Imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation Diluée-crâne

Les épines dendritiques sont des protubérances membranaires de la dendrite d’un neurone qui reçoivent une entrée synaptique. L’allongement, le rétrécissement de l’apparence ou la disparition des épines se produisent en réponse à des changements dans la fonction du réseau neuronal qui résultent de modèles spécifiques d’activité neuronale. Ce phénomène est connu sous le nom de plasticité corticale pour observer les changements morphologiques des épines dendritiques.

Chez les animaux vivants, une plaque d’imagerie est fixée au crâne d’une souris. Une zone du crâne est amincie chirurgicalement et des images sont nécessaires à faible et fort grossissement. Les zones sont ensuite ré-imageées à des moments ultérieurs.

Les résultats obtenus montrent que la morphologie de l’épine dendritique peut être clairement visualisée à l’aide d’une préparation du crâne mince sur plusieurs points temporels. Et cette morphologie de l’épine est très plastique, montrant des changements dans la structure ainsi que l’apparition et la disparition d’épines dendritiques. Bonjour, je m’appelle Emily Kelly et je travaille dans le laboratoire d’Anaya Maka au Département de neurobiologie et d’anatomie de l’Université de Rochester.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer la procédure d’imagerie chronique du cortex fiole de souris à la suite d’une formation appelée préparation. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le renouvellement de l’épine dendritique. Alors commençons.

Commencez la procédure en stérilisant les outils pour la chirurgie aseptique. Ensuite, stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 % et recouvrez la surface de travail d’un pansement propre. Surveillez la profondeur de l’anesthésie chez une souris anesthésiée au cocktail de fentanyl en testant sa réponse à un pincement d’orteil la souris montrée ici est une souris transgénique A-G-F-P-M chez laquelle la GFP est exprimée.

Dans la couche cinq, des cellules paramétalliques qui projettent des processus dendritiques dans des couches superficielles. Pour maintenir une température corporelle de 37,5 degrés Celsius, placez l’animal sur une couverture chauffante et surveillez-le à l’aide d’un thermomètre rectal attaché. Appliquez ensuite une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter qu’ils ne se dessèchent à l’aide de ciseaux.

Retirez les cheveux de l’arrière de la tête de la souris de derrière les oreilles jusqu’aux yeux. Nettoyez ensuite le haut de la tête de l’animal avec une application d’éthanol à 70 %, suivie d’un gommage à la bétadine et d’une solution de bétadine. Faites une incision LCU derrière les oreilles et vers le haut le long du côté droit ou gauche de la ligne médiane, selon l’hémisphère qui sera imagé pour les yeux, pliez la peau et éloignez-vous du site de la chirurgie.

N’enlevez pas la peau car elle sera suturée plus tard à l’aide de pinces fines. Tirez doucement la peau vers le haut et éloignez-la de la zone d’intérêt. À l’aide d’une pince propre, grattez doucement le périoste de la zone exposée du crâne.

Appliquez une petite quantité de chlorure à 10 % sur le crâne pour sécher complètement la membrane du périoste et assurez-vous qu’elle a été complètement retirée. Il est important que le crâne soit complètement sec. Pour assurer une bonne adhérence de la colle, grattez doucement la membrane du périoste séchée à l’aide d’une lame microchirurgicale.

Ensuite, appliquez une fine couche de colle acrylique Sano autour de la fenêtre d’imagerie de la plaque de tête en acier inoxydable et fixez la plaque sur le crâne. Avec l’extrémité en bois d’un bâtonnet de coton-tige, appliquez de la colle sur les coutures intérieures de la fenêtre d’imagerie, en vous assurant de remplir tous les espaces entre la plaque d’imagerie et la courbure du crâne. Placez une goutte de l’accélérateur de colle dans la fenêtre.

Essuyez ensuite rapidement l’excédent. Laissez la colle sécher une fois que la colle est complètement sèche. À l’aide d’une fraise dentaire fixée avec une meule en acier inoxydable de 0,7 millimètre, commencez à amincir le crâne dans la fenêtre d’imagerie.

Alterner le forage avec l’application occasionnelle d’une solution saline stérile à 0,9 %. Pour éviter de générer trop de chaleur sur le crâne. Mincir une fenêtre de quatre millimètres sur quatre sur le crâne à l’aide de petits traits sur la surface du crâne.

Avec la fraise dentaire. Testez la finesse du crâne avec une pince à bout émoussé. La surface du crâne s’indentera légèrement avec une légère pression.

L’épaisseur optimale du crâne pour l’imagerie se situe entre 10 et 30 microns. Une fois le crâne aminci, nettoyez la fenêtre de tous les débris et placez une solution saline sur le crâne. Photographiez la fenêtre d’imagerie à l’aide d’un appareil photo numérique monté sur une lunette de dissection.

Le système vasculaire cérébral de cette photo aidera à localiser la position où placer la plaque d’imagerie pour les séances d’imagerie ultérieures. Transportez l’animal vers le banc à deux photons. L’animal doit rester sur la couverture chauffante et la température corporelle doit être surveillée en permanence tout au long de la séance d’imagerie.

