Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d'évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer les réponses des lymphocytes T effecteurs et mémoires à l’aide de tests de points d’interféron gamma L en culture à court et à long terme, respectivement. L’évaluation de la réponse de la mémoire centrale est réalisée par la culture de cellules mononucléées de sang périphérique bovin sous stimulation antigénique pendant 13 jours. La culture à long terme permet aux réponses des lymphocytes T effecteurs de se produire et de décliner.

L’interleukine deux est ajoutée aux cultures pour le maintien des lymphocytes T mémoire. Au 13e jour, les cellules à long terme sont transférées sur des plaques de point L recouvertes d’un anticorps de capture gamma IFN. La réponse des cellules à long terme aux antigènes mycobactériens individuels est évaluée en présence ou en l’absence de cellules présentatrices d’antigènes autologues.

Les APC sont isolés des BMC frais par adhérence au jour 13. De plus, la réponse de pbmc fraîchement isolée dans des conditions ex vivo est évaluée comme un corrélat des réponses effectrices. Dans plusieurs études, il a été démontré que la réponse à long terme des bovins en culture aux antigènes mycobactériens après la vaccination était positivement corrélée avec l’efficacité du vaccin.

De plus, les cultures de lymphocytes T à long terme contiennent principalement des lymphocytes T à mémoire centrale chez l’homme et les bovins. 60 ml de sang sont prélevés sur des animaux infectés ou vaccinés par jugulaire, par ponction veineuse et les BMC P sont isolés par densité. Centrifugation par gradient.

La concentration cellulaire doit être ajustée à 4 millions de cellules par ml. Dans un milieu RPMI complet, commencez par plaquer 500 microlitres d’antigènes microbactériens, dans ce cas TB 10.4 et l’antigène 85 A et le dérivé protéique purifié de la culture em bovis appelé PPDB. Ajoutez ensuite 500 microlitres de pbmc isolés de chaque animal avec quatre répétitions par animal.

Notez que tous les puits doivent être stimulés. Des contrôles tels que l’absence de stimulation ou de mitogènes ne sont pas nécessaires dans cette étape, incuber la plaque à 39 degrés Celsius, la température normale des bovins pendant 13 jours. Les troisième et septième jours, jetez 500 microlitres de chaque puits en pipetant soigneusement pour ne pas perturber la couche cellulaire au fond des puits.

Réapprovisionnez le volume avec un PMI complet contenant IL Two. Placez la plaque dans l’incubateur Le 10e jour, jetez 750 microlitres de surnageant de chaque puits en réapprovisionnant avec du RPMI complet sans aucun IL deux le 12e jour, pipetez et jetez un ml de surnageant de chaque puits réapprovisionné en RPMI complet sans IL deux. Préparez également la plaque du point L à recouvrir d’anticorps de capture gamma IFM : pipette d’abord 15 microlitres d’alcool à 35 % dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux, cette étape augmente la définition du point.

Bien laver six fois avec 300 microlitres de PBS. Ajouter 100 microlitres d’anticorps de capture à huit microgrammes par ml dans du PBS. Le pipetage doit être effectué avec soin pendant toutes les procédures, sans laisser les pointes de pipette toucher ou endommager la membrane au fond du puits, placer la plaque dans un sac en plastique et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le 13e jour, prélever 60 ml de sang par ponction de la veine jugulaire sur les mêmes animaux échantillonnés le premier jour. Isolez le pbmc et ajustez la concentration à 2 millions de cellules par ml. Étiquetez correctement la plaque du point L pour chaque ensemble d’échantillons.

Cellules à long terme plus APC Cellules à long terme sans APC et cellules ex vivo. Jetez l’anticorps de capture des puits de lavage de plaque Ellis Spot avec 300 microlitres de PBS contenant du tween. Répétez six fois, jetez, le liquide de lavage et la pipette.

50 microlitres de BMC p fraîchement isolés dans les puits alloués aux cellules à long terme. Plus les APC. Bloquer d’autres puits de la plaque de point L avec 200 microlitres par puits de RPMI complet Pour évaluer le phénotype des cellules par cytométrie en flux en parallèle avec la plaque de dosage du point L.

50 microlitres de cellules fraîchement isolées dans une plaque à fond rond à 96 puits correctement étiquetée. Il s’agit d’un test auxiliaire à effectuer en conjonction avec le test de la tache jaune pour déterminer le phénotype des cellules répondantes. Incuber des plaques pendant 90 minutes à 39 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de CO2, permettant aux cellules présentatrices d’antigène d’adhérer.

Incuber également 200 ml de RPMI complet pour le réchauffer pendant cette étape d’incubation de 90 minutes. Récoltez les cellules cultivées à long terme à partir de la plaque de 24 puits. Combinaison des quadruples duplicatas de chaque animal en un seul tube conique de 15 mils.

Centrifugez les tubes pendant cinq minutes à 400 G.Jetez le surnageant par inversion du tube, délogez la pastille cellulaire et ajoutez cinq ml de PBS en remettant doucement la pastille en suspension si nécessaire. Lavez les cellules deux fois, puis ajustez la concentration cellulaire à 200 000 cellules par ml. Après l’incubation de 90 minutes, prélever la plaque LPO et le RPMI complet de l’incubateur.

Placez la plaque LPO sur un agitateur à assiettes pendant 30 secondes. Ensuite, retirez les cellules de non-adhérence par pipette d’inversion de plaque de 150 microlitres par puits de RPMI complet chaud. Secouez la plaque et jetez le liquide de lavage.

Répétez l’opération trois fois, jetez autant de liquide que possible et ajoutez cent microlitres par puits de chaque antigène dans les puits appropriés contenant des APC adhérents. Ensuite, pipetez 100 microlitres par puits de suspension cellulaire cultivée à long terme. 200 000 cellules par ML dans les puits étiquetés comme cellules à long terme plus APC.

