Name: Lisolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Découvrez l'isolement et la différenciation des cellules B sécrétant des anticorps humains du sang périphérique. Cette méthode ELISpot permet la quantification des cellules sécrétant des IgM et IgG au niveau cellulaire unique pour la recherche vaccinale.

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Cette étude a été financée par une subvention de recherche du ministère des Sciences et de la Technologie du Yuan exécutif de Taïwan (NSC99-2320-B-002-011). Je tiens à souligner l’excellent service fourni par le noyau d’analyse et de tri par cytométrie en flux du premier laboratoire central de la faculté de médecine de l’Université nationale de Taïwan.

le sang périphérique humain doit être obtenu à partir de donneurs sains en vertu du consentement éclairé, et l&#39;utilisation d&#39;échantillons de sang doivent être conformes aux lignes directrices approuvées établies par différents conseils d&#39;examen institutionnels. Dans cette étude, le protocole à utiliser le sang humain dans une démonstration des résultats de cytométrie de flux (Figure 1) et des tests ELISpot (figure 3) a été approuvé par la Commission de révision interne de National Taiwan University Hospital (numéro de protocole 201307019RINB). 1. Isolement et purification des cellules de sang périphérique humain B <ol><li> Dessiner ~ 10 ml de sang de la veine médiane cubitale (dans le creux antérieur cubital du coude) dans un tube de 15 ml contenant du K2EDTA (1,5 à 2,0 mg / mL de sang) et inverser immédiatement le tube plusieurs fois pour empêcher un caillot formation. </li><li> Ajouter 35 ml d&#39;autoclave (121 ° C, 15 min) de globules rouges (RBC) de tampon de lyse (150 mM de NH4CI, 10 mM de KHCO 3 et 1 mM d&#39; EDTA, pH 7,4) dans le tube contenant l&#39;échantillon de sang frais (≥ 3: 1 volume / volume) et incuber à température ambiante (TA) pendant une durée de 5 min. NOTE: L&#39;apparition de transmission de la lumière à travers le tube indique l&#39;achèvement de RBC lyse. </li><li> Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Assurez-vous que la pastille est de couleur blanche. </li><li> Remettre en suspension le culot avec 10 ml de sérum physiologique autoclavée tamponnée au phosphate (PBS, NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na 2 HPO 4 et 1,47 mM de KH 2 PO 4; pH 7,4) et centrifugation comme dans l&#39; étape 1.3. </li><li> Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille avec 10 ml de milieu RPMI 1640 (supplément: 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline / streptomycine, 0,25 pg / ml d&#39;amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine), puis plaquer la cellules dans une boîte de culture de 10 cm (10 ml de sang par plat). Placer le récipient dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2 pendant 30 minutes. </li><li> Remuer doucement la boîte de culture à quelques reprises et placer lemilieu de culture (cellules en suspension) dans des tubes coniques en matière plastique de 15 ml. Jeter les cellules adhérentes (principalement des macrophages) sur les boîtes de culture. </li><li> Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot avec 1 ml de milieu RPMI 1640. Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé. REMARQUE: La viabilité des leucocytes isolés est normalement supérieure à 90% par exclusion au bleu trypan. </li><li> Centrifugeuse à l&#39; étape 1.7 , et de remettre en suspension les cellules dans ~ 200 pi de tampon PBS froid (0,5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et 2 mM d&#39; EDTA) à la concentration de 5 - 10 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Ajouter 5 ul de cocktail biotinylée anti-humaine Ab spécifique aux cellules sanguines (pour la sélection négative des cellules B) pour 10 6 cellules et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes 21. NOTE: Le cocktail Ab anti-humain doit