Name: Imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation Diluée-crâne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Apprenez l'imagerie chronique du cortex visuel chez la souris en utilisant une préparation à crâne aminci. Cette méthode permet d'observer la dynamique des épines dendritiques et la plasticité corticale in vivo.

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Ce travail a été soutenu par le Prix Carrière Burroughs Wellcome dans les sciences biomédicales (AKM), La Fondation de recherche sur Whitehall Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM), et une IEN financé, formation Vision Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Pour visualiser les neurones dans le cerveau intact en utilisant microscopie à deux photons, une préparation où les neurones sont étiquetées avec des marqueurs fluorescents sont utilisés. Dans les expériences présentées ici, nous utilisons la ligne de la GFP-M de souris transgéniques dont les étiquettes couche 5 cellules pyramidales 1. Couche 5 cellules pyramidales de projet dans le processus dendritiques couches superficielles, permettant la visualisation des dendrites et des épines dendritiques jusqu'à une profondeur de 300 um en dessous du niveau de la pie. Une autre approche consiste à marquer les cellules en utilisant des marqueurs viraux (voir Lowery et al., Soumis à Zeus). </li><li> Stériliser l'espace de travail en utilisant 70% d'éthanol et d'outils autoclave pour la chirurgie aseptique. Couvrir la surface avec exploitation pansement propre. </li><li> Anesthetize souris avec un cocktail de fentanyl (fentanyl 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) suivie d'une dose quart de Avertin (0,0075 mg / ml) en utilisant IACUC procédures approuvées. Prétraitez souris avec l'analgésique, la buprénorphine (0,5 mg / kg) administré par voie sous cutanée (SQ). Surveiller le niveau du plan d'anesthésie par réaction des tests à la queue / tep pincement. </li><li> Maintenir les animaux à 37,5 ° C en utilisant couverture chauffante avec thermomètre rectal ci-joint. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter les yeux de se dessécher. Capuche avec les yeux petite feuille de papier pour protéger les yeux de la source lumineuse pendant la chirurgie. </li><li> Avec des ciseaux, enlever les poils de l'arrière de la tête (derrière les oreilles) pour les yeux. </li><li> Nettoyez le dessus de la tête de l'animal avec l'application séquentielle de l'éthanol à 70%, suivi par le maquis et la solution de bétadine bétadine. </li><li> Faire une incision coupe en L derrière les oreilles et le long soit le côté droit ou gauche de la ligne médiane (en fonction de l'hémisphère dans lequel seront imagés) pour les yeux. Repliez la peau sur et loin du site de la chirurgie. Ne retirez pas la peau comme la peau sera suturé après la séance d'imagerie. </li><li> En utilisant des pinces fines tirez doucement la peau et loin de votre zone d'intérêt. </li><li> Doucement gratter le périoste de la zone exposée du crâne avec une pince ou une lame de nettoyage de microchirurgie. En utilisant un coton-tige, appliquez une petite quantité de chlorure ferrique 10% sur le crâne de sécher complètement la membrane du périoste et de s'assurer qu'il a été complètement supprimé. Il est important que le crâne est complètement sèche pour assurer adhérant correcte de la colle (voir 11). En utilisant une pince ou une lame de microchirurgie, doucement gratter la membrane du périoste séché. </li><li> Appliquer une fine couche de colle cyanoacrylate autour de la fenêtre d'imagerie de la plaque de tête en acier inoxydable (voir figure 1) et y apposer la plaque sur le crâne. </li><li> Utilisation de la fin de bois d'un bâton de coton-tige, appliquer la colle pour les coutures à l'intérieur de la fenêtre de l'imagerie; en veillant à combler toutes les lacunes entre la plaque d'imagerie et de la courbure du crâne. </li><li> Déposer une goutte d'accélérateur colle dans la fenêtre. Vite essuyer accélérateur de l'excès de colle avec un coton-tige ou Kim essuyer. La colle doit être complètement solidifié avant de percer. </li><li> Commencez à éclaircir le crâne dans la fenêtre d'imagerie utilisant une fraise de dentiste muni d'une bavure inox 0,7 mm d'acier. De forage en alternance avec l'application occasionnelle d'une solution saline stérile à 0,9% pour