Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve

L'objectif général de cette procédure est d'administrer des oligonucléotides morpholinos par des injections intraventriculaires chez des larves de nageoire de cabillaud afin d'inactiver des gènes et d'évaluer leur fonction durant la régénération. Cette opération s'effectue en anesthésiant d'abord la larve, puis en la plaçant dans une rainure du moule en aros. Ensuite, l'aiguille d'injection est insérée dans le ventricule cardiaque.

Ensuite, la solution de morpholino est injectée quatre à six fois dans le ventricule, avec des intervalles pondérés entre les impulsions afin de permettre l'élimination du cœur. Enfin, la nageoire caudale est amputée et laissée en régénération pendant trois jours. En définitive, l'effet sur la régénération de la nageoire peut alors être évalué en mesurant la surface régénérée de la nageoire à l'aide de l'outil de tracé de lignes du logiciel libre Fiji ImageJ.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transgénèse ou la mutagenèse est qu'elle permet l'extinction ciblée de gènes par minos dans des tissus larvaires qui ne conviennent pas aux injections directes. À l'aide de capillaires en verre d'un diamètre de 0,75 millimètre, insérez-en un dans un tireur d'aiguilles et tirez l'aiguille selon les paramètres suivants. Puis, à l'aide de pinces de bijoutier et sous un stéréomicroscope équipé d'un oculaire micrométrique, cassez le capillaire étiré afin d'obtenir une aiguille de 20 micromètres de diamètre. Utilisez ensuite un tour muni d'une meule en caoutchouc rotative pour aiguiser l'aiguille et obtenir un biseau de 20 micromètres. Préparez la solution mère de Morpho en dissolvant le Morpho lyophilisé dans un XPBS pour obtenir une concentration finale de 7,5 millimolaire.

Mélanger la solution d'injection Morpho en combinant 2,5 microlitres de solution mère Morpho avec 2,8 microlitres de solution mère d'endo Porter à un millimolaire pour obtenir une concentration finale de 3,5 millimolaire de morph et de 0,5 millimolaire d'endo porter afin d'effectuer les injections. Utiliser une micropipette équipée d'une pointe de 10 microlitres pour charger l'aiguille en verre biseautée avec cinq microlitres de solution Morpho. Insérer ensuite l'aiguille en verre dans le porte-aiguille du micromanipulateur relié à la pompe pneumatique pico-pompe.

Régler l'angle des injections à environ 45 degrés afin que l'aiguille doive être déplacée dans une seule direction plane. Ensuite, régler les valeurs du microinjecteur comme suit : une pression de maintien de 20 livres par pouce carré (psi), une pression d'éjection de 15 psia, une durée de gâchette de 100 millisecondes et une valeur de période de 1,9, ce qui correspond à 10,9 millisecondes. Préparer 20 millilitres d'agarose fondue à 1,5 % dans un XPBS et verser dans une boîte de Pétri de 10 centimètres.

Ensuite, placer un moule d'injection cannelé dans l'agarose tiède afin de former des sillons dans le gel durci pour anesthésier les larves. Placer celles-ci dans 100 millilitres d'eau d'aquarium contenant 20 milligrammes par litre de trican. Une fois qu'elles cessent de réagir au toucher, utiliser une pipette pasteur en plastique pour transférer délicatement la larve dans un sillon du moule d'agarose humide, de manière à ce que la face ventrale soit tournée vers la paroi verticale en agarose du sillon.

Placer la plaque avec l'embryon sous le microscope stéréo de manière à ce que le ventricule soit orienté à l'opposé de l'aiguille d'injection. Ensuite, abaisser l'aiguille et l'insérer d'environ un à deux micromètres dans le ventricule cardiaque, en prenant soin de ne pas l'insérer trop profondément.

Ensuite, injecter une impulsion de trois nanolitres de solution Morpho dans le ventricule et attendre pour permettre l'élimination du cœur avant de répéter l'opération avec cinq impulsions supplémentaires. Après l'injection, retirer l'aiguille et la placer dans une boîte de Pétri contenant un XPBS afin d'éviter qu'elle ne s'assèche. Puis, à l'aide d'une pipette de transfert remplie de milieu E trois, transférer soigneusement les larves dans une boîte de Pétri contenant du milieu E trois frais afin de garantir l'absorption et le maintien du morpholino dans les cellules. Répéter les injections toutes les 12 à 24 heures pendant toute la durée de l'expérience afin d'évaluer les effets des injections.

Après avoir anesthésié les poissons, placez-les sur une plaque plate humide recouverte de milieu E3 avant de les observer au microscope stéréo en champ clair et en fluorescence. Analysez les images pour évaluer la régénération à l'aide du logiciel gratuit Fiji ImageJ, en utilisant l'outil de traçage de ligne afin de déterminer la quantité de croissance régénérative survenue. Commencez par étalonner les images en faisant glisser et déposer un fichier dans la fenêtre principale de Fiji depuis le menu principal.

Définissez l'échelle pour toutes les images en cliquant sur analyser dans le menu déroulant. Cliquez sur définir l'échelle, puis activez l'option globale en cochant la case. Faites maintenant glisser et déposez à nouveau l'image pour mesurer la quantité de croissance régénérative dans la barre d'outils.

Choisissez l'outil de sélection à main levée et entourez la zone à mesurer. Enfin, appuyez sur Ctrl + M. Une nouvelle fenêtre de résultats s'ouvrira, affichant la valeur de la zone entourée en pixels carrés. Comme on le voit ici, quelques minutes après l'injection, la solution morpho endo porter se répartit dans la vascularisation jusqu'à différents tissus, tels que le repli de la nageoire et le cerveau, pendant au moins 12 heures ou plus.

Pour évaluer la régénération des structures distales de la nageoire larvaire, les éléments suivants ont été retirés : l'extrémité distale du repli de la nageoire et de la moelle épinière, la région distale sans cordon, le muscle du tronc distal, qui n'est pas visible ici, ainsi que les cellules pigmentaires, difficiles à cibler par injection directe, mais qui semblent intégrer le morpholino après des injections ventriculaires en série. Ainsi, cette méthode favorise relativement facilement l'acheminement du morpholino vers des tissus difficiles à cibler individuellement, et permet d'évaluer la fonction des gènes dans plusieurs tissus de la nageoire en cours de régénération simultanément. Pour analyser l'importance de gènes spécifiques impliqués dans la régénération, la nageoire caudale larvaire est partiellement amputée, et tous les tissus ayant intégré le morpholino sont résectés.

Le repli de la nageoire larvaire régénère sa structure en quelques jours suivant l'amputation, comme cela a été démontré. Ici, le morpholino cible des gènes nécessaires à la régénération, perturbant ainsi la réponse régénérative par rapport aux contrôles non injectés et aux contrôles avec morpholino à séquence non spécifique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération pour explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans la régénération de la nageoire du poisson zèbre.