Assurez-vous que les cellules à long terme ajoutées à cette étape proviennent du même animal que les APC déjà dans le puits. Ne mélangez pas les APC et les cellules cultivées à long terme de différents animaux. De plus, pipeter 100 microlitres par puits de suspension de cellules cultivées à long terme à une concentration de 200 000 cellules par ml dans des puits sans APC pour évaluer les réponses à long terme.

En l’absence de présentation de l’antigène, ajouter 100 microlitres par puits de cellules à court terme, plus des cellules fraîchement isolées et ajustées à 2 millions de cellules par ML pour l’évaluation de la réponse ex vivo. Si vous effectuez une analyse par cytométrie en flux, laver la plaque à fond rond 96 et ajouter les cellules et les antigènes fraîchement isolés à long terme dans les puits en suivant les mêmes procédures. Utilisé pour l’IFN Gamma LPO plaque Incuber les plaques pendant la nuit à 39 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de CO2.

Assurez-vous que les assiettes sont à plat et n’empilez pas les assiettes le 14e jour. Jetez les liquides des puits et des plaques de lavage six fois avec 300 microlitres par puits de PBS contenant des préadolescents, en les plaçant sur l’agitateur de plaques à chaque fois pendant 10 secondes avant et entre les lavages. Ensuite, lavez une fois avec le même volume d’eau distillée et six fois de plus avec du PBS contenant des préadolescents.

Enfin, laver les cellules deux fois avec 300 microlitres par puits de PBS. Retirez le liquide de lavage en tapotant l’assiette sur du papier absorbant ou des tampons absorbants. Ajouter 100 microlitres par puits d’anticorps de détection à cinq microgrammes par ml dilué dans du PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine.

Incuber les assiettes pendant 120 minutes à 39 degrés Celsius. Au cours de cette étape d’incubation, préparer la solution de phosphatase alcaline à partir de l’étalon du kit VTA stain A BC AP en suivant les instructions du fabricant 30 minutes avant l’utilisation ou 90 minutes après l’ajout de l’anticorps de détection dans les puits. Diluer le réactif dans du PBS contenant du PBS après 120 minutes d’incubation, jeter l’anticorps de détection par inversion de plaque laver les plaques six fois avec 300 microlitres par puits de PBS contenant du PBS.

Retirez le liquide de lavage en tapotant l’assiette sur du papier absorbant. Ajoutez ensuite 100 microlitres par puits de solution de phosphatase alcaline. Incuber les plaques pendant 45 minutes à température ambiante.

Jetez le liquide et lavez chaque assiette six fois avec du PBS contenant du tween. Préparez la solution de substrat à partir du kit de substrat AP bleu vectoriel trois en suivant les instructions du fabricant. Diluer les réactifs dans un tampon HCL tris 0,1 molaire à pH 8,2.

Pipette 50 microlitres de substrat D.Chaque puits incube à température ambiante jusqu’à ce que la couleur bleue commence à se développer environ 30 minutes. Jetez le liquide et lavez les assiettes avec de grandes quantités d’eau distillée. Retirez la plaque inférieure pour exposer la membrane de lavage des puits et laissez la plaque sécher à l’air.

Mesurez la réponse à l’aide d’un analyseur d’images immuno-ponctuelles ou conservez les plaques dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce que la réponse soit mesurée. En raison de la grande stabilité du substrat réactionnel, la qualité du substrat est préservée pendant plusieurs années. Si l’on évalue le phénotype et la réponse cytokinique par cytométrie en flux, effectuer des procédures de coloration standard des cellules plaquées sur le fond rond 96, une plaque de puits représentative de la MTC en présence ou en l’absence d’APC, des réponses ponctuelles IFN gamma L habitées ex vivo d’animaux infectés et d’animaux non infectés sont mises en évidence.

Les réponses spécifiques à m bovis sont évaluées par stimulation antigénique PBDB ou ESAT six, CFP 10. Les taches au fond des plaques sont le produit coloré du dosage des points jaunes. Chaque tache représente généralement une cellule productrice de cytokines individuelle, fournissant une mesure quantitative de l’IFN gamma producteur de cellules T avec des cellules d’animaux infectés.

Les réponses à long terme de l’IFN gamma L par taches, présentées sous forme de cellules formant des taches ou de SFC, sont clairement visualisées ; peu ou pas de production d’IFN gamma en réponse à la stimulation antigénique est observée avec des cellules de bovins non infectés et avec des cellules non stimulées de bovins infectés ou non infectés. Une réponse robuste des lymphocytes T devrait se produire en réponse au mitogène de la mauvaise herbe, comme le montrent les réponses TCM et ex vivo à PPDB et ESAT six. La CCFP 10 a été détectée chez tous les animaux infectés par 3M boVis et des réponses TCM et ex vivo minimes ou nulles ont été détectées chez l’animal témoin.

La présence d’APC était nécessaire pour que les animaux infectés répondent de manière optimale à la MTC, comme en témoignent les réponses considérablement réduites des cellules cultivées à long terme. En l’absence de CPA autologues, des cellules formant des taches d’animaux infectés par em, bovis et non infectés ont été présentées. Le nombre de SFC de chaque animal a été calculé par un nombre moyen de SFC de 10 à la sixième cellule dans des échantillons dupliqués en réponse à la PPDB moins la réponse respective au milieu seul Les réponses différaient en fonction du statut d’infection, de la présence ou de l’absence de CPA et de la longueur de la culture, c’est-à-dire la culture à long terme par rapport à la culture ex vivo.