Isolement axoplasme du nerf sciatique du rat

L'objectif général de cette procédure est d'isoler un cytoplasme axonal ou un ectoplasme pur à partir d'un nerf périphérique. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant le nerf sciatique. La deuxième étape de la procédure consiste à éliminer le tissu conjonctif du nerf et à séparer les faisceaux.

La troisième étape de la procédure consiste à incuber de courts segments de gaines nerveuses dans un milieu hypotonique. La dernière étape de la procédure est l'incubation dans une solution isotonique, suivie d'une centrifugation et d'une opsm milian. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent un degré élevé d'enrichissement des composants axonaux par analyse de type western blot.

Bonjour, je m'appelle I, Elle And I may Rosenbaum. Nous appartenons au laboratoire du professeur Mike F Labor, du Département de chimie biologique de l'Institut des sciences. Aujourd'hui, nous allons présenter une nouvelle technique de méthylation Oxy Opat.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la pression manuelle pour l'OIS du nerf périphérique, est que cette procédure réduit la contamination par le sérum et les globules, permettant d'obtenir des contenus axonaux plus purs. Nous avons utilisé cette nouvelle technique pour l'analyse de la méthylation des PLA afin d'explorer la signalisation rétrograde dépendante de D après une lésion du nerf sciatique.

Commençons. Placez l'un des deux rats Wistar euthanasiés âgés de huit à dix semaines sur le côté, sur un tapis de dissection, afin d'accéder directement à la partie distale du nerf sciatique. Rasez la peau au milieu de la cuisse et désinfectez soigneusement avec de l'éthanol à 70 %.

Utilisez des ciseaux pour enlever la peau de la cuisse. Coupez soigneusement à travers la graisse et les tissus conjonctifs situés entre les muscles biceps fémoral et glutéal superficiel. Utilisez une pince pour soulever la région exposée du nerf sciatique et retirez-le.

La section retirée aura une longueur d'environ 1,5 centimètre. Transférez le nerf dans 500 microlitres de PBS 2X froid sur glace contenant des inhibiteurs de protéase, dans un tube de microcentrifugeuse. Conservez le tube sur de la glace.

Répétez la procédure de dissection de l'autre côté du rat et des deux côtés d'un deuxième rat. Grattez le fond d'une boîte de Pétri avec une pipette Pasteur et remplissez-la avec deux millilitres de PBS 0,2 X à température ambiante contenant des inhibiteurs de protéase.

Transférez un nerf unique dans la boîte sous le microscope stéréo. Utilisez des pinces fines pour retirer l’épinière du nerf en la tirant et jetez-la, en laissant les faisceaux dans la boîte. Séparez soigneusement les faisceaux les uns des autres et du fond de la boîte.

Les fales individuelles deviendront troubles et flotteront à la surface de la solution. Transférez immédiatement les fales séparées dans un tube de microcentrifugeuse contenant 500 microlitres de PB 0,2 X avec des inhibiteurs de protéases. Conservez les prélèvements sur glace.

Séparez et collectez les SLER du nerf sciatique restant dans le tube avec pratique. L'élimination de l'épinerure et la séparation des SLER ne devraient pas prendre plus de 10 minutes par nerf.

Retirez le tube contenant les SLES séparés de la glace. Incubez pendant deux heures à température ambiante pour libérer la myéline et les structures non axoniales des poux. Lavez les SLES après chaque lavage.

Utilisez une pince pour soulever délicatement les SLES et transférez-les dans un tube neuf contenant un millilitre de PBS 2X avec des inhibiteurs de protéase. Agitez le tube sur un berceur pendant cinq minutes. Lavez les SLES de cette manière trois fois après le lavage.

Transférez le SLES dans un nouveau tube Eppendorf vide afin d'éliminer le liquide en excès, puis transférez-le dans un tube contenant 300 microlitres de 1X PBS avec des inhibiteurs de protéases, et incubez à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Pour éluer les opsm, des concentrations élevées de sel interfèrent avec les étapes ultérieures des procédures de protéomique. Centrifugez le fascicule à 10 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin de former un culot de tissu et de débris cellulaires, puis pipetez le surnageant dans un tube Eppendorf propre.

Le surnageant obtenu doit être clair. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration en protéines.

Un rendement de 200 à 250 microgrammes de protéine devrait être obtenu. Conserver la préparation de plasmide op en aliquotes à moins 80 degrés Celsius pendant jusqu'à six mois. Éviter les cycles de décongélation et de congélation.

Voici un bloc western comparant un plasmide op isolé par la méthode de pression manuelle avec des échantillons d'opsine isolés selon le protocole décrit ici. Notez la réduction des niveaux d'albumine et de GFAP, représentant respectivement les contaminations par des protéines sanguines et des cellules gliales. En revanche, la tubuline bêta trois axonale est enrichie dans cette préparation, indiquant un taux élevé de protéines axonales.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment disséquer le nerf sciatique et comment séparer correctement le Paco. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.