés dans une seule expérience. Plus de 100 embryons peuvent être injectés et les phénotypes évalués sur plusieurs jours.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés. En biologie du développement, comme la définition des voies transcriptionnelles qui contrôlent le destin cellulaire, les principales voies régulatrices sont souvent représentées par de petites familles de gènes apparentés qui sont fonctionnellement redondants. Leur rôle n’est donc pas évident dans les études sur l’inactivation de souris en raison de la compensation des gènes sœurs.

Bien que ce modèle puisse donner un aperçu de l’embryogenèse du poisson-zèbre, les résultats peuvent être appliqués à d’autres systèmes tels que la souris, car les mêmes programmes génétiques sont généralement bien conservés tout au long de l’évolution. Préparez des plaques de micro-injection avant d’injecter les embryons. Versez environ 12 millilitres de 2 % agros dans l’eau du système, c’est-à-dire de l’eau propre prélevée directement du système d’aquarium dans le couvercle inversé d’une boîte de Pétri de 100 millimètres.

Placez deux lames de microscope à un angle d’environ 45 degrés sur les deux côtés du couvercle. Lorsque l’agros s’est solidifié, retirez doucement les lames du couvercle, créant des auges où les embryons se reposeront pendant l’injection. Incuber les bouillons de morphos à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes pour s’assurer qu’ils sont complètement en solution.

Laisser refroidir les bouillons à température ambiante. L’activité et la tolérance de chaque morpho nouvellement conçu doivent être validées empiriquement. Dans les microtubes à centrifuger, commencer par une à deux dilutions en série du morpho mère dans de l’eau distillée désionisée, ce qui donne des concentrations de travail d’un millimolaire, 0,5 millimolaire, 0,25 millimolaire et 0,125 millimolaire.

Sous une lunette de dissection, utilisez l’aspiration pour charger vers l’avant une aiguille d’injection calibrée qui a été fixée au micromanipulateur et correctement positionnée. Chargez l’aiguille avec environ un microlitre de la solution morpho à la concentration la plus faible. À l’aide d’une pipette de transfert, les embryons fécondés d’une cellule sont placés dans les auges de la plaque de microinjection.

Utilisez la pipette pour retirer l’excès d’eau de la plaque afin que les embryons tombent au fond de l’auge. Placez la plaque d’injection sous le microscope, descendez l’aiguille à travers le corion et dans le jaune. Injectez chaque embryon avant de retirer l’aiguille et de repositionner la plaque d’injection pour accéder à l’embryon suivant.

Lors de l’apprentissage de l’injection, il peut être utile d’utiliser un colorant vital pour visualiser l’injection dans la cellule comme indiqué ici, transférez les embryons dans une boîte de Pétri de 100 millimètres avec un système de culture dans l’eau à 28,5 degrés Celsius. Expulsez toute solution de morpho restante de l’aiguille et remplissez-la avec le morpho suivant à la concentration la plus élevée pour injecter le prochain lot d’embryons à un stade de développement approprié. Examinez les embryons à la recherche de phénotypes à chaque concentration de morpho injectée.

La dose seuil pour chaque morpho est la dose la plus faible à laquelle il existe un phénotype fiable défini. Plusieurs cycles de titrage peuvent être nécessaires pour définir un seuil inexact. Rechercher une interaction génétique entre deux gènes distincts.

Préparez un mélange de deux morphos d’intérêt chacun à leur concentration seuil respective. Il est important de garder à l’esprit que les embryons ne peuvent pas tolérer plus de 20 nanogrammes de morpho total par injection. Injectez les embryons de la même manière que précédemment.

Maintenir les volumes d’injection constants entre les groupes expérimentaux et les groupes témoins, ce qui doit inclure des ensembles injectés avec chaque morpho seul sous le microscope à dissection. Surveillez les embryons injectés immédiatement après l’injection et plusieurs fois dans la journée, utilisez une pipette de transfert pour retirer les embryons morts ou mourants. Étant donné que ceux-ci peuvent compromettre la viabilité des morphines restantes, une pipette de transfert déplace les embryons sous sédation ou euthanasiés à tout moment.

Montrez une diapositive de dépression pour l’observation. Pour la photographie. Utilisez une pince tranchante pour retirer le corion si nécessaire.

Stabiliser l’embryon dans une goutte de 3 % de méthylcellulose cribler les embryons pour un phénotype distinct, unique à la combinaison de morphos par opposition à une plus grande pénétrance du phénotype des morphines simples. Voici plusieurs embryons de type sauvage lorsqu’on leur injecte des morphos au seuil. Pour le gata cinq, le phénotype typique est cardio bifida ou deux cœurs, car les progéniteurs n’ont pas réussi à fusionner sur la ligne médiane.

Remarquez les cardiomyocytes positifs à la GFP indiqués par les flèches. Le phénotype de six morphines comprend des cœurs difformes qui ne fonctionnent pas correctement. Ces embryons développent également des cardiomyocytes GFP positifs.

Cependant, les embryons injectés avec une combinaison de morphos gata five et gata six montrés ici. Présenter une perte totale de développement des cardiomyocytes, indiquant que gata cinq ou gata six doit être exprimé pour que les cardiomyocytes se développent. Les deux gènes sont fonctionnellement redondants pour la spécification des cardiomyocytes.

Lors de cette procédure, il est important de valider entièrement vos morphos et d’être aussi certain que possible qu’ils représentent un véritable knockdown de la cible d’un seul gène Après cette procédure. D’autres méthodes comme la combinaison conditionnelle d’allèles nuls de souris peuvent être effectuées afin de montrer que les mêmes gènes fonctionnent. De même chez les mammifères.

Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer si deux gènes sont fonctionnellement redondants au cours de l’embryogenèse.