comprendre au moins Abs spécifique à CD2 (ou CD3), CD14 et CD16. </li><li> Ajouter un volume en excès de 10 foisde PBS stérile aux cellules, centrifuger à 600 g pendant 5 min, et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter des quantités égales de microbilles de streptavidine conjugué (5 pi par 10 6 cellules) à la pastille et mélanger soigneusement. </li><li> Incuber sur de la glace pendant 30 min dans un tube conique de 15 ml en matière plastique. </li><li> Ajouter 2 mL de tampon PBS dans le tube. </li><li> Placer le tube dans un support magnétique et incuber à température ambiante pendant 8 min. Les microbilles brunes progressivement fixer à la paroi du tube à côté de l&#39;aimant 22. </li><li> Avec le tube restant dans le support magnétique, transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube stérile de 15 ml 22. </li><li> Répétez les étapes de 1,14 à 1,16, et de combiner les deux surnageants qui contiennent les cellules intactes B. Jeter les microbilles. </li><li> Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant. </li><li> Reprendre le culot dans du milieu RPMI 1640 pour des expériences en aval. NOTE: En règle générale, 1 - 5 x 10 5 cellules B witha pureté supérieure à 95% par rapport à 10 ml de sang périphérique 23 peut être isolé. </li></ol> 2. Purification et séparation de la mémoire et de Naïf B Les cellules provenant des cellules isolées B <ol><li> Utiliser des cellules purifiées à partir de l&#39;étape 1 et de déterminer le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de tampon PBS froid après centrifugation à 600 x g et à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter 1 - 2 pg de mAb biotinylé de CD27 par 10 6 cellules et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes. </li><li> Ajouter 10 ml de tampon PBS au tube et centrifuger à 600 g pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 50 ul de tampon PBS. </li><li> Ajouter des quantités égales de microbilles magnétiques de streptavidine (1 - 2 ng / 10 6 cellules) à des cellules dans un tube conique de 15 ml en matière plastique. </li><li> Bien mélanger délicatement et incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Ajouter 2 - 3 ml de tampon PBS au tube. </li><li> Placer letube dans un support magnétique et incuber à température ambiante pendant 8 min pour permettre aux microbilles brunes pour fixer sur le côté le plus proche de l&#39;aimant. </li><li> Avec le tube dans le support magnétique, transférer soigneusement la fraction de surnageant dans un nouveau tube stérile. Cette fraction contient le CD27 enrichi - cellules B naïves. </li><li> Ajouter 5 mL dans le tube contenant les microbilles et resuspendre doucement les microbilles (ie, la fraction enrichie de cellules CD27 + B mémoire) 24-25. </li><li> Centrifuger à 600 xg à température ambiante pendant 5 min. Resuspendre les pellets avec RPMI 1640 pour les expériences en aval. NOTE: En règle générale, ~ 30 - 60% des cellules B peut être purifié en tant que cellules de mémoire CD27 + à partir des PBMC d&#39;un donneur sain 7, 25-26. </li></ol> 3. tri cellulaire pour la collecte de cellules Naïf B, cellules mémoire B et PB / PC <ol><li> En utilisant les cellules purifiées à partir de l&#39;étape 1, de déterminer le nombre de cellules en utilisant un hemocytometer ou un compteur de cellules automatique. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans du tampon PBS froid à la concentration de 10 7 par ml dans un tube en polystyrène de 5 ml. </li><li> Ajouter 1 - 2 pg d&#39;IgG humaine par 10 6 cellules et laisser incuber sur de la glace pendant 10 minutes pour le bloc Fc. </li><li> Ajouter 1 pg de chacun des anticorps anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323) et anti-CD38-PE (clone: HIT2) pour 10 6 cellules; bien mélanger et incuber sur de la glace pendant 30 min 4, 27. </li><li> Dans les 5 dernières minutes à l&#39;étape 3.4, ajouter 5 pi du commerce 