Un microscope à deux photons avec un laser mi-tai. Une pompe à semi-conducteurs de 10 watts pour une puissance maximale et une unité confocale Olympus à vue d’écoulement modifiée sont utilisées. Le système est optimisé pour l’imagerie des tissus profonds et des détecteurs externes sont installés aussi près que possible de l’objectif pour permettre une détection maximale de la fluorescence du cerveau, ajouter une goutte de solution saline à la fenêtre d’imagerie à l’aide d’un zoom numérique faible.

Identifiez une zone contenant des neurones marqués de manière brillante à l’aide d’un appareil photo numérique fixé au microscope. Ips, prenez une photo de la zone d’imagerie. Cela est nécessaire pour revenir au même emplacement d’imagerie à un moment ultérieur.

Obtenez une pile à faible grossissement sur toute l’étendue visible du cerveau montrant l’étendue de la ramification dendritique. Cela sera utilisé pour localiser la zone d’imagerie à des moments ultérieurs sous forme de vaisseaux sanguins et de dendrites. Maintenir leur structure chez les animaux jeunes et adultes à l’aide d’un logiciel d’imagerie.

Multipliez par huit le grossissement numérique, ajustez les coordonnées XY si nécessaire et collectez une pile de grossissement élevé, qui montrera la morphologie dendritique détaillée, y compris l’emplacement et la structure des épines dendritiques. Prenez des notes détaillées concernant chaque collection de piles, y compris les coordonnées des panoramiques, la plage de collecte, la taille du pas Z et le nombre de pas dans la pile. Ces notes seront utilisées lors du retour à ce dendri ou à cet axone à un moment ultérieur.

Après l’imagerie, retirez la plaque de tête en la séparant doucement de la surface du crâne. À l’aide de forceps. Retirez tout résidu de colle et essuyez le crâne avec une solution saline stérile à 0,9 %.

Suturez la peau du crâne à l’aide du fil de suture numéro six. Essuyez la zone avec de l’éthanol à 70 % en suivant la procédure d’imagerie. Placez l’animal dans une cage propre sous une lampe chauffante jusqu’à ce qu’il se réveille et soit mobile.

Ensuite, retournez l’animal dans sa cage d’origine pour l’imager à nouveau à un moment ultérieur de deux jours à plusieurs mois plus tard, retirez les points de suture et rouvrez la peau de la tête. À l’aide de méthodes aseptiques, utilisez l’image numérique du système vasculaire cérébral prise lors de la première intervention chirurgicale pour localiser l’emplacement d’origine de l’imagerie. Ensuite, refixez la plaque de tête comme précédemment.

Utilisez une lame microchirurgicale pour amincir doucement tout os qui aurait pu repousser entre les points de temps d’imagerie si nécessaire. Diluez à l’aide d’une fraise dentaire, débarrassez la fenêtre d’imagerie des débris et appliquez une goutte de solution saline stérile à 0,9 %. Transportez l’animal vers un microscope à deux photons et localisez la zone d’imagerie d’origine à l’aide de l’image fluorescente numérique prise lors de la séance précédente.

Démarrez le programme d’affichage de flux. Ouvrez l’image originale à faible grossissement, fixez une feuille de transparence sur l’écran de l’ordinateur et esquissez le motif des principaux vaisseaux sanguins à l’aide d’un stylo transparent. Ensuite, ouvrez l’image en direct et réalignez le système vasculaire sanguin sur le motif esquissé sur le film transparent.

Supprimez la transparence pour recréer l’image des structures agrandies huit fois. Ouvrez la pile collectée lors de la session d’imagerie précédente. Esquissez la structure sur un film transparent fixé à l’écran de l’ordinateur.

Zoomez huit fois sur l’image en direct et alignez l’image sur la transparence. En fonction de la précision de l’alignement de l’emplacement à faible grossissement, il peut être nécessaire d’ajuster également l’angle de l’image, de régler légèrement les coordonnées du panoramique sur les paramètres d’imagerie du premier jour, y compris la taille du pas et le nombre d’images collectées, la réimagerie Zack peut être effectuée deux fois. Le nombre de fois que le cuir chevelu est ouvert doit être limité pour éviter de perturber l’intégrité du crâne, ce qui entraînera une mauvaise résolution d’imagerie chez les souris exprimant la GFPM.

Un sous-ensemble de cellules paramétalliques de couche cinq et les processus dendritiques correspondants ont été visualisés à l’aide de la microscopie à balayage laser à deux photons in vivo, ici, des dendrites du cortex visuel marquées à la GFP sont montrées. Cette image est une projection d’une seule image obtenue tous les cinq microns à partir du PIA jusqu’à une profondeur finale de 175 microns. La région encadrée est montrée à un grossissement plus élevé ici le jour zéro, et à nouveau le quatrième jour ici, un grossissement plus élevé d’une image de branche dendritique du jour zéro et du jour quatre comparé.

Ces images montrent des épines stables indiquées par les pointes de flèches blanches perdues et rétractables, qui sont marquées par des pointes de flèche rouges et de nouvelles épines indiquées par la pointe de flèche verte. Nous venons de vous montrer comment effectuer une imagerie chronique à deux photons dans le cortex visuel de la souris à l’aide d’une préparation de crâne mince. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre des précautions particulières pendant le processus d’amincissement pour éviter d’endommager le crâne et la dure-mère sous-jacente, car cela entraînera une mauvaise résolution d’imagerie et prendra des notes détaillées.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.