L'isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

L’objectif global de cette méthodologie ELISpot est de permettre la quantification des lymphocytes B sécrétant des anticorps humains dans le sang. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biomédical sur l’immunologie des lymphocytes B et la recherche sur les vaccins. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la détection et la mesure des lymphocytes B sécrétant des anticorps au niveau de la cellule unique.

La démonstration de la procédure sera faite par Tsung-Chih Tseng, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Immédiatement après l’obtention d’un échantillon de sang de 10 ml de la veine cubitale médiane dans un tube de 15 ml contenant de l’EDTA supplémenté en potassium, retournez le tube plusieurs fois pour empêcher la formation de caillots. Ajoutez ensuite 35 ml de tampon de lyse des globules rouges autoclavé aux cellules pour une incubation de cinq minutes à température ambiante.

Lorsque la lumière peut être observée à travers le tube, centrifugez le sang et confirmez la présence d’une pastille blanche. Retirez le tampon de lyse résiduel avec 10 ml de PBS autoclavé et remettez la pastille en suspension dans 10 ml de milieu RPMI 1640. Placez les cellules dans une boîte de culture de 10 cm pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, faites tourner doucement la boîte de culture plusieurs fois et transférez les cellules flottantes dans un tube conique en plastique de 15 ml. Après deux lavages par centrifugation, remettre la pastille en suspension à cinq à 10 fois dixième des six cellules par ml de concentration dans 200 microlitres de tampon PBS froid et ajouter 5 microlitres de cocktail d’anticorps anti-humains biotinylés spécifiques pour les cellules sanguines par un fois dixième des sixièmes cellules. Après une incubation de 30 minutes sur de la glace, laver les cellules dans un volume excédentaire de 10 fois plus de PBS stérile et remettre la pastille en suspension dans cinq microlitres de microbilles conjuguées à la streptavidine par une fois dixième des six cellules pour une incubation de 30 minutes sur glace.

À la fin de l’incubation, ajoutez deux ml de tampon PBS dans les cellules et placez le tube sur un support magnétique pendant huit minutes à température ambiante. Lorsque les microbilles se sont fixées à la paroi du tube, transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube conique et ajoutez 2 ml supplémentaires de tampon PBS aux cellules. Après la deuxième collecte de surnageants, prélever les cellules regroupées par centrifugation et transférer les cellules dans un tube de polystyrène de cinq ml et un tampon PBS frais à une concentration d’un dixième des sept cellules par ml.

Après avoir procédé à un blocage non spécifique, ajoutez un microgramme de chaque anticorps de sélection par un dixième des six cellules dans le tube en mélangeant doucement pour une incubation de 30 minutes sur glace. Pendant les cinq dernières minutes de l’incubation, ajoutez cinq microlitres de 7-AAD dans les cellules. Ajoutez ensuite deux millilitres de PBS frais dans les cellules et vortex avant de centrifuger.

Remettez le granulé en suspension dans un tampon de tri frais à une à cinq fois le dixième des sept cellules par millilitre et filtrez les cellules à travers une crépine de 40 microns dans un nouveau tube en polystyrène de cinq millilitres. Ensuite, triez les cellules par cytométrie en flux dans trois tubes de 15 ml contenant 5 ml de milieu RPI frais pour collecter les lymphocytes B naïfs, les lymphocytes B à mémoire et les plasmocytes plasmablastiques. Lorsque toutes les cellules ont été récoltées, ensemencez les sous-ensembles dans des puits individuels d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits à une concentration de un à dix fois dixième des cinquièmes cellules par millilitre dans un milieu RPMI frais.

Ensuite, activez les cellules B avec cinq microgrammes de CPG ODN 2006 par une fois dixième des sixièmes cellules par milli litre par puits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq jours. À la fin de l’activation, ajoutez 30 microlitres d’éthanol à 35 % et de l’eau distillée dans chaque puits des plaques ELISpot pendant 30 secondes. Ensuite, remplacez l’éthanol dans chaque puits par 150 microlitres d’eau double distillée autoclavée et incubez les plaques à température ambiante pendant cinq minutes pour éliminer l’éthanol résiduel.

Effectuez un lavage PBS suivi de l’ajout de 50 microlitres du fragment polyclonal FAB2 d’IG anti-humain dans chaque puits. Lavez les assiettes deux fois avec du PBS comme nous venons de le démontrer. Bloquez la liaison non spécifique dans chaque puits avec 200 microlitres de PBS frais avec BSA pendant deux heures à température ambiante.

Après une autre série de lavages PBS, incubez les puits dans 100 microlitres de milieu frais RPMI 1640 à 37 degrés Celsius. Replacez ensuite le milieu dans chaque puits ELISpot par le nombre approprié de cellules B activées. Portez le volume final de chaque puits à 150 microlitres avec un milieu RPMI frais, puis remettez la plaque ELISpot dans l’incubateur de culture cellulaire pendant huit à 14 heures.

À la fin de la période d’incubation, jetez le milieu et lavez les puits avec 200 microlitres de PBS plus tween20 pour cinq lavages de trois minutes. Après le dernier lavage, ajoutez les anticorps de détection appropriés dans leurs puits correspondants et incubez les plaques pendant deux heures dans l’obscurité. Après une autre série de lavages PBS, ajoutez 50 microlitres de substrat BCIPMBT dans chaque puits pendant cinq à 15 minutes à température ambiante.

Lorsque des taches violettes apparaissent, arrêtez la réaction avec 100 microlitres d’eau double distillée par puits et rincez la plaque à l’eau courante du robinet. Ensuite, faites sécher à l’air libre la membrane ELISpot à l’abri de la lumière. Dans cet échantillon PBMC de donneur, après la lyse des globules rouges et la déplétion des cellules adhérentes, environ 10 % des lymphocytes étaient des lymphocytes B CD19 positifs.

Dans le compartiment des lymphocytes B, environ 50 % des cellules étaient des lymphocytes B naïfs CD27 négatifs et 50 % étaient des lymphocytes B mémoires exprimant CD27. Le traitement CPG des lymphocytes B humains purifiés et des CD19+CD27+ pendant cinq jours, comme nous venons de le démontrer, entraîne généralement la génération de 50 à 200 cellules sécrétant des anticorps IgM et 10 à 50 cellules IgG d’une fois dix à la quatrième cellules B activées. Une fois maîtrisée, cette technique ELISpot peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée.

Avant de commencer cette procédure, il est important de ne pas oublier de coder l’endroit avec les réactifs de capture appropriés pour détecter les cellules sécrétrices d’anticorps. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la vaccinologie pour explorer l’efficacité des vaccins dans le cadre d’essais à grande échelle et de suivis longitudinaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier les lymphocytes B humains du sang.

Séparez les lymphocytes B naïfs et mémoires pour leur différenciation et effectuez un essai ELISpot pour qualifier les cellules sécrétant des anticorps corporels. N’oubliez pas que travailler avec du sang humain peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de cette procédure.