éviter de générer trop de chaleur sur le crâne. </li><li> Mince une fenêtre 4x4 mm sur le crâne à l'aide de petits coups sur toute la surface du crâne avec la fraise de dentiste. Test de la minceur du crâne avec une pince extrémité émoussée. La surface du crâne sera tiret légèrement avec une légère pression. L'épaisseur du crâne optimale pour l'imagerie se situe entre 10 et 30 um. </li><li> Lorsque le crâne est mince et la fenêtre nettoyé de tous les débris, placez saline sur le crâne. Photographie de la fenêtre d'imagerie avec une caméra numérique montée sur un microscope à dissection. Photographie et de l'utilisation de la vascularisation du cerveau vous aideront à localiser la position de placer la plaque d'imagerie pour les sessions ultérieures imagerie. </li><li> Transports à l'animal de la plate-forme 2-photons. L'animal doit rester sur la couverture chauffante (avec une sonde rectale) lors de la session d'imagerie complet. Remarque: bien que sous sédation, la température de l'animal centrale du corps va fluctuer considérablement en l'absence d'une unité de chaleur résultant de lésions corticales ou éventuellement la mort. </li><li> Un microscope à deux photons d'un laser Mai Tai, une pompe à l'état solide pour 10W de puissance maximale et une modification Olympus Fluoview confocale appareil est utilisé. Le système est optimisé pour l'imagerie des tissus profonds et des détecteurs externes sont installés le plus près de l'objectif que possible pour permettre la détection de la fluorescence maximale à partir du cerveau. Un Olympus FL LUMPlan / IR objectif 20X/0.95NA est utilisé. Saline à 0,9% est utilisé lors d'imagerie pour la submersion objectif. </li><li> L'utilisation de ce microscope, et faible zoom numérique (x1) d'identifier une zone contenant des neurones vives étiquetés. </li><li> L'utilisation d'un appareil photo numérique apposée sur l'oculaire de microscope, de prendre une photographie de la zone d'imagerie. Alternativement, esquisser le schéma vasculaire artérielle. Cela est nécessaire pour retourner vers l'emplacement d'imagerie mêmes à un point du temps ultérieur. </li><li> Procurez-vous une pile faible grossissement (objectif x20, 512x512 pixels; étape 5 um) à travers toute l'étendue visible du cerveau (en général couvrant ~ 200 um) montrant l'étendue des ramifications dendritiques. Remarque: cette image faible grossissement sera utilisée pour localiser la zone d'imagerie à des moments ultérieurs que les deux vaisseaux sanguins et des dendrites maintenir leur structure chez les animaux jeunes et adultes. </li><li> En utilisant un logiciel d'imagerie (Fluoview, v. 5.0, FV300), augmenter le grossissement numérique 8 fois. Réglez la coordonnées X, Y (pan coordonnées) si nécessaire et de recueillir une pile fort grossissement qui montrera détaillée morphologie dendritique, y compris les lieux et la structure des épines dendritiques. Prenez des notes détaillées sur chaque collection pile, c'est à dire pan coordonnées, la gamme de la collection, la taille z-étape et le nombre d'étapes dans votre pile. Ces notes seront utilisées lors du retour à cette dendrite ou axone à un point du temps ultérieur. </li><li> Suite à l'imagerie, enlever la plaque de tête en douceur la séparation plaque de surface du crâne. En utilisant des pinces, enlever toute la colle résiduelle sur le crâne et essuyez la surface du crâne avec une solution saline stérile à 0,9%. Suture de la peau sur le crâne ensemble en utilisant # 6 fil de suture. Essuyez la zone avec de l'éthanol à 70%. Pour soulager la douleur lors de récupération post-opératoire, administrer 0,1 analgésiques buprénorphine mg / kg, la SQ. </li><li> Placez animal en cage propre sous une lampe chauffante jusqu'à ce qu'elle se réveille et est mobile. Retour à la cage des animaux d'origine. </li><li> Pour les animaux réimager à un point de temps plus tard (nos points imagerie en temps peut être n'importe où à partir de 2 jours à plusieurs mois d'intervalle), retirer des points ou la réouverture de la peau sur la tête en utilisant des méthodes d'asepsie comme ci-dessus. Utiliser l'image numérique du cerveau vasculaire (pris à la date première chirurgie) pour localiser l'emplacement d'imagerie original. Réapposer plaque frontale en acier inoxydable (étapes 10-12). Utilisez une lame mince de microchirurgie pour doucement l'écart tous les