Name: Isolement axoplasme du nerf sciatique du rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Découvrez l'isolement de l'axoplasme du nerf sciatique du rat pour la biologie neuronale. Cette méthode utilise un milieu hypotonique pour lyser les structures non axonales et enrichir les composants axonaux.

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Ce protocole permet l'isolement axoplasme avec minimisation de la contamination tissu glial et vasculaire. La méthode des rendements d'environ 70 à 100 mg de protéines totales par axoplasme une semaine de 80 à 10 Wistar vieux rat. 1. Disséquer nerfs sciatiques <ol><li> Euthanasier deux rats par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale. Confirmer la mort par la palpation de l'absence de battement avant la dissection début. </li><li> Nettoyer la zone de dissection avec 70% d'éthanol. </li><li> Coupez la peau, les muscles séparer et isoler nerf sciatique en utilisant des ciseaux et des pinces attentivement, sans endommager les vaisseaux sanguins. Disséquer les deux nerfs sciatiques (environ 1,5 cm chacune) de chaque animal et de collecter toutes les quatre nerfs dans un eppendorf de 500 pl de PBS 0,2 X + inhibiteurs, conservés sur la glace. </li><li> Transférer le culot de segments plats en plastique contenant au moins 2 mL de PBS inhibiteurs de protéase 0,2 x +. </li><li> Retirez l'épinèvre des nerfs à l'aide de pinces fines dans le champ binoculaire. Séparez les fascicules très soigneusement jusqu'à ce qu'ils deviennent troubles et commencent à flotter sur la surface de solution. Cette étape devrait être pratiqué jusqu'à ce qu'il puisse être effectué rapidement et avec précision (ne pas prendre plus de 10 minutes par nerf). </li></ol> 2. L'incubation, lavage et d'élution <ol><li> Transfert séparés fascicules d'un nouveau tube Eppendorf avec 500 ul de PBS contenant 0,2 x inhibiteurs de protéase pour une incubation de 2 h à température ambiante. </li><li> Laver au moins 3 fois avec 1 ml du même tampon en transférant les fascicules du tube Eppendorf à tube Eppendorf et agiter pendant 5 min après le transfert. </li><li> Pour enlever l'excès de liquide mis les fascicules dans un tube eppendorf de nouveaux vides et puis de transférer les fascicules d'un nouveau tube Eppendorf avec 300 ul de PBS 1X contenant inhibiteur de protéase pour une incubation pendant 20-30 min à température ambiante. </li><li> Centrifuger 10 min à 10000 xg à 4 ° C. </li><li> Prenez le surnageant et mesurer la concentration de protéines. Ceci est votre préparation axoplasme. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Axoplasme Western blot comparant isolé par la méthode manuelle serrer avec des échantillons isolés axoplasme comme indiqué dans ce protocole. Notez la réduction des niveaux d'albumine et de la GFAP, protéine du sang qui représente et les contaminations de cellules gliales, respectivement. En revanche, la tubuline axonale b3 est enrichi dans cette préparation, indiquant un niveau élevé de protéines axonales.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

Les analyses biochimiques et protéomiques ont confirmé que cette procédure réduit la contamination de cellules gliales sérum et 3 par rapport aux méthodes décrites précédemment pour l&#39;isolement axoplasme de Squeeze mécanique 1. Nous avons utilisé ce protocole d&#39;isolement axoplasme à explorer dynéine basé signalisation rétrograde après lésion du nerf sciatique 2, et s&#39;attendre à ce qu&#39;il ont une utilité dans l&#39;exploration de nombreux autres processus dans le nerf périp...

<ul><li> Des rats Wistar mâles (8-10 semaines) </li><li> PBS 0,2 X et PBS 1X contenant des solutions inhibiteurs de protéase (Roshe) 2 comprimés par 50 ml </li><li> Eppendorfs pour 1,5 ml </li><li> Stérilisé plats en plastique de 35 mm </li><li> Des outils de dissection, y compris: des ciseaux et des pinces fines </li><li> La lumière binoculaire et la table </li></ul> Anticorps Souris anti-GFAP clone GA-5 a été de Sigma (G6171). Lapin anti-albumine a été d&#39;Cedarlane (CLAG5140). Souris anti-tubuline β3 et de lapin anti-Gerk provenaient de chez Sigma (T2200 et M5670, respectivement).

isolement axoplasme du nerf sciatique du rat

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolement du cytoplasme axonal pur (axoplasme) de nerf périphérique est cruciale pour les études biochimiques de nombreux processus biologiques. Dans cet article, nous démontrons et décrire un protocole pour l&#39;isolement du nerf axoplasme sciatique de rat adulte sur la base des étapes suivantes: (1) la dissection des fascicules nerveux et la séparation des tissus conjonctifs; (2) incubation de courts segments de fascicules nerveux au milieu hypotonique pour libérer de la myéline et Lyse non axonale des structures, et (3) l&#39;extraction de l&#39;axone reste-matériau enrichi. Caractérisation protéomique et biochimique de cette préparation a confirmé un haut degré d&#39;enrichissement pour les composants axonale.

Nous démontrons un protocole pour l&#39;isolement du nerf axoplasme sciatique de rat adulte repose sur la dissection des fascicules nerveux et l&#39;incubation dans le milieu hypotonique pour libérer de la myéline et Lyse non axonale structures, suivie de l&#39;extraction de l&#39;axone reste-matériau enrichi.

