Structure-fonction des études chez la souris à l'aide de cellules souches embryonnaires recombinase médiation cassette d'échange

L’objectif global de cette méthode structure-fonction est de disséquer au niveau moléculaire le rôle de différents domaines protéiques, ou mutations pertinentes à la maladie, dans les cellules souches embryonnaires de souris naïves ou différenciées. Cette méthode peut aider à révéler comment différents résidus ou domaines d’une protéine peuvent contribuer à sa fonction dans un contexte cellulaire donné. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de cibler très efficacement les constructions de sauvetage du génome des cellules souches embryonnaires knock-out, ou cellules ES, et d’étudier leur rôle dans différents types de cellules.

Pour y parvenir, nous combinons trois technologies très efficaces. Il s’agit notamment de l’amélioration de l’isolement des cellules souches embryonnaires de souris, de l’assemblage de facteurs de ciblage basé sur la recombinaison et du ciblage des cellules ES via l’échange de cassettes médié par recombinaison, ou RMC. Jinke D’Hont, un technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de certaines des procédures.

L’échange de cassettes médié par recombinaison, ou RMCE, permet l’échange de fragments d’ADN entre un vecteur et un locus génomique. RMCE tire parti de sites de recombinaison hétéro-spécifiques qui ne réagissent pas de manière croisée et qui sont intégrés dans un locus génomique. En présence d’un plasmide donneur contenant un fragment d’ADN flanqué des mêmes sites hétéro-spécifiques, la recombinase insérera ce fragment d’ADN dans le locus génomique compatible RMCE en raison de la double translocation simultanée.

Ce n’est qu’en cas de recombinaison correcte que le gène de résistance à la néomycine sans promoteur piégé dans le site d’amarrage de Rosa 26 sera restauré par un promoteur PGK dans le vecteur de ciblage entrant, ce qui rend la résistance aux médicaments. Ce système de piège de résistance à la néomycine permet d’obtenir une efficacité de ciblage très élevée, souvent proche de 100 %La veille de l’isolement du blastocyste, ajoutez 0,1 % de gélatine, à 12 plaques bien cultivées. Et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Aspirez la solution de gélatine. Ensuite, ensemencez un quart d’un flacon de fibroblastes embryonnaires de souris P2, ou MEF, dans un milieu MEF, et répartissez-le sur la plaque à 12 puits. Incuber les plaques de 12 puits de MEF dans deux millilitres de MEF moyen à 37 degrés Celsius.

Et faites croître les cellules jusqu’à obtenir une monocouche confluente. Ajoutez ensuite 10 microgrammes par millilitre de graine de mitomycine dans les puits. Et incubez les cultures pendant trois heures à 37 degrés Celsius, pour inactiver les cellules.

Après avoir sélectionné des souris knock-out hétérozygotes contenant une cassette RMCE dans le locus Rosa 26 selon le protocole de texte, établissez des accouplements pour reproduire des souris knock-out hétérozygotes compatibles avec des souris knock-out hétérozygotes. Le lendemain matin, vérifiez la présence de bouchons de copulation en soulevant la femelle par la base de la patte et examinez l’ouverture vaginale à la recherche d’une masse blanchâtre. Si le bouchon est difficile à voir, avec une sonde inclinée, écartez légèrement les lèvres de la vulve, puis séparez les femelles bouchées de leurs mâles.

Pour collecter les blastocystes à 3,5 jours après le coït, ou DPC. Après avoir euthanasié les femelles enceintes, faites une incision au milieu du ventral et utilisez des ciseaux fins et des pinces pour disséquer l’utérus et l’oviducte. Ensuite, pliez une aiguille de calibre 26 dans un angle de 45 degrés attachée à une seringue de 1 millilitre remplie de milieu M2.

Et insérez l’aiguille dans l’extrémité de l’utérus la plus proche de l’oviducte. Utilisez des pinces fines pour maintenir l’aiguille en place tout en poussant le piston pour évacuer les blastocystes de l’utérus dans le couvercle d’une boîte de 10 centimètres. L’utérus va gonfler, si le rinçage est réussi.

À l’aide d’une pipette buccale, recueillez tous les embryons dans une goutte de milieu M2 et lavez les embryons deux fois dans une goutte de milieu M2. Immédiatement après avoir lavé les embryons, utilisez PBS, pour laver deux fois les cellules inactivées par la mitomycine-C. Ensuite, à l’aide d’une pipette buccale, déposer chaque blastocyste dans un puits séparé des MEF traités à la mitomycine-C, dans un milieu cellulaire SRES, complété par du pluripotent ou 2I.

Incuber les cultures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Actualisez le milieu de cellule SREF tous les deux à trois jours. Examinez chaque blastocyste au microscope stéréoscopique à un grossissement de 4X et vérifiez s’il n’y a pas d’hachures et de détachement de la couche MEF.

Après 10 à 12 jours de culture, sous un stéréomicroscope, utilisez une pipette P10 avec des pointes jetables, pour prélever des excroissances individuelles d’icium. Transférez chaque excroissance dans environ 10 microlitres de milieu dans une plaque en forme de V de 96 puits, contenant 30 microlitres par puits de PBS. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 50 microlitres de 0,25 % de trypsine dans chaque puits.

Et incubez l’assiette à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois minutes. Ajoutez 100 microlitres de milieu cellulaire ES pré-incubé contenant du FPS, et dissociez les excroissances d’icium en cellules uniques en pipetant 10 à 15 fois. Transférez ensuite les cellules dissociées sur des plaques MEF à 96 puits traitées à la mitomycine-C.

