Name: Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Découvrez une méthode d'injection intraventriculaire de morpholinos chez les larves de Danio rerio pour étudier la fonction des gènes pendant la régénération tissulaire. Cette technique permet d'évaluer l'effet des gènes sur la régénération de la nageoire caudale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), nous tenons à remercier Ayele Tsedeke Taddese pour le support technique.

Une. Préparation des aiguilles de verre (Figure 1) <ol><li> Utiliser des capillaires en verre d&#39;un diamètre de 0,75 mm pour préparer des aiguilles d&#39;injection (Figure 1A). </li><li> Placer le capillaire de verre dans un extracteur d&#39;aiguille et retirez l&#39;aiguille avec le paramètre suivant: valeur du cycle de chauffage: 463; tirant valeur du cycle: 230; vitesse: 150 ms; temps: 150 ms (figure 1B). </li><li> Briser le capillaire en verre tiré avec des pincettes horloger pour produire une aiguille 20 um de diamètre sous un stéréoscope avec un micromètre oculaire. </li><li> Utilisez un tour avec un rouet de caoutchouc mouillée pour aiguiser l&#39;aiguille et produire un biseau 20 um (figures 1C et 1D). Remarque: Sharp, aiguilles biseautées améliorer la facilité d&#39;insertion dans le ventricule et de minimiser ainsi les dommages aux tissus et autorisent le muscle perforé pour resceller après le retrait de l&#39;aiguille (figures 1E-G). </li></ol> 2. Preparation de la solution morpholino <ol><li> Préparer le morpholino en dissolvant le morpholino lyophilisée en 1x tampon phosphate salin (PBS) à une concentration finale de 7,5 mM. [Voir les instructions du fabricant pour plus de détails (de table Matériaux)]. </li><li> Préparer la solution d&#39;injection de morpholino par mélange d&#39;une solution de 2,5 pi morpholino d&#39;actions (7,5 mM) avec Endo-Porter solution stock de 2,8 pi (1 mM) (Voir le tableau des matériaux) pour une concentration finale de morpholino 3,5 mM et 0,5 mM Endo-Porter. </li></ol> 3. Préparation du morpholino injection (figure 2) <ol><li> Chargez l&#39;aiguille de verre biseauté avec 5 pi de cette solution à l&#39;aide d&#39;une micropipette avec une pointe de pipette microloader de 10 pi. </li><li> Insérer l&#39;aiguille de verre dans le porte-aiguille de la micro-manipulateur relié à la pompe de pico pneumatique (figures 2A-C). </li><li> Placez le porte-aiguille à côté du microscope afin que l&#39;aiguille seulement les besoinspour être déplacée dans une direction plane de l&#39;insérer dans le ventricule cardiaque de la chenille (figure 2A). </li><li> Ajustez l&#39;angle pour les injections à environ 45 °. </li><li> Définissez les valeurs de micro-injecteur comme suit: pression de maintien: 20 livres par pouce carré (psi); pression d&#39;éjection: 15 psi; 100 msec gamme de déclenchement, la valeur de période de 1,9 (correspondant à 10,9 ms). </li><li> Faire fondre l&#39;agarose dans du PBS 1x en utilisant un four micro-ondes standard pour produire 20 ml d&#39;un 1,5% (p / v) de gel. Verser gel fondu dans une boîte de 10 cm de Pétri. Placez une forme d&#39;injection à gorge dans la gélose chaud de sorte qu&#39;une fois durcie, la gélose aura sillons dans lesquels la larve sous sédation sera placé 11 (figures 2D et 2E). </li></ol> 4. Injections (Figure 3) <ol><li> Anesthésier larve dans 100 ml d&#39;eau de l&#39;aquarium avec 20 mg / L tricaïne (L-éthyl-m-amino-benzoate-méthane sulfonate) jusqu&#39;à ce qu&#39;ils cessent de répondre au toucher. </li><li> Utilisez une pipett Pasteur en plastiquee pour transférer soigneusement la larve sédation dans une rainure du moule agarose humide de sorte que la face ventrale est confronté contre la paroi verticale de la rainure d&#39;agarose (figure 3A). </li><li> Placer la plaque d&#39;agarose sous la loupe binoculaire de telle sorte que le ventricule n&#39;est pas tourné vers l&#39;aiguille d&#39;injection (figure 3A). </li><li> Abaissez l&#39;aiguille pour l&#39;insérer dans le ventricule cardiaque. Insérez l&#39;aiguille seulement 1-2 pm dans le ventricule en prenant soin de ne pas insérer l&#39;aiguille trop profondément (figures 3B et 3C). </li><li> Une fois que l&#39;aiguille est insérée, injecter la solution de morpholino dans le ventricule avec 4-6 impulsions, chaque 3 nl délivrant de la solution, avec des intervalles d&#39;attente pour permettre la compensation du coeur (Figures 3D et 3E). </li><li> Après l&#39;injection, retirez l&#39;aiguille (parallèle au plan de l&#39;insertion), puis transférer avec soin la larve à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur en plastique rempli de E3 milieu back dans une boîte de Petri contenant un milieu de E3 frais. </li><li> Placer l&#39;aiguille dans une boîte de Petri contenant du PBS 1x pour empêcher le séchage de l&#39;aiguille lors du transfert de la larve injecté. </li><li> Répétez les étapes 4.1 à 4.6 tous les 12-24 heures pour la durée de l&#39;expérience. Remarque: La répétition des injections assure la fixation et le maintien de la morpholino dans les cellules. </li></ol> 5. Analyses des injections (figure 4) <ol><li> Anesthésier le poisson dans 100 ml d&#39;eau de l&#39;aquarium avec 20 mg / L tricaine jusqu&#39;à ce qu&#39;ils cessent de répondre au toucher. </li><li> Placez la larve latéralement sur un plat humide de 1,5% (p / v) d&#39;agarose plaque recouverte de milieu E3. </li><li> larves de l&#39;image en utilisant un stéréomicroscope clair et l&#39;imagerie de fluorescence. Remarque: Comme les larves sont transparentes, le morpholino-fluorescéine marqué devrait être visible que le vert fluorescent dans les vaisseaux sanguins dans tout l&#39;animal immédiatement après l&#39;injection. Cette fluorescence va encore se disperser dans les tissus vascularisés par15 min (Figures 4A-4C). </li></ol> 6. Évaluation de la médecine régénérative excroissance <ol><li> Évaluer les images capturées à l&#39;aide Fidji Image J logiciel libre (http://fiji.sc/Fiji). Pour enquêter sur la régénération, utilisez l&#39;outil de ligne de traçage pour déterminer le montant de la croissance régénératrice qui a eu lieu sur le contrôle et la larve de morpholino-injecté. </li><li> Pour calibrer les images, ouvrez l&#39;un des fichiers d&#39;image d&#39;origine à Fidji en faisant glisser le fichier dans la fenêtre principale de Fidji. </li><li> Pour définir l&#39;échelle de toutes les images suivantes, allez dans &quot;Analyser&quot; dans le menu principal. </li><li> Dans le menu déroulant, cliquez sur &quot;Définir échelle&quot;. </li><li> Dans cette fenêtre, activez l&#39;option «Global» en cliquant sur la case à cocher. </li><li> Maintenant, ouvrez l&#39;image pour mesurer la quantité de la croissance régénératrice encore par glisser-déposer (voir l&#39;étape 6.1). </li><li> Choisissez l&#39;option &quot;sélections à main levée&quot; outil dans la barre d&#39;outils. </li><li> Entourer la zone à mesurer (Figures 4J-4L). </li><li> Appuyez sur Ctrl + M. Cela va ouvrir une nouvelle fenêtre «Résultats» montrant la valeur de la zone encerclée en pixels carrés. </li></ol>

