Isolement axoplasme du nerf sciatique du rat

L’objectif global de cette procédure est d’isoler le cytoplasme axonal pur ou l’ectoplasme du nerf périphérique. Ceci est accompli en disséquant d’abord le nerf sciatique. La deuxième étape de la procédure consiste à retirer le tissu conjonctif du nerf et à séparer les plaques.

La troisième étape de la procédure est l’incubation de courts segments de cellules nerveuses dans un milieu hypotonique. La dernière étape de la procédure est l’incubation en solution isotonique, la centrifugation et l’opsm milian. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent un degré élevé d’enrichissement des composants axonaux par l’analyse par transfert Western.

Bonjour, je m’appelle Elle, et je peux Rosenbaum. Nous sommes du laboratoire du professeur Mike F Labor du Département de chimie biologique basé à l’Institut des sciences. Aujourd’hui, nous allons représenter une nouvelle technique de mesure Oxy Opat.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la compression manuelle OIS du nerf périphérique. C’est-à-dire que cette procédure réduit la contamination du sérum et glos atteint le contenu axonal. Nous avons utilisé cette nouvelle technique pour la méthylation des OP PLA afin d’explorer la rétrosignalisation basée sur D après une lésion du nerf sciatique.

Alors commençons. Placez l’un des deux rats wistar euthanasiés âgés de huit à 10 semaines sur le côté sur un tapis de dissection pour une approche directe de la partie distale du nerf sciatique. Rasez la peau à mi-cuisse et remplacez-la soigneusement avec de l’éthanol à 70 %.

Utilisez des ciseaux pour couper la peau de la cuisse. Coupez soigneusement la graisse et le tissu conjonctif entre les biceps fémoraux et les muscles fessiers superficiels. Utilisez une pince pour soulever la région exposée du nerf sciatique et l’enlever.

La section retirée mesurera environ 1,5 centimètre de long. Transférez le nerf dans 500 microlitres de PBS 2X glacé avec inhibiteurs de protéase dans un micro tube à centrifuger. Gardez le tube sur de la glace.

Répétez la procédure de dissection de l’autre côté du rat et des deux côtés d’un deuxième rat. Grattez le fond d’une boîte de Pétri avec une pipette à pâte et remplissez-la de deux millilitres à température ambiante. Point deux X PB s avec des inhibiteurs de protéase.

Transférez un seul nerf dans la boîte sous le microscope de dissection. À l’aide d’une pince fine, retirez l’épi nearium du nerf en le retirant et en le jetant, en laissant les faciles dans le plat. Séparez soigneusement les faciles les uns des autres et du fond du plat.

Les fales individuelles deviendront troubles et flotteront à la surface de la solution. Transférez immédiatement les fales séparés dans un microtube de centrifugation contenant 500 microlitres de 0,2 X PB s avec des inhibiteurs de protéase. Gardez les sles sur de la glace.

Séparez et récupérez les sles de la sciatique restante dans le tube avec de la pratique. Ablation de l’épineurium et séparation des sles. Ne devrait pas prendre plus de 10 minutes par nerf.

Retirez le tube contenant le SLES séparé de la glace. Incuber pendant deux heures à température ambiante pour libérer les structures non axonales de la myéline et des poux. Lavez les sles à chaque lavage.

À l’aide d’une pince, soulevez doucement les cônes et transférez-les dans un tube frais contenant un millilitre de 2 fois plus de PB avec des inhibiteurs de protéase. Secouez le tube sur une bascule pendant cinq minutes. Lavez le SLES de cette manière trois fois après le lavage.

Transférez le SLES dans un tube einor frais et vide pour éliminer l’excès de liquide, puis transférez-le dans un tube contenant 300 microlitres d’un XPBS avec inhibiteurs de protéus incuber à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Pour éluer l’opsm, des concentrations plus élevées de sel interfèrent avec d’autres procédures protéomiques. Centrifugez le fascicule à 10 000 fromages pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les tissus et les débris cellulaires et les faire passer du surnageant dans un tube einor propre.

Le surnageant obtenu. Devrait être clair. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration en protéines.

Un rendement de 200 à 250 microgrammes de protéines doit être obtenu. Conservez la préparation de plasma dans des aliquotes à moins 80 degrés Celsius pendant une période pouvant aller jusqu’à six mois. Évitez les cycles de décongélation et de congélation.

Voici un bloc occidental comparant du plasma opératoire isolé par la méthode de compression manuelle avec des échantillons opératoires isolés comme le montre ce protocole. Notez les niveaux réduits d’albumine et de GFAP représentant respectivement les contaminations des protéines sanguines et des cellules gliales. En revanche, la tubuline axonale bêta-trois est enrichie dans cette préparation, ce qui indique un niveau élevé de protéines axonales.

Après avoir regardé toute cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer le nerf satique et de séparer correctement Paco. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.