os qui pourrait avoir re-développé entre les points de l'imagerie en temps. Si nécessaire, diluer avec fraise de dentiste. Fenêtre d'imagerie exempt de débris et d'appliquer une goutte de solution saline stérile à 0,9%. </li><li> Carry animal à deux photons de microscope et de localiser Imagerie d'origine. Utilisez la photographie numérique prises pendant la session d'imagerie première demande d'aide. </li><li> Ouvrez le programme Fluoview et ouvrir l'image grossissement original faible. Apposer une feuille de transparence à l'écran de l'ordinateur et esquisser le profil sanguin majeur navire utilisant un stylo transparence. </li><li> Ouvrez l'image en direct et de réaligner la vascularisation artérielle au schéma esquissé sur le film transparent. </li><li> Pour l'réimager 8x zoom dans les structures, ouvrent la pile désirée recueillies auprès de la séance d'imagerie précédent. Esquisse de la structure (ie axonale, dendritiques, cellules gliales) sur un film transparent, apposée sur l'écran d'ordinateur. </li><li> Zoom 8x à partir de l'image en direct et mettre la casserole coordonnées pour les premiers paramètres d'imagerie par jour. Selon la précision de l'alignement de l'emplacement à faible grossissement, il peut être aussi nécessaire de régler l'angle de l'image légèrement. Une fois la structure désirée est trouvée, correspondent à la structure de votre modèle esquissé un grossissement élevé. Recueillir le z-stack avec la taille de pas identiques et le nombre de Z-stack images pour une analyse ultérieure. </li><li> Répétez les étapes 29 et 30 jusqu'à ce que toutes les images à fort grossissement sont re-collectées. </li><li> Lorsque l'imagerie est terminée, répétez les étapes 22-24. Re-imagerie peut être répétée jusqu'à 2 points de temps séparés. </li><li> Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par le Vivarium et la division de médecine des animaux de laboratoire de l'Université de Rochester School of Medicine &amp; Dentistry, en pleine accréditation par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins des animaux de laboratoire, International (AAALAC) et sont en conformité avec la loi d'Etat, une loi fédérale et la politique des NIH. </li></ol> Les résultats représentatifs Dans la GFP-M souris exprimant, un sous-ensemble de la couche 5 cellules pyramidales et correspondant processus dendritiques peuvent être facilement visualisés en utilisant 2-photons microscopie à balayage laser (2PLSM) 1. Ici, nous avons démontré une préparation éclaircis-crâne dans lequel le crâne sur l'emplacement désiré imagerie est amincie à ~ 10-30 um. Effectuée correctement, notre protocole nous a permis de visualiser clairement les dendrites et les épines corticale dans le cortex visuel intact pour l'analyse aiguë ou chronique (figure 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Tête de la coutume et la plaque de base (A). Vue du haut de la tête fait la coutume et la plaque de base utilisés pour la préparation chirurgie amincie crâne. Vue latérale (B) du sur-mesure tête et la plaque de base. (C, D) schéma détaillé et l'image de la plaque de tête. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> in vivo dans le cortex visuel d'un transgéniques GFP-M souris en utilisant la microscopie à deux photons. L'image est une projection de l'image unique obtenus tous les 5 um de la pie-mère à une profondeur finale de 175 um. La zone encadrée en A représente la région agrandie en (B) et (C) imagé au jour 0 (J0) et quatre jours plus tard (D4). (D, E) plus fort grossissement de la branche dendritiques coffret en B et C démontrant épines stable (têtes de flèche blanche), a perdu épines rétracter / (têtes de flèche rouge) et des épines de nouvelles (têtes de flèche verte). Barres d'échelle = A. 200 um, B, C. 20 um, D, E. 5 um.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

D&#39;imagerie utilisant chronique microscopie à deux photons est de plus en plus populaire d&#39;une technique pour étudier les changements morphologiques déclenchée pendant 2-5 plasticité. Ici nous démontrons une préparation éclaircis-crâne à suivre identifié épines dendritiques dans le cerveau de souris intactes les jours d&#39;imagerie. Dans ce protocole, le crâne est laissé intact, causant des dégâts minimes au cortex et résultant en des niveaux très bas de la neuroinflammation, qui peuvent altérer les f...