<ol><li>Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6, 2011 (1998).</li>
<li>Skromne, I., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+in+zebrafish+reverse+genetics%3A+moving+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward.</a> Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).</li>
<li>Zu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-mediated+precise+genome+modification+by+homologous+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish.</a> Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491, 114-118 (2012).</li>
<li>Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+gene+expression+in+the+adult+zebrafish+brain+using+cerebroventricular+microinjection+of+morpholino+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+are+powerful+multipurose+vital+labeling+agents+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).</li>
<li>Madhavan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilmour%2C+DT+%22Zebrafish%3A+a+practical+approach%22">Zebrafish: a practical approach</a>. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+morpholino+experiments%3A+don%27t+stop+making+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135, 1735-1743 (2008).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Hyatt, T. M., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+and+techniques+for+ectopic+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).</li>
<li>Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+controlled+site-specific+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li>
<li>Liu, S., D, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Re.+Pathol.+Mech.+Dis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for cancer.</a> Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).</li>
<li>Stoick-Cooper, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Wnt+signaling+pathways+have+opposing+roles+in+appendage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration.</a> Development. 134, 479-489 (2007).</li>
<li>Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+targets+of+the+Sox+domain+proteins+Dichaete+in+the+Drosophila+CNS+via+targeted+expression+of+dominant+negative+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins.</a> BMC Dev. Biol. 13, (2013).</li>
<li>McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legless%2C+a+novel+mutation+found+in+PHT1-1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice.</a> Science. 241, 837-839 (1988).</li>
<li>Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+DNA+rearrangements+and+early+developmental+arrest+caused+by+DNA+insertion+in+transgenic+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;injection intraventriculaire fournit une méthode d&#39;évaluation rapide et fiable pour tester la fonction des gènes à des stades ultérieurs du développement ou de l&#39;homéostasie du corps sans affecter la fonction des gènes au cours de l&#39;embryogenèse. Pour assurer le succès de cette technique, il faut être conscient de quatre points essentiels: 1) la taille de l&#39;aiguille, 2) le séchage de l&#39;aiguille, 3) réduire au minimum le volume, et 4) la durée d&#39;exposition minimale à la solution de la sédati...