Le lendemain, changez le support basé sur SR. Élargissez les cellules ES de la même manière de plaques de 24 à 6 puits. Après avoir identifié les vecteurs d’ARNC sauvés conformément au protocole de texte, préparez une réaction LR de 10 microlitres en utilisant 100 nanogrammes de vecteur CDNA de secours, 150 nanogrammes de vecteur RMCEDV1 pré-excisé et deux microlitres de mélange de recombinase, contenant une intégrase codée par phage, une excisionase et un facteur hôte d’intégration bactérienne.

Incuber la réaction à 25 degrés Celsius pendant deux heures. Pour transformer les vecteurs recombinés, ajoutez 5 microlitres de chaque mélange, à 40 microlitres de bactéries E.Coli résistantes aux chocs thermiques, dans un tube à vis à jupe de 2 millilitres. Et incubez l’échantillon sur de la glace pendant 20 minutes.

Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez un millilitre de milieu LB dans le tube et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant une heure. Plaque 50 microlitres sur plaques de gélose avec ampicilline.

Et poussent à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Identifiez les colonies avec le bon vecteur de ciblage en utilisant une pointe P200 pour choisir cinq colonies au hasard. Transférez l’embout dans un tube à essai en verre contenant deux à cinq millilitres de milieu LB et cultivez pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Après avoir extrait l’ADN de chaque colonie, validez les échantillons en digérant 0,5 à deux microgrammes d’ADN, et séparez les échantillons sur un gel d’agarose à 1 %. Commencez une culture de cellules ES knock-out compatibles RMCE, et faites-les passer au moins deux fois sur des MEF, dans un milieu cellulaire ES à base de FBS. Ensuite, divisez les cellules ES sur une plaque gélatinisée à six puits.

Le lendemain, utilisez 1,5 millilitre de milieu cellulaire ES basé sur FBS pour rafraîchir les cellules ES qui sont confluentes à environ 50 %. Combinez un microgramme de vecteur cible de RMCEDV1 pré-excisé, contenant de l’ADNC de secours, et un microgramme de plasmide d’expression FLIPe, dans 250 microlitres de milieu DMEM pur. Ajoutez sept microlitres de réactif de transvection à base de lipofectine à 250 microlitres de milieu DMEM pur.

Et incubez la solution pendant cinq minutes à température ambiante. Combinez les solutions d’ADN et de lipofectine. Et incubez le mélange à température ambiante pendant 20 minutes.

Ensuite, pipetez le mélange de transvection sur les cellules ES rafraîchies et remuez doucement. Un jour après la transvection, séparez toutes les cellules ES du tube dans une boîte de culture de 10 centimètres, avec une couche confluente de MEFS DR4 et 10 millilitres de milieu cellulaire ES basé sur FPS. Deux jours après la transvection, sélectionnez les clones de cellules ES avec l’échange de cassette médié par FLIP-e correct, en ajoutant G418 au support.

Comme on le voit ici, l’abattage massif des colonies non ciblées devrait être visible après trois à cinq jours. Les colonies devraient apparaître après sept à 10 jours. Choisissez ces colonies, puis développez-les et vérifiez les clones comme démontré plus tôt dans cette vidéo.

Pour différencier les cellules ES en corps embryoïdes, ou EB, après la culture de cellules ES knock-out avec des constructions de sauvetage pilotées par Rosa 26 selon le protocole textuel, laissez les EB se former dans les boîtes non adhérentes pendant 30 jours. Rafraîchissez le milieu tous les deux à trois jours en transférant la suspension EB dans un tube de 50 millilitres. Et laissez les EB se stabiliser par gravité.

Retirez le surnageant, ajoutez un milieu frais et transférez la suspension EB dans une boîte de qualité bactérienne. Analyser les cellules ES et les EB par immunofluorescence et MET, selon le protocole de texte. En utilisant la méthode de la fonction de structure, cinq vecteurs de ciblage de RMCEDV1 pré-excisés ont été générés avec une efficacité de 100 % et ces constructions de sauvetage ont été ciblées via RMCE, pour que la caténine P120 élimine les cellules ES, avec une efficacité de 97 %La morphologie de l’EB kystique peut être utilisée comme lecture phénotypique pour cribler différentes constructions de sauvetage.

En tant que preuve de concept, l’isoforme 1A de la caténine P120 pilotée par R26 a sauvé le phénotype knock-out de la caténine p120. Pour tester si l’ancrage membranaire indépendant de la caténine P120 a permis la formation d’EB csytique, le motif de ciblage de la membrane k-ras, CAAX, a été fusionné à l’extrémité carboxy de la caténine P120, et introduit via RMCE, pour que la caténine P120 élimine les cellules ES, avant que les EB ne soient fabriqués à partir de celles-ci. Cependant, cette construction sert un négatif dominant qui ne permet pas la liaison et la stabilisation de l’E-cadhérine.

Et par conséquent, ne sauve pas le phénotype p120 catenin knock out. La transition épithélio-mésenchymateuse, ou EMT, est un processus de développement essentiel qui se produit également lors de la différenciation des cellules ES. Lorsqu’ils sont exprimés dans la caténine p120 qui éliminent les cellules ES, les inducteurs EMT, ZEB1, ZEB2 ou l’escargot qui peuvent réprimer directement divers gènes marqueurs épithéliaux comme l’E-cadhérine, n’ont pas réussi à restaurer la formation d’EB kystique.

Une fois maîtrisées, les cellules ES compatibles RMCE peuvent être isolées en un mois. Des vecteurs de ciblage compatibles RMCE peuvent être générés en une semaine, et un sauvetage ciblé des cellules ES peut être réalisé en un mois en utilisant cette technique, si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser RMCE pour effectuer des études de fonction de structure dans des cellules souches embryonnaires naïves ou différenciées.