<table><tbody><tr><td>Citrate de fentanyl</td><td></td><td>En interne</td><td></td><td>Cocktail de fentanyl : Cocktail anesthésique ;&lt;br/&gt;Dose IP : 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentration finale du cocktail : 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de médétomidine</td><td></td><td>Interne</td><td></td><td>Cocktail de fentanyl : cocktail anesthésique ;&lt;br/&gt;Dose IP : 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentration finale du cocktail : 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Midazolam HCl</td><td></td><td>En interne</td><td></td><td>Cocktail de fentanyl : Cocktail anesthésique ;&lt;br/&gt;Dose IP : 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentration finale du cocktail : 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;thanol </td><td></td><td></td><td></td><td>Cocktail d'Avertine : anesthésique ;&lt;br/&gt;Dose IP : 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentration finale du cocktail : 1 %</td></tr><tr><td>2-méthyl-2-butanol (concentration finale : 0,775 %)</td><td></td><td></td><td></td><td>Cocktail Avertin : anesthésique ;&lt;br/&gt;Dose IP : 0,0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Concentration finale du cocktail : 0,775 %</td></tr><tr><td>Système de contrôle de température TC-1000 pour souris</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>TC-1000 Souris</td><td>Régulation de la température corporelle</td></tr><tr><td>Toberadex</td><td></td><td>Interne</td><td></td><td>Pommade ophtalmique</td></tr><tr><td>Chlorure de fer à 10 %</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>Préparation au crâne mince</td></tr><tr><td>Lame microchirurgicale</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>Préparation au crâne mince</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 46551</td><td>Préparation au crâne aminci</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 40140</td><td>Préparation à crâne mince</td></tr><tr><td>Accélérateur de colle Zip Kicker</td><td></td><td>Pacer Technology</td><td>PT-29</td><td>Préparation au crâne mince</td></tr><tr><td>Microforets en acier, fraises de 0,7 mm de diamètre de pointe</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>Préparation au crâne mince</td></tr><tr><td>Microboîtier de contrôle de couple et pièce à main Tech2000</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td>Préparation au crâne mince</td></tr><tr><td>#6-0 (0,7 métrique) suture en soie</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>Taper C-1</td></tr><tr><td>Forceps pour pansement oculaire, 10 cm, largeur de pointe 0,5 mm, courbé</td><td>Outils chirurgicaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Bonn extra fins, 8,5 cm, extrémité droite, lame de coupe de 13 mm</td><td>Outils chirurgicaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinces à motif standard, droites, extrémité 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cm</td><td>Outils chirurgicaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation diluée-crâne

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

L&#39;imagerie in vivo en utilisant microscopie à deux photons laser à balayage (2PLSM) permet l&#39;étude des cellules vivantes et des processus neuronaux dans le cerveau intact. La technique présentée ici permet l&#39;imagerie de la même zone du cerveau à différents moments (chronique d&#39;imagerie) avec une résolution microscopique, permettant le suivi des épines dendritiques qui sont les petites structures qui représentent la majorité des sites de post-synaptiques excitateurs dans le SNC. La capacité à résoudre clairement fines structures corticales plus de points plusieurs fois a de nombreux avantages, en particulier dans l&#39;étude de la plasticité du cerveau dans lequel les changements morphologiques au niveau des synapses et le remodelage du circuit peut aider à expliquer les mécanismes sous-jacents. Dans ce matériel vidéo et complémentaires, nous montrons un protocole pour l&#39;imagerie in vivo chroniques du cerveau intactes en utilisant une préparation amincie crâne. La préparation éclaircis-crâne est une approche minimalement invasive, ce qui évite les dommages potentiels à la mère et / ou du cortex, réduisant ainsi le déclenchement d&#39;une réponse inflammatoire. Lorsque ce protocole est réalisé correctement, il est possible de bien surveiller les changements dans les caractéristiques des épines dendritiques dans le cerveau intact sur une période de temps prolongée.