Régénération des organes et des appendices est d&#39;une importance fondamentale pour la survie et remise en forme; Toutefois, plusieurs vertébrés, y compris l&#39;homme ont limité capacités régénératrices. Bien que plusieurs modèles animaux existent qui ont une vaste capacité de régénération, inverser techniques génétiques pour évaluer la fonction des gènes au cours de l&#39;orgue et appendice régénération reste très limitée ou inexistante. Par conséquent, de nouvelles approches sont nécessaires pour disséquer la biologie moléculaire de la régénération dans ces organismes modèles. Le poisson zèbre est un modèle bien établi pour la compréhension de la biologie cellulaire et moléculaire de l&#39;orgue et appendice régénération 1, non seulement en raison de son importante capacité de régénérer plusieurs organes, de tissus et des appendices, mais aussi parce que plusieurs lignes de poissons transgéniques existent pour suivre les cellules et surexpriment le gène construit 2, 3. Cependant, l&#39;inhibition du gène chez le poisson zèbre larves se limite essentiellement à la overexpression de constructions dominants négatifs, qui ne sont pas disponibles pour tous les gènes d&#39;intérêt ou dont le produit transgène peut acquérir un gain de fonction des effets qui ne reflètent pas l&#39;activité endogène du gène. Ainsi, une méthode alternative pour éliminer spécifiquement l&#39;expression des gènes par KO ou effet de choc est nécessaire pour surmonter ces problèmes. Gène spécifique ciblant l&#39;aide TALENS existe comme un moyen de génétique inverse pour Knockout la fonction des gènes; Toutefois, cette stratégie de knock-out est très souvent limitée à des évaluations fonctionnelles au cours de l&#39;embryogenèse précoce, parce que les exigences initiales du gène empêchent la progression du développement embryonnaire. Ainsi, l&#39;étude des phénomènes ultérieurs tels que la régénération ou l&#39;homéostasie des organes après le développement à l&#39;aide TALENS est exclue 4, 5. Par conséquent, une stratégie d&#39;élimination de gène de remplacement est nécessaire que la fonction du gène cible après le développement précoce d&#39;évaluer les besoins de gènes dans les organes et structures complètement formés. </p&gt; Morpholino injection a été montré pour être efficace dans le ciblage de gènes dans quelques organes adultes et l&#39;adulte régénération nageoire 6-8, mais ces méthodes nécessitent l&#39;électroporation et de nombreux organes internes sont difficiles à électroporation soit en raison de leur emplacement ou de leur sensibilité à l&#39;électrique perturbation. En outre, certains tissus de la larve sont difficiles à injecter directement, car l&#39;injection directe peut perturber leur intégrité structurelle ou parce que leur taille est limitant. La nageoire caudale de la chenille est une telle structure, car une injection directe dans le finfold n&#39;est pas possible. Ainsi, une alternative à l&#39;électroporation et l&#39;injection directe a été nécessaire pour cibler des gènes dans des tissus qui sont soit trop petite pour injecter ou ne peut pas être soumis à une électroporation. Afin de cibler et d&#39;inhiber la fonction de gènes spécifiques au cours de la régénération de la nageoire caudale larvaire, nous avons modifié les technologies existantes permettant morpholino l&#39;unÉVALUATION de la fonction des gènes lors de la régénération de la nageoire caudale dans larve de fin de mise en scène. Cette méthode emploie livraison intraventriculaire 9 de marqué à la fluorescéine morpholinos avec Endo-Porter réactif de transfection 10. Une fois dans le ventricule, le mélange morpholino-Endo-Porter se propage rapidement à travers la larve via le système vasculaire et pénètre dans les tissus qui ont été auparavant impossible à cibler. Cette méthode d&#39;injection peut être modifié pour cibler des gènes dans des tissus spécifiques et très probablement peut être appliquée dans d&#39;autres modèles animaux qui n&#39;ont pas actuellement de méthodes de génétique inverse pour inhiber la fonction des gènes. Ainsi, il offre une méthode rapide et facile avec le potentiel pour une large utilisation de la gamme d&#39;étudier immédiatement la fonction des gènes au cours de l&#39;homéostasie des organes général et la régénération au stade larvaire.

