Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve

L’objectif global de cette procédure est d’administrer des oligonucléotides morphes par des injections ventriculaires dans la larve, la nageoire dorlotée et les gènes knock-down afin d’évaluer leur fonction pendant la régénération. Ceci est accompli en anesthésiant d’abord la larve et en la plaçant dans une rainure du moule aros. Ensuite, l’aiguille d’injection est insérée dans le ventricule cardiaque.

Ensuite, la solution morpho est injectée quatre à six fois dans le ventricule avec des intervalles de pondération entre les impulsions pour permettre le dégagement du cœur. Enfin, la nageoire du cajou est amputée et laissée se régénérer pendant trois jours. En fin de compte, l’effet sur la régénération de la nageoire peut ensuite être évalué en mesurant la surface régénérée de la nageoire à l’aide de l’outil de traçage de lignes du logiciel open source Fiji image J.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la transgenèse ou la mutagénèse, est qu’elle permet l’inactivation de gènes par des minos dans des tissus larvaires qui ne sont pas adaptés aux injections directes. À l’aide de capillaires en verre d’un diamètre de 0,75 millimètre, placez-en un dans un extracteur d’aiguille et tirez l’aiguille avec les paramètres suivants avec une pince à épiler d’horloger, et sous un stéréoscope avec un oculaire micrométrique, cassez le capillaire tiré pour produire une aiguille de 20 micromètres de diamètre. Ensuite, utilisez un tour avec une roue en caoutchouc marié pour affûter l’aiguille et produire un biseau de 20 micromètres. Préparez le stock de morpho en dissolvant le Morpho lyophilisé dans un XPBS jusqu’à une concentration finale de 7,5 millimolaires.

Mélangez la solution d’injection de Morpho en combinant 2,5 microlitres de solution mère de Morpho avec 2,8 microlitres de solution mère d’endo Porter millimolaire pour une concentration finale de 3,5 millimolaires de morphe et de 0,5 millimolaire d’endoporter pour effectuer les injections. À l’aide d’une micropipette avec un embout de 10 microlitres, chargez l’aiguille de verre biseautée avec cinq microlitres de solution morpho. Insérez ensuite l’aiguille en verre dans le porte-aiguille du micromanipulateur relié à la pompe pico pneumatique.

Ajustez l’angle des injections à environ 45 degrés afin que l’aiguille n’ait besoin d’être déplacée que dans une seule direction de rabotage. Ensuite, réglez les valeurs du micro-injecteur comme suit, Une pression de maintien de 20 livres par pouce carré ou PSI, une pression d’éjection de 15 PSIA, une plage de déclenchement de 100 millisecondes et une valeur de période de 1,9, ce qui correspond à 10,9 millisecondes. Préparez 20 millilitres de 1,5 % d’aros fondus dans un XPBS et versez-le dans une boîte de Pétri de 10 centimètres.

Placez ensuite un moule d’injection rainuré dans les aros chauds pour former des sillons dans le gel durci afin d’anesthésier les larves. Placez-les dans 100 millilitres d’eau d’aquarium avec 20 milligrammes par litre de trican. Une fois qu’elles ont cessé de répondre au toucher, utilisez une pipette pastorale en plastique pour transférer soigneusement la larve dans une rainure du moule aros humide de sorte que la face ventrale soit face à la paroi aros verticale de la rainure.

Placez la plaque aros sous le stéréomicroscope de manière à ce que le ventricule soit tourné vers l’opposé de l’aiguille d’injection. Ensuite, abaissez l’aiguille et insérez-la à environ un à deux micromètres dans le ventricule cardiaque. En prenant soin de ne pas l’insérer trop profondément.

Injectez ensuite une impulsion de trois nanolitres de solution Morpho dans le ventricule et le poids pour permettre le dégagement du cœur avant de répéter avec cinq autres impulsions après l’injection, retirez l’aiguille et placez-la dans une boîte de Pétri contenant un XPBS pour éviter le dessèchement. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert remplie de milieu E trois, transférez soigneusement les larves dans une boîte de Pétri contenant du milieu frais E trois pour assurer l’absorption et le maintien du morpho dans les cellules. Répétez les injections toutes les 12 à 24 heures pendant toute la durée de l’expérience pour évaluer les injections.

Après avoir anesthésié les poissons, placez-les sur une plaque d’aros plate humide recouverte de milieu E trois avant d’utiliser un stéréomicroscope à fond clair et à fluorescence pour les imager. Analysez les images pour la régénération à l’aide du logiciel gratuit Fiji Image J pour utiliser l’outil de traçage de lignes afin de déterminer la quantité de croissance régénérative qui s’est produite. Tout d’abord, calibrez les images en glissant et déposant un fichier dans la fenêtre principale des Fidji dans le menu principal.

Définissez l’échelle de toutes les images en cliquant sur analyser dans le menu déroulant. Cliquez sur définir l’échelle, puis activez l’option globale en cochant la case. Maintenant, faites glisser et déposez à nouveau l’image pour mesurer la quantité de croissance régénérative dans la barre d’outils.

Choisissez l’outil de sélection à main levée et encerclez la zone à mesurer. Enfin, appuyez sur Ctrl M.Cela ouvrira une nouvelle fenêtre de résultats montrant la valeur de la zone encerclée en pixels carrés. Comme on le voit ici, dans les minutes qui suivent l’injection, la solution morpho endo porter se distribue dans tout le système vasculaire dans différents tissus tels que le pli de la nageoire et le cerveau pendant au moins 12 heures ou plus.

Pour évaluer la régénération des structures distales des nageoires larvaires, les éléments suivants ont été enlevés, l’extrémité distale du pli de la nageoire et de la moelle épinière, l’absence de moelle distale, le muscle distal du tronc, qui n’est pas visible ici, et les cellules pigmentaires, qui sont difficiles à cibler par injection directe, mais semblent incorporer le morpho après des injections ventriculaires en série. Ainsi, cette méthode favorise relativement facilement l’administration de morpho à des tissus difficiles à cibler individuellement, et elle permet d’évaluer la fonction des gènes dans plusieurs tissus de la nageoire régénératrice à la fois. Pour analyser l’importance de gènes spécifiques impliqués dans la régénération, la nageoire du dorloteur larvaire est partiellement amputée et tous les tissus qui ont incorporé le morpho sont réséqués.

Le pli de la nageoire larvaire régénère sa structure quelques jours après l’amputation, comme démontré. Ici, morpho cible les gènes nécessaires à la régénération, perturbe la réponse de régénération par rapport à l’inin injecté et déséquilibre morpho contrôle les contrôles après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération pour explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans la régénération du poisson zèbre Fin.