Dans ce matériel vidéo et complémentaires, nous montrons un protocole pour les maladies chroniques<em&gt; In vivo</emImagerie&gt; du cerveau intact en utilisant une préparation amincie crâne.

Imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation Diluée-crâne

L'imagerie in vivo par microscopie laser à balayage biphotonique (2PLSM) permet l'étude de cellules vivantes et de prolongements neuronaux dans le cerveau intact. Le ...

Les épines dendritiques sont des prolongements membranaires issus de la dendrite d'un neurone et qui reçoivent les entrées synaptiques. L'allongement, la réduction, l'apparition ou la disparition des épines surviennent en réponse à des modifications de la fonction du réseau neuronal résultant de schémas spécifiques d'activité neuronale. Ce phénomène est connu sous le nom de plasticité corticale, permettant d'observer les changements morphologiques des épines dendritiques.Chez des animaux vivants, une plaque d'imagerie est fixée sur le crâne d'une souris. Une zone du crâne est amincie chirurgicalement et des images sont prises à faible et forte augmentation. Ces zones sont ensuite réimager à des points temporels ultérieurs.Les résultats obtenus montrent que la morphologie des épines dendritiques peut être clairement visualisée à l'aide d'une préparation au crâne mince à plusieurs points temporels. Et que la morphologie des épines est hautement plastique, présentant des changements structurels ainsi que l'apparition et la disparition d'épines dendritiques. Bonjour, je suis Emily Kelly au laboratoire d'Anaya Maka, du Département de neurobiologie et d'anatomie de l'Université de Rochester.Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure d'imagerie chronique du cortex vial de la souris après une préparation appelée crânienne. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le renouvellement des épines dendritiques. Commençons donc.Commencez la procédure en stérilisant les outils destinés à la chirurgie aseptique. Ensuite, stérilisez l'espace de travail à l'aide d'éthanol à 70 % et recouvrez la surface opératoire d'un champ stérile. Surveillez la profondeur de l'anesthésie chez une souris anesthésiée avec un cocktail contenant du fentanyl en testant sa réponse à une pincée du orteil ; la souris illustrée ici est une souris transgénique A-G-F-P-M dans laquelle la GFP est exprimée.Dans les cellules paramétales de la couche cinq qui projettent des prolongements dendritiques vers les couches superficielles. Pour maintenir une température corporelle de 37,5 degrés Celsius, placez l'animal sur une couverture chauffante et surveillez-le à l'aide d'un thermomètre rectal fixé. Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter qu'ils ne s'assèchent, en utilisant des ciseaux.Retirez les poils à l'arrière de la tête de la souris, de derrière les oreilles jusqu'aux yeux. Ensuite, nettoyez le sommet du crâne de l'animal avec une application d'éthanol à 70 %, suivie d'un brossage au Bétadine et d'une solution de Bétadine. Pratiquez une incision en forme de LCU derrière les oreilles et remontez le long du côté droit ou gauche de la ligne médiane, selon l'hémisphère qui sera imagé jusqu'aux yeux, puis repliez la peau par-dessus et loin du site chirurgical.Ne pas retirer la peau, car elle sera suturée ultérieurement à l’aide de pinces fines. Tirer doucement la peau vers le haut et loin de la zone d’intérêt. À l’aide de pinces propres, gratter délicatement le périoste de la zone exposée du crâne.Appliquer une petite quantité de chlorure ferrique à 10 % sur le crâne afin de sécher complètement la membrane périostée et s'assurer qu'elle a été entièrement retirée. Il est important que le crâne soit parfaitement sec. Pour garantir une bonne adhérence de la colle, gratter délicatement la membrane périostée séchée à l’aide