Isolement axoplasme du nerf sciatique du rat

L'isolement du cytoplasme axonal pur (axoplasme) à partir d'un nerf périphérique est crucial pour les études biochimiques de nombreux processus biologiques. Dans cet article, nous...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler un cytoplasme axonal ou un ectoplasme pur à partir d'un nerf périphérique. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant le nerf sciatique. La deuxième étape de la procédure consiste à éliminer le tissu conjonctif du nerf et à séparer les faisceaux.La troisième étape de la procédure consiste à incuber de courts segments de gaines nerveuses dans un milieu hypotonique. La dernière étape de la procédure est l'incubation dans une solution isotonique, suivie d'une centrifugation et d'une opsm milian. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent un degré élevé d'enrichissement des composants axonaux par analyse de type western blot.Bonjour, je m'appelle I, Elle And I may Rosenbaum. Nous appartenons au laboratoire du professeur Mike F Labor, du Département de chimie biologique de l'Institut des sciences. Aujourd'hui, nous allons présenter une nouvelle technique de méthylation Oxy Opat.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la pression manuelle pour l'OIS du nerf périphérique, est que cette procédure réduit la contamination par le sérum et les globules, permettant d'ob

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Grâce à la simplicité de la chirurgie et le résultat robuste du comportement, de constriction chronique du nerf sciatique est l'un des modèles animaux pré-éminents de la douleur neuropathique. Dans les 24 heures suivant la chirurgie, hypersensibilité à la douleur est établi et peut être mesurée quantitativement l'aide d'un von Frey esthésiomètre (essais mécaniques) et le compteur analgésie plantaire (essai thermique).

Constriction chronique du nerf sciatique et les essais hypersensibilité à la douleur chez le rat

Cette vidéo décrit l’isolement et la culture de cellules de Schwann à partir de racines spinales de souris. Des cellules isolées sont ensuite cultivées dans des milieux spécifiques. Les cellules de Schwann sont isolées par digestion différentielle et par adhérence. Ils sont ensuite transférés sur des lamelles recouvertes d’une matrice extracellulaire pour être fixés et proliférer.

Isolement des cellules de Schwann à partir de racines vertébrales de souris

Cette vidéo montre une méthode pour isoler les cellules de Schwann des fibres du nerf sciatique de souris.

Séparation magnétique des cellules de Schwann des nerfs sciatiques de souris

Cette vidéo montre un enregistrement à fibre unique de la conduction nerveuse de la fibre C chez le rat. Un rat anesthésié est incisé pour exposer le nerf sciatique, qui fournit l’alimentation sensorielle et motrice des membres inférieurs. Les fibres C individuelles sont ensuite exposées. La stimulation électrique est fournie à l’aide d’électrodes de stimulation implantées dans le pied, et une réponse est enregistrée à partir d’une seule fibre nerveuse.

Enregistrement in vivo d’une seule fibre du nerf sciatique C chez le rat

Ici, nous présentons une technique in vivo de transfert de gènes vers les cellules de Schwann (SC) dans le nerf sciatique du rongeur. Cette technique simple est utile pour étudier les mécanismes de signalisation impliqués dans le développement et le maintien des CS myélinisants.

In Vivo Transfert de gènes à des cellules de Schwann dans le nerf sciatique Rongeur par électroporation

Ici, nous présentons un protocole pour l’extrusion hydraulique de la moelle épinière ainsi que l’identification et l’isolement de ganglions spécifiques de la racine dorsale (DRG) chez le même rongeur. Par rapport aux méthodes standard d’isolement de la moelle épinière, cette méthode est nettement plus rapide et réduit le risque de lésions tissulaires.

Extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en Rongeurs

L'enregistrement à fibre unique est une technique électrophysiologique efficace qui s'applique aux systèmes nerveux central et périphérique. Avec la préparation du DRG intact avec le nerf sciatique attaché, le mécanisme de l'échec de conduction est examiné. Les deux protocoles améliorent la compréhension de la relation du système nerveux périphérique avec la douleur.

Utilisation de l'enregistrement in vivo à fibre unique et du ganglion de racine dorsal intact avec le nerf sciatique attaché pour examiner le mécanisme de l'échec de conduction

Cette méthode permet l’enregistrement de la force des contractions twitch et tétanos et des potentiels d’action dans trois types d’unités motrices dans le muscle gastrocnemius médial de rat. L’isolement fonctionnel d’une seule unité motrice est induit par la stimulation électrique de l’axon.

Isolement fonctionnel des unités motrices individuelles du muscle gastrocnemius de Rat Medial

Ce protocole décrit la préparation de tissu nerveux sciatique entier de rat pour la stimulation électrophysiologique ex vivo et l’enregistrement dans un bain salin perfusé à deux compartiments régulé par l’environnement.

Préparation du nerf sciatique de rat pour la neurophysiologie ex vivo

Dans le système de coculture des ganglions de la racine dorsale et des cellules de Schwann, la myélinisation du système nerveux périphérique peut être étudiée. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’observer et de quantifier la myélinisation périphérique et d’étudier les effets des composés d’intérêt sur la gaine de myéline.

Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann

Découvrez l'isolement de l'axoplasme du nerf sciatique du rat pour la biologie neuronale. Cette méthode utilise un milieu hypotonique pour lyser les structures non axonales et enrichir les composants axonaux.

Isolement axoplasme du nerf sciatique du rat

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