7-aminoactinomycine D (7-AAD). </li><li> Ajouter 2 mL de PBS dans le tube, vortex et centrifuger à 600 xg pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un tampon de tri (PBS stérile avec 2% de BSA et 2 mM d&#39; EDTA) à une concentration de 1 - 5 x 10 7 cellules par mL dans un tube de 15 ml. </li><li> Filtrer les cellules à travers un tamis de maille de nylon (40 um de taille des pores) pour éliminer les amas de cellules. </li><li> Séparer les cellules avec une sorte cytométriqueer équipé de trois lasers: violet (405 nm), bleu (488 nm) et rouge (640 nm). NOTE: Seul le laser bleu est suffisant pour 3 couleurs cytométrie en flux 27-28. </li><li> Trier les cellules en trois tubes de 15 ml (contenant 5 ml de milieu RPMI) pour la collecte simultanée des cellules B naïves (CD19 + CD27 -), les cellules mémoire B (CD19 + CD27 +) et PB / PC (CD19 + CD27 + / CD38 + salut) 3-4, 28. NOTE: les cellules B naïves et mémoire de classement peuvent être cultivées comme décrit à l&#39;étape 4. </li></ol> 4. In Vitro Différenciation des cellules isolées CD19 Human + B, CD19 + CD27 + cellules mémoire B et CD19 + CD27 - Naïf B Cellules <ol><li> En utilisant les cellules purifiées dans les étapes 1.19, 2.10, 2.11 et 3.10, déterminer le nombre de cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique. </li><li> Resuspendre les cellules avec du milieu RPMI 1640à une concentration de 1 - 10 x 10 5 par ml et aliquote les dans les puits d&#39;une plaque de 12 puits. </li><li> Ajouter CpG (ODN 2006) à 5 ug / 10 6 cellules / mL 18, 29. </li><li> La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2 pendant 5 jours. </li><li> Récolter les cellules de chaque puits, placez-les séparément dans des tubes de 15 ml, ajouter 5 ml de PBS à chaque tube et centrifuger les à 600 xg et RT pendant 5 min. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 1 - 10 x 10 5 par ml avec du milieu RPMI 1640. </li></ol> 5. ELISpot Assay <ol><li> Ajouter 30 ul de 35% d&#39;éthanol dans de l&#39;eau distillée à chaque puits des plaques ELISpot à 30 s. NOTE: Lorsque pipetage, évitez de toucher la membrane dans les puits en tout temps. </li><li> Inversez les plaques ELISpot pour éliminer l&#39;éthanol. </li><li> Mettez 150 pi de ddH autoclavé 2 O dans chaque puits et incuberelles à température ambiante pendant 5 min pour rincer de l&#39;éthanol résiduel; suivre avec un lavage de PBS stérile à température ambiante pendant 3 min. REMARQUE: Les étapes 05.01 à 05.03 peut être en option, en fonction de la fabrication des plaques. </li><li> Mettre 50 pl de 5 pg / ml polyclonale F (ab &#39;) 2 fragment d&#39;anticorps anti-Ig humaine (IgG + IgM + IgA) (dans du PBS) dans chaque puits des plaques ELISpot et de les incuber à 4 ° C pendant la nuit ( de préférence) ou 37 ° C pendant 2 h 11. NOTE: Sceller les bords des plaques avec du Parafilm jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Inversez les plaques pour éliminer Abs non liée, ajouter 200 ul de PBS à chaque puits et incuber deux fois à température ambiante pendant 3 min à chaque fois. </li><li> Ajouter 200 ul de PBS avec 5% de BSA (ou le milieu RPMI 1640) à chaque puits pour bloquer, et incuber à température ambiante pendant 2 h. </li><li> Inversez les plaques pour enlever le tampon de blocage. Laver chaque puits deux fois avec 200 ul de PBS, comme dans l&#39;étape 5.5. </li><li> Ajouter 100 ul de milieu RPMI 1640 à chaque puits et incuber à 37 ° C. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à ensemencer les cellules, inverser les plaques pour éliminer le milieu RPMI 1640. </li><li> Semences de 100 pi (5 x 10 4), 50 ul (2,5 x 10 4), et 25 ul (1,25 x 10 4) des cellules ( à partir des étapes 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 et 4.6) dans les puits d&#39;une plaque ELISpot. Avec RPMI 1640, porter le volume à 150 pl / puits. NOTE: Un minimum d&#39;un ou deux 2 fois des dilutions en série pour l&#39;étalement des cellules est recommandé. </li><li> Incuber les plaques dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO2 pendant 8-14 h 18. Évitez de déplacer les plaques pendant l&#39;incubation. </li><li> Inverser les plaques pour éliminer les cellules et le milieu RPMI 1640. </li><li> Ajouter 200 pl / puits de PBS-T (PBS avec 0,05% de Tween 20) et incuber à température ambiante 5 fois, chaque fois pendant 3 min. Inversez la plaque pour enlever le tampon de lavage entre chacune des 5 lavages. </li><li> Ajouter la phosphatase alcaline IgG de chèvre anti-humaine (AP), Abs Fcy spécifique (pour la détection des IgG, 1: 5000 dans du PBS-T) Ou de chèvre anti-humain IgM-AP, Fcμ Ab spécifique à un fragment (pour la détection des IgM, 1: 5000 dans du PBS-T) dans les puits désignés et incuber à température ambiante pendant 2 h dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver chaque puits deux fois avec 200 ul de PBS, comme dans l&#39;étape 5.5. </li><li> Ajouter 50 ul / puits de tétrazolium (BCIP / NBT) solution de substrat de phosphate nitro bromochloroindolyl. taches de couleur pourpre apparaissent normalement en 5-15 min. </li><li> Ajouter 100 pl / puits de ddH 2 O pour empêcher le développement excessif de taches. </li><li> Rincer les plaques avec l&#39;eau du robinet après le développement complet de toutes les taches. </li><li> Retirez le dalot des plaques et leur permettre de sécher à l&#39;air dans l&#39;obscurité. </li><li> Compter les taches en utilisant un lecteur de plaque automatique avec une unité acquisition d&#39; image / d&#39;analyse (par exemple, un scanner automatique ou manuellement via un microscope à dissection). NOTE: Les plaques peuvent être stockées à température ambiante dans l&#39;obscurité et analysées plus tard. </li></ol>

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</ol>

L’auteur ne déclare aucun intérêt financier concurrent.

L&#39;isolement et la purification des cellules B du sang périphérique humain Normalement, les globules rouges peuvent être efficacement éliminées par rompues et le tampon de lyse (étape 1.2). Il est important de ne pas laisser incuber les PBMC avec le tampon de lyse des globules rouges supérieure à 5 min, comme la viabilité des cellules peut être affectée par le chlorure d&#39;ammonium. En variante, les globules rouges et les plaquettes peuvent être éliminés simultanément par le protocole suiv...

les cellules B jouent un rôle central dans le développement de l&#39;immunité humorale. Ils se développent d&#39;abord dans la moelle osseuse et entrent dans la circulation sanguine sous forme de cellules B naïves, qui peuvent migrer dans les tissus lymphoïdes, tels que la rate, les ganglions lymphatiques et amygdales, pour un développement ultérieur. Après Ag rencontre, certaines cellules B naïves migrent dans les follicules lymphoïdes, où les cellules du centre germinatif B peuvent se différencier en cellules de mémoire B et plasmoblastes (PBS) / cellules plasmatiques (PC). Alors que la plupart du PBS / PC de sortie dans le flux de sang, quelques éventuellement résident dans la moelle osseuse à subir une différenciation terminale dans les PC à long terme 1. Les cellules B en circulation sont hétérogènes, et à l&#39; état d&#39; équilibre, PB / PC sont rares dans le sang périphérique 2. En raison de la disponibilité de marqueurs de surface spécifiques à la lignée, la cytométrie de flux est devenue une méthode populaire pour l&#39;identification et la caractérisation des sous-ensembles de cellules B dans le sang périphérique. Une application prolongée de cytometr de fluxy est l&#39;addition d&#39;une fonction de tri de cellules, ce qui permet la séparation et l&#39;isolement des sous-ensembles individuels de cellules B avec une pureté élevée. Sur la base de l&#39;expression de récepteurs de surface spécifiques à différents stades de développement, des cellules B humaines en circulation sont généralement classés en