d’une lame de microchirurgie.Ensuite, appliquez une fine couche de colle acrylique Sano autour de la fenêtre d'imagerie de la plaque crânienne en acier inoxydable et fixez la plaque sur le crâne. À l’aide de l’extrémité en bois d’un coton-tige, appliquez la colle sur les joints intérieurs de la fenêtre d’imagerie, en veillant à combler tous les espaces entre la plaque d’imagerie et la courbure du crâne. Déposez une goutte d’accélérateur de colle dans la fenêtre.Ensuite, essuyez rapidement l'excès. Laissez sécher la colle une fois qu'elle est complètement sèche. À l'aide d'une fraise dentaire équipée d'une fraise en acier inoxydable de 0,7 millimètre, commencez à amincir le crâne dans la fenêtre d'imagerie.Alternez le perçage avec une application occasionnelle de sérum physiologique stérile à 0,9 % afin d'éviter de produire trop de chaleur sur le crâne. Amincissez une fenêtre de quatre millimètres sur quatre millimètres sur le crâne en effectuant de petits mouvements sur la surface osseuse.Avec le foret dentaire. Vérifiez la finesse du crâne à l’aide de pinces à extrémité émoussée. La surface du crâne s’enfoncera légèrement sous une pression douce.L'épaisseur optimale du crâne pour l'imagerie se situe entre 10 et 30 micromètres. Une fois le crâne aminci, nettoyer la fenêtre de toute débris et appliquer du sérum physiologique sur le crâne. Prendre une photographie de la fenêtre d'imagerie à l'aide d'un appareil photo numérique monté sur une loupe binoculaire.Le réseau vasculaire cérébral visible sur cette photographie aidera à localiser la position où placer la plaque d'imagerie pour les séances d'imagerie ultérieures. Transportez l'animal vers le dispositif d'imagerie à deux photons. L'animal doit rester sur la couverture chauffante et sa température corporelle doit être surveillée en continu pendant toute la durée de la séance d'imagerie.Un microscope à deux photons équipé d'un laser mi tai. Une pompe à l'état solide de 10 watts pour une puissance maximale et une unité confocale Olympus Flow View modifiée sont utilisées. Le système est optimisé pour l'imagerie en profondeur des tissus et des détecteurs externes sont installés aussi près que possible de l'objectif afin de permettre une détection maximale de la fluorescence provenant du cerveau ; ajoutez une goutte de solution saline sur la fenêtre d'imagerie en utilisant un faible zoom numérique.Identifier une zone contenant des neurones fortement marqués à l’aide d’une caméra numérique fixée au microscope. Ensuite, prendre une photographie de la zone d’imagerie. Cette étape est nécessaire pour revenir ultérieurement au même emplacement d’imagerie à un moment donné ultérieur.Obtenir un empilement à faible grossissement couvrant toute l'étendue visible du cerveau, montrant l'ampleur de la ramification dendritique. Cet empilement servira à localiser la zone d'imagerie lors des points temporels ultérieurs, tant pour les vaisseaux sanguins que pour les dendrites. Conserver leur structure chez les animaux jeunes et adultes à l'aide d'un logiciel d'imagerie.Augmentez huit fois le grossissement numérique, ajustez les coordonnées XY si nécessaire, puis enregistrez un empilement à fort grossissement, qui montrera la morphologie dendritique détaillée, y compris l'emplacement et la structure des épines dendritiques. Prenez des notes détaillées pour chaque acquisition d'empilement, incluant les coordonnées de panoramique, la plage d'acquisition, la taille du pas en Z et le nombre de pas dans l'empilement. Ces notes seront utilisées lors du retour ultérieur vers cette dendrite ou cet axone à un moment ultérieur.Après l'imagerie, retirez la plaque crânienne en la séparant délicatement de la surface du crâne. À l'aide de pinces, éliminez toute colle résiduelle et essuyez le crâne avec du sérum physiologique