Deux-Photon In vivo Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

L’objectif global de cette procédure est de permettre l’imagerie transcrânienne, une structure synaptique marquée par fluorescence dans le cortex de la souris vivante par microscopie à deux photons. La première étape après l’anesthésie de la souris consiste à effectuer une préparation du crâne aminci. Ensuite, la tête de la souris est immobilisée à l’aide d’une plaque de maintien sur mesure.

Ensuite, des piles d’images sont acquises à travers le crâne aminci à l’aide de la microscopie à deux photons. En fin de compte, le déménagement et l’imagerie. La région précédemment imagée a permis de suivre la dynamique des épines dendritiques sur différentes périodes de temps dans diverses conditions.

Pour vous préparer à la chirurgie, anesthésiez une souris avec de la kétamine et de la xylazine et effectuez un pincement des orteils pour assurer une anesthésie complète. Placez ensuite la souris sur un coussin chauffant et utilisez une lame de rasoir pour raser la tête. Essuyez la peau avec des tampons d’alcool alternés pour stériliser la zone rasée et enlever toute coupure de poils résiduelle.

Appliquez également doucement une pommade pour les yeux sur les deux yeux. Ensuite, faites une incision droite le long de la ligne médiane du cuir chevelu et déplacez la peau latéralement vers les bords du crâne. Retirez ensuite le tissu conjonctif attaché au crâne pour commencer la préparation du crâne aminci.

Tout d’abord, identifiez la région d’imagerie souhaitée en fonction de son emplacement relatif par rapport à la ligne médiane et à la bgma. Ensuite, humidifiez le crâne avec une solution saline pour observer le système vasculaire afin d’éviter d’amincir le crâne dans une zone avec de gros vaisseaux sanguins car ils bloquent la pénétration de la lumière et brouillent les structures de l’image. Une fois qu’une zone de 0,5 à un millimètre de diamètre a été sélectionnée, utilisez une micro-perceuse à grande vitesse pour amincir une région circulaire du crâne.

Déplacez la perceuse parallèlement à la surface du crâne plutôt que de la tenir contre le crâne et d’appuyer pour éviter les dommages causés par la surchauffe. Évitez tout contact prolongé entre le foret et le foret crânien jusqu’à ce que la couche osseuse compacte externe et la couche osseuse spongieuse moyenne soient retirées. Ensuite, utilisez une lame microchirurgicale maintenue à environ 45 degrés pour amincir la couche osseuse compacte interne au centre de la région amincie du foret.

Grattez le crâne sans appuyer contre le crâne jusqu’à l’obtention d’une région uniformément amincie de 200 à 300 micromètres de diamètre et d’une épaisseur d’environ 20 à 30 micromètres. Une fois que le crâne est suffisamment aminci, retirez soigneusement les débris osseux. L’étape suivante consiste à fixer la plaque de tête, qui est fabriquée à partir de lames de rasoir avec des bords tranchants recouverts de rubans.

Commencez par placer une petite goutte de colle cyanoacrylate sur chaque bord de l’ouverture centrale de la plaque de tête. Puis centrer la plaque de tête sur la région amincie. Tenez-le fermement contre le crâne.

Maintenant, tirez doucement la peau des côtés du crâne vers les bords de l’ouverture centrale de la plaque de tête. Maintenez la plaque de tête en place pendant une à deux minutes. Attendez ensuite encore huit à neuf minutes jusqu’à ce que la plaque de tête soit bien fixée au crâne.

Après 10 minutes, placez la plaque de tête sur les deux blocs latéraux de la plaque de maintien. Ensuite, serrez les vis sur les bords de la plaque de tête pour immobiliser la souris sur la plaque de maintien. Regardez la tête de la souris à travers un microscope à dissection tout en rembourrant doucement le dos de la souris pour vous assurer que la tête est correctement immobilisée.

Ensuite, rincez le crâne exposé avec une solution saline pour enlever toute colle non polymérisée afin de déplacer la région précédemment imagée. Lors des séances d’imagerie suivantes, prenez une photo de la vascularisation de la région amincie du crâne exposé, qui est désignée comme la première carte. Placez ensuite la souris sous le microscope d’imagerie et localisez la zone amincie sous l’objectif à air 10x.

À l’aide de l’épifluorescence, déplacez la zone la plus fine vers le centre de la vue. Ajoutez maintenant une goutte de solution saline en haut du crâne et passez à l’objectif 60x. Choisissez une région où les épines dendritiques individuelles sont clairement visualisées le long des dendrites.

Identifiez et étiquetez la région correspondante sur la première carte en comparant la vascularisation entre la vue fluorescente épiscopale et la photo vasculaire. Ensuite, réglez la longueur d’onde du laser à deux photons en fonction des quatre fluoros. Ensuite, à l’aide de l’objectif 60x, acquérez des piles d’images avec deux pas micrométriques le long de l’axe Z, couvrant une zone d’environ 200 micromètres sur 200 micromètres.

Celle-ci est désignée comme la deuxième carte et est utilisée pour déplacer le segment dendritique de l’image lors des sessions d’imagerie ultérieures. Acquérez maintenant neuf piles d’images sur la deuxième carte à l’aide d’un zoom numérique trois fois. Chaque pile d’images couvre une zone d’environ 70 micromètres sur 70 micromètres avec des pas de 0,7 micromètre le long de l’axe Z.

Après l’imagerie, détachez doucement la plaque de tête du crâne. Ensuite, utilisez une lame microchirurgicale pour retirer la colle restante du crâne. Ensuite, rincez le crâne et la peau avec une solution saline plusieurs fois et suturez le cuir chevelu avec des sutures chirurgicales stériles.

Pendant la convalescence, gardez l’animal sur un coussin chauffant dans une cage séparée et administrez l’analgésique à base de buprénorphine par voie sous-cutanée pour la douleur postopératoire. Une fois complètement rétabli, retournez l’animal à la jauge d’origine. Pour réimager les dendrites un autre jour, anesthésez l’animal et exposez le crâne. Comme précédemment, répétez l’immobilisation de la tête en montant la plaque de tête et en la fixant à la plaque de maintien.

Localisez ensuite la région précédemment imagée en comparant le motif vasculaire à la carte un et le motif de la branche dendritique à la carte deux. Si une nouvelle imagerie est effectuée dans la semaine, la fine couche d’os nouvellement développée peut être retirée avec une lame microchirurgicale. Si la réimagerie est effectuée après plus d’une semaine, utilisez d’abord la micro-perceuse, puis la lame microchirurgicale pour amincir le crâne.

Ajustez maintenant la position et l’orientation sous le microscope à deux photons pour obtenir des piles d’images qui correspondent aux piles d’images précédemment prises. Après avoir acquis des images, laissez la souris récupérer et retourner dans sa cage comme auparavant, et une image du motif vasculaire entourant la fine zone du crâne désignée comme carte un est utilisée pour référencer toutes les séances d’imagerie ultérieures. La boîte noire indique la région où deux images de photons in vivo ont été acquises.

Cette image de branches dendritiques dans le cortex moteur d’une souris âgée d’un mois est désignée par la carte deux. La boîte blanche montre le segment dendritique sélectionné pour l’imagerie. Au fil du temps, une imagerie à deux photons a été réalisée sur le même segment dendritique le jour zéro, le jour deux, le jour quatre et le jour huit.

Épines nouvellement formées. C’est-à-dire que les épines qui n’étaient pas présentes lors de la séance d’imagerie précédente sont montrées par les flèches. Les Philip Podia sont indiqués par des étoiles une fois maîtrisés.

Cette technique peut être réalisée en une à deux heures si elle est correctement exécutée.