<table><tbody><tr><td>Morpholino avec 3&acute ; étiquette de fluorescéine</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>Personnalisé</td><td>Plus d’informations chez www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene Tools Inc.</td><td></td><td>Plus d’informations sur www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Serva</td><td>120623</td><td>Pour verser des plaques pour placer le poisson lors des injections et l’imagerie</td></tr><tr><td>Tricaïne (L-Ethyl-m-amino-benzate-méthane sulfonate)</td><td>Applichem</td><td></td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>E3 milieu (5 mM NaCl ; 0,17 mM KCl ; 0,33 mM CaCl2 ; 0,33 mM MgSO4)</td><td></td><td></td><td>Pour l’élevage des larves</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td>Pour placer le poisson pendant les injections et l’imagerie</td></tr><tr><td>Capillaires en verre à paroi mince</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-3</td><td>Pour la préparation des aiguilles d’injection Pointes</td></tr> de <tr><td>pipette Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5,242,956,003</td><td>Pour le chargement de l’aiguille</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur (3 ml/1 ml)</td><td>Marque</td><td>747760/ 74775</td><td>Pour le transfert de larve</td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille Flaming/Brown</td><td>Sutter</td><td></td><td>Plus d’informations sur www.sutter.com</td></tr><tr><td>Horloger (Dumont) Pince à épiler (taille 5)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501985</td><td>Pour casser l’aiguille avant l’affûtage</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Varie selon le fabricant</td><td>Fait partie de l’ensemble de la configuration d’injection</td></tr><tr><td>Caméra à fluorescence</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Varie selon le fabricant</td><td>Pour imager la fluorescence après l’injeciton</td></tr><tr><td>PicoNozzle kit (porte-micro-injecteur)</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>Pour microinjections</td></tr><tr><td>PicoPump pneumatique (micro-injecteur)</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>Pour les micro-injections</td></tr></tbody></table>

inverser approche morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre larve