stérile à 0,9 %.Refermer la peau au-dessus du crâne à l’aide d’un fil de suture n°6. Nettoyer la zone avec de l’éthanol à 70 % après la procédure d’imagerie. Placer l’animal dans une cage propre sous une lampe chauffante jusqu’à ce qu’il se réveille et retrouve sa mobilité.Ensuite, remettez l'animal dans sa cage d'origine pour imaginer à nouveau l'animal à un moment ultérieur, allant de deux jours à plusieurs mois plus tard, retirez les points de suture et rouvrez la peau au niveau de la tête. À l'aide de méthodes aseptiques, utilisez l'image numérique de la vascularisation cérébrale prise lors de la première chirurgie pour localiser l'emplacement d'imagerie d'origine. Puis, re-fixez la plaque crânienne comme précédemment.Utilisez une lame microchirurgicale pour éliminer délicatement tout os ayant pu repousser entre les points temporels d'imagerie, si nécessaire. Amincissez à l’aide d’un foret dentaire, nettoyez la fenêtre d’imagerie des débris et appliquez une goutte de solution saline stérile à 0,9 %. Transportez l’animal vers un microscope à deux photons et localisez la zone d’imagerie initiale à l’aide de l’image fluorescente numérique prise lors de la séance précédente.Démarrez le programme d'analyse d'écoulement. Ouvrez l'image initiale à faible grossissement, fixez une feuille de transparence sur l'écran de l'ordinateur et esquissez le réseau des principaux vaisseaux sanguins à l'aide d'un feutre pour rétroprojecteur. Ensuite, ouvrez l'image en direct et réalignez la vascularisation sanguine sur le schéma dessiné sur la feuille de transparence.Retirez la feuille transparente pour recapturer les images des huit structures agrandies. Ouvrez la pile souhaitée provenant de la précédente session d'imagerie. Dessinez la structure sur un film transparent fixé à l'écran de l'ordinateur.Zoomer huit fois à partir de l’image en direct et aligner l’image avec la transparence. Selon la précision de l’alignement de l’emplacement à faible grossissement, il peut être nécessaire d’ajuster légèrement l’angle de l’image, puis régler les coordonnées de panoramique aux paramètres d’imagerie du premier jour, incluant la taille du pas et le nombre d’images à acquérir. La réimagerie Zack peut être effectuée deux fois. Le nombre d’ouvertures du cuir chevelu doit être limité afin d’éviter de compromettre l’intégrité du crâne, ce qui entraînerait une résolution d’imagerie médiocre chez les souris exprimant GFP.Un sous-ensemble de cellules paramétales de la couche cinq et les processus dendritiques correspondants ont été visualisés à l’aide de la microscopie à balayage laser à deux photons in vivo ici ; des dendrites du cortex visuel marquées par la GFP sont montrées. Cette image est une projection d'une série d'images obtenues toutes les cinq micromètres depuis la PIA jusqu'à une profondeur finale de 175 micromètres. La région encadrée est montrée à un grossissement plus élevé ici au jour zéro, puis à nouveau au jour quatre ici, comparant des images agrandies d'une branche dendritique aux jours zéro et quatre.Ces images montrent des épines stables, indiquées par des têtes de flèches blanches, des épines rétractées, marquées par des têtes de flèches rouges, et de nouvelles épines, indiquées par des têtes de flèches vertes. Nous venons de vous montrer comment réaliser un imaging chronique en deux photons dans le cortex visuel de la souris à l’aide d’une préparation au crâne mince. Lors de cette procédure, il est important de prendre des précautions particulières lors de l’étape d’amincissement afin d’éviter tout dommage au crâne et à la dure-mère sous-jacente, ce qui entraînerait une mauvaise résolution d’imagerie, et de prendre des notes détaillées.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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