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

Le poisson zèbre est un modèle important de comprendre la biologie cellulaire et moléculaire de l&#39;orgue et appendice régénération. Cependant, les stratégies moléculaires pour employer la génétique inverse ne sont pas encore suffisamment développées pour évaluer la fonction d&#39;un gène dans la régénération ou l&#39;homéostasie tissulaire au cours de stades larvaires après l&#39;embryogenèse poisson-zèbre, et de plusieurs tissus dans la larve de poisson zèbre est difficile à cibler. Injections intraventriculaires de morpholinos spécifiques d&#39;un gène offrent une méthode alternative pour l&#39;incapacité actuelle à une cible, sur le plan génomique de poisson zèbre gènes d&#39;une manière contrôlée dans le temps à ces stades. Cette méthode permet une dispersion complète et l&#39;incorporation ultérieure de la morpholino dans divers tissus du corps, y compris les structures qui étaient auparavant impossible à atteindre telles que celles de la nageoire caudale larvaire, une structure souvent utilisée pour la recherche de manière non invasive la régénération des tissus. Plusieurs gènes activés au cours des larves régénération finfold sont également présentationt dans la régénération de tissus de vertébrés adulte, si la larve est un modèle utile pour comprendre la régénération chez les adultes. Ce procédé de dispersion morpholino permet l&#39;identification rapide et facile des gènes requis pour la régénération des tissus larvaires ainsi que d&#39;autres phénomènes physiologiques régulant l&#39;homéostasie tissulaire après l&#39;embryogenèse. Par conséquent, ce mode de livraison fournit une stratégie actuellement nécessaires pour le contrôle temporel de l&#39;évaluation de la fonction des gènes après l&#39;embryogenèse.

L&#39;aiguille d&#39;injection biseauté forte est facilement placé dans le ventricule cardiaque de la larve de poisson zèbre lorsqu&#39;il est sollicité dorsale (figure 3A). Le cœur continue pompage et la circulation sanguine est maintenue en dépit de la présence de l&#39;aiguille (Figures 3B et 3C). Injections prudents ne perturbent pas la morphologie du ventricule ou les contractions cardiaques (figure 3D) malgré l&#39;injection du morpholino dans le ...

Un procédé de génétique inverse adapté pour un poisson zèbre pour déterminer la fonction des gènes au cours des stades ultérieurs de développement et de l&#39;homéostasie physiologique tel que la régénération des tissus en utilisant des injections intraventriculaires de morpholinos spécifiques d&#39;un gène.

Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

L'objectif général de cette procédure est d'administrer des oligonucléotides morpholinos par des injections intraventriculaires chez des larves de nageoire de cabillaud afin d'inactiver des gènes et d'évaluer leur fonction durant la régénération. Cette opération s'effectue en anesthésiant d'abord la larve, puis en la plaçant dans une rainure du moule en aros. Ensuite, l'aiguille d'injection est insérée dans le ventricule cardiaque.Ensuite, la solution de morpholino est injectée quatre à six fois dans le ventricule, avec des intervalles pondérés entre les impulsions afin de permettre l'élimination du cœur. Enfin, la nageoire caudale est amputée et laissée en régénération pendant trois jours. En définitive, l'effet sur la régénération de la nageoire peut alors être évalué en mesurant la surface régénérée de la nageoire à l'aide de l'outil de tracé de lignes du logiciel libre Fiji ImageJ.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transgénèse ou la mutagenèse est qu'elle permet l'extinction ciblée de gènes par minos dans des tissus larvaires qui ne conviennent pas aux injections directes. À l'aide de capillaires en verre d'un diamètre de 0,75 millimètre, insérez-en un dans un tireur d'aiguilles et tirez l'aiguille selon les paramètres suivants. Puis, à l'aide de pinces de bijoutier et sous un stéréomicroscope équipé d'un oculaire micrométrique, cassez le capillaire étiré afin d'obtenir une aiguille de 20 micromètres de diamètre. Utilisez ensuite un tour muni d'une meule en caoutchouc rotative pour aiguiser l'aiguille et obtenir un biseau de 20 micromètres. Préparez la solution mère de Morpho en dissolvant le Morpho lyophilisé dans un XPBS pour obtenir une concentration finale de 7,5 millimolaire.Mélanger la solution d'injection Morpho en combinant 2,5 microlitres de solution mère Morpho avec 2,8 microlitres de solution mère d'endo Porter à un millimolaire pour obtenir une concentration finale de 3,5 millimolaire de morph et de 0,5 millimolaire d'endo porter afin d'effectuer les injections. Utiliser une micropipette équipée d'une pointe de 10 microlitres pour charger l'aiguille en verre biseautée avec cinq microlitres de solution Morpho. Insérer ensuite l'aiguille en verre dans le porte-aiguille du micromanipulateur relié à la pompe pneumatique pico-pompe.Régler l'angle des injections à environ 45 degrés afin que l'aiguille doive être déplacée dans une seule direction plane. Ensuite, régler les valeurs du microinjecteur comme suit : une pression de maintien de 20 livres par pouce carré (psi), une pression d'éjection de 15 psia, une durée de gâchette de 100 millisecondes et une valeur de période de 1,9, ce qui correspond à 10,9 millisecondes. Préparer 20 millilitres d'agarose fondue à 1,5 % dans un XPBS et verser dans une boîte de Pétri de 10 centimètres.Ensuite, placer un moule d'injection cannelé dans l'agarose tiède afin de former des sillons dans le gel durci pour anesthésier les larves. Placer celles-ci dans 100 millilitres d'eau d'aquarium contenant 20 milligrammes par litre de trican. Une fois qu'elles cessent de réagir au toucher, utiliser une pipette pasteur en plastique pour transférer délicatement la larve dans un sillon du moule d'agarose humide, de manière à ce que la face ventrale soit tournée vers la paroi verticale en agarose du sillon.Placer la plaque avec l'embryon sous le microscope stéréo de manière à ce que le ventricule soit orienté à l'opposé de l'aiguille d'injection. Ensuite, abaisser l'aiguille et l'insérer d'environ un à deux micromètres dans le ventricule cardiaque, en prenant soin de ne pas l'insérer trop profondément.Ensuite, injecter une impulsion de trois nanolitres de solution Morpho dans le ventricule et attendre pour permettre l'élimination du cœur avant de répéter l'opération avec cinq impulsions supplémentaires. Après l'injection, retirer l'aiguille et la placer dans une boîte de Pétri contenant un XPBS afin d'éviter qu'elle ne s'assèche. Puis, à l'aide d'une pipette de transfert remplie de milieu E trois, transférer soigneusement les larves dans une boîte de Pétri contenant du milieu E trois frais afin de garantir l'absorption et le maintien du morpholino dans les cellules. Répéter les injections toutes les 12 à 24 heures pendant toute la durée de l'expérience afin d'évaluer les effets des injections.Après avoir anesthésié les poissons, placez-les sur une plaque plate humide recouverte de milieu E3 avant de les observer au microscope stéréo en champ clair et en fluorescence. Analysez les images pour évaluer la régénération à l'aide du logiciel gratuit Fiji ImageJ, en utilisant l'outil de traçage de ligne afin de déterminer la quantité de croissance régénérative survenue. Commencez par étalonner les images en faisant glisser et déposer un fichier dans la fenêtre principale de Fiji depuis le menu principal.Définissez l'échelle pour toutes les images en cliquant sur analyser dans le menu déroulant. Cliquez sur définir l'échelle, puis activez l'option globale en cochant la case. Faites maintenant glisser et déposez à nouveau l'image pour mesurer la quantité de croissance régénérative dans la barre d'outils.Choisissez l'outil de sélection à main levée et entourez la zone à mesurer. Enfin, appuyez sur Ctrl + M. Une nouvelle fenêtre de résultats s'ouvrira, affichant la valeur de la zone entourée en pixels carrés. Comme on le voit ici, quelques minutes après l'injection, la solution morpho endo porter se répartit dans la vascularisation jusqu'à différents tissus, tels que le repli de la nageoire et le cerveau, pendant au moins 12 heures ou plus.Pour évaluer la régénération des structures distales de la nageoire larvaire, les éléments suivants ont été retirés : l'extrémité distale du repli de la nageoire et de la moelle épinière, la région distale sans cordon, le muscle du tronc distal, qui n'est pas visible ici, ainsi que les cellules pigmentaires, difficiles à cibler par injection directe, mais qui semblent intégrer le morpholino après des injections ventriculaires en série. Ainsi, cette méthode favorise relativement facilement l'acheminement du morpholino vers des tissus difficiles à cibler individuellement, et permet d'évaluer la fonction des gènes dans plusieurs tissus de la nageoire en cours de régénération simultanément. Pour analyser l'importance de gènes spécifiques impliqués dans la régénération, la nageoire caudale larvaire est partiellement amputée, et tous les tissus ayant intégré le morpholino sont résectés.Le repli de la nageoire larvaire régénère sa structure en quelques jours suivant l'amputation, comme cela a été démontré. Ici, le morpholino cible des gènes nécessaires à la régénération, perturbant ainsi la réponse régénérative par rapport aux contrôles non injectés et aux contrôles avec morpholino à séquence non spécifique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération pour explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans la régénération de la nageoire du poisson zèbre.

reverse-genetic-morpholino-approach-using-cardiac-ventricular

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

La microinjection est une méthode bien établie et efficace pour introduire des substances étrangères dans des embryons de poisson zèbre fécondé. Ici, nous démontrons une technique de microinjection robustes pour effectuer une surexpression d'ARNm, et morpholino oligonucléotides études de génétique chez le poisson zèbre knockdown.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

La fonction des gènes peut être obscurci dans la perte de fonction des expériences s'il ya compensation par un autre gène. Le modèle de poisson zèbre offre un relativement haut-débit moyen de révéler de telles redondance fonctionnelle dans les embryons vivants.

Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l&#39;embryogenèse

Une méthode pour l'expression conditionnelle knockdown une protéine cible dans la rétine de poisson zèbre adulte est décrite, qui consiste à injecter par voie intravitréenne morpholinos antisens et les électroporation dans la rétine. La protéine résultante est assommée pendant plusieurs jours, ce qui permet de tester le rôle de la protéine dans la régénération ou de la rétine intacte.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Le protocole décrit l’inhibition ciblée de l’expression génique chez le poisson zèbre par injection de morpholino dans la queue.

Injection de morpholino : une méthode pour inhiber l’expression génique cible afin d’étudier la fonction chez le poisson zèbre

Ici, nous présentons une approche systématique de développement physiologiquement pertinente, sensible et...

In Vivo modélisation du génome humain morbide utilisant Danio rerio

Dans cet article, nous démontrons une méthode pour la manipulation de l'expression des gènes dans les cellules ventriculaires du télencéphale de poisson zèbre adulte en utilisant des oligonucléotides antisens morpholino. Nous présentons aussi un protocole efficace et rapide qui peut être utilisé pour des études fonctionnelles dans le cerveau des vertébrés adultes cette méthode.

Micromanipulation de l&#39;expression génique dans le cerveau de poisson zèbre adulte en utilisant microinjection Cerebroventricular d&#39;oligonucléotides Morpholino

Suivi en direct des progéniteurs rétiniens WT individuels dans des contextes génétiques distincts permet l'évaluation de la contribution de la signalisation non-autonome cellule pendant la neurogenèse. Ici, une combinaison de knock - down de gènes, la génération par la transplantation d' embryons chimères et in vivo d' imagerie confocale time-lapse a été utilisé à cette fin.

Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

Après la formation du tube neural, le neuroépithélium resserre et se replie alors que le tube se remplit de liquide céphalorachidien embryonnaires (eCSF) pour former les ventricules du cerveau embryonnaire. Nous avons développé cette technique d'injection du ventricule afin de mieux visualiser l'espace rempli de liquide, contrairement à la forme neuroépithéliales dans un embryon vivant.

Injection Zebrafish ventricule cérébral

Ici, nous montrons comment faire rétro-orbitaires d'injection chez le poisson zèbre adulte.

Rétro-orbitaire d&#39;injection chez le poisson zèbre pour adultes

Découvrez une méthode d'injection intraventriculaire de morpholinos chez les larves de Danio rerio pour étudier la fonction des gènes pendant la régénération tissulaire. Cette technique permet d'évaluer l'effet des gènes sur la régénération de la nageoire caudale.

Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve (Vidéo) | JoVE Journal

Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve

Explorer plus de vidéos