trois sous - populations principales: les cellules B naïves (CD19 + CD27 - CD38 -), de cellules B à mémoire (CD19 + CD27 + CD38 -), et PB / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figure 1). Les cellules B naïves, par nature, ne sont pas rencontrées Ags. Cependant, ils peuvent être différenciées en cellules IgM + CD27 + B mémoire. Bien que les cellules B naïves sont homogènes en exprimant le récepteur de l&#39; antigène des lymphocytes B (BCR) -Associated molécules (par exemple, CD19, CD20 et CD22) , ils sont hétérogènes dans leur répertoire d&#39; immunoglobulines 5. La majorité des cellules CD27 + B mémoires peuvent être différenciées en CD27+ / CD38 + salut PB / PC 6. En outre, les cellules B mémoires et PB / PC sont polyclonaux et présentent une hétérogénéité de développement et fonctionnelle 4-7. PB / PC en circulation sont normalement de courte durée et n&#39;expriment CD138, mais celles faites à installer dans la moelle osseuse sera terminale différencier et de devenir à long terme. Terminally PC différenciées expriment CD138 et régulent les molécules de CD27 sur leurs surfaces 8. Étant donné que PB et PC sont capables de sécréter Abs, dans de nombreuses occasions, ils sont collectivement désignées comme ASCs. En revanche, ni les cellules B naïves ni les cellules B mémoires peuvent produire des quantités appréciables de Abs 9-10. Néanmoins, lorsqu&#39;il est isolé, les deux cellules B naïves et mémoires peuvent être différenciées en ASCs en 3 - 10 jours lorsqu&#39;il est placé dans les conditions de culture appropriées 6, 11-15. En fait, ASCs dérivés d&#39;actions in vitro de différenciation expressions de surface similaires de CD27 et CD38 avec ceux fr directement isoléle sang périphérique om 6. En outre, les ASCs différenciées in vitro expriment un faible niveau de CD20 de surface, comme celle de circulation PB / PC 6. Bien que les ASCs de culture dérivés sont de courte durée, ils peuvent sécrètent Abs, ce qui indique qu&#39;ils sont fonctionnellement compétents et capables de contribuer à l&#39;immunité humorale. Les deux ELISA et ELISpot sont de loin les méthodes les plus couramment appliquées avec qui pour obtenir des informations fonctionnelles sur la réponse immunitaire humorale. ELISA est un test basé sur une plaque de 96 puits, et il est souvent utilisé pour mesurer les titres de sérum Abs Ag-spécifique et d&#39; autres analytes (par exemple, des cytokines). Il est commode et évolutive. ELISA est conçu pour utiliser un dosage enzymatique en phase solide pour détecter la présence d&#39;Ac ou d&#39; autres substances, telles que le sérum, dans un échantillon liquide 16. Les lectures de tests ELISA sériques ont été largement utilisés pour représenter la réponse immunitaire du corps. Un outil nécessaire pour l&#39;acquisition de readouts de dosages ELISA est un lecteur de microplaques spectrophotométrique. Le lecteur peut déterminer la densité optique (DO) des produits finaux résultant généralement de la réaction de la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à Abs de détection et de leurs substrats spécifiques 17. En ce qui concerne le rapport de la réponse immunitaire humorale, les taux sériques Ab déterminés par ELISA indiquent le collectif, mais pas individuelle, le rendement de l&#39;ASC dans le corps. En outre, ELISA ne tient pas compte de la participation par les cellules B de mémoire, qui ne sécrètent pas Abs. Comme ELISA, ELISpot est une méthode largement utilisée pour détecter et surveiller la réponse immunitaire dans des échantillons de sang périphérique 17-18. ELISpot est une technique liée à un ELISA en sandwich. Dans ce document, les cellules sont placées dans le difluorure de polyvinylidène (PVDF) puits de membranes-backed de microplaques de 96 puits pour une culture à court terme. Le test ELISPOT est analogue à effectuer un transfert de Western sur une microplaque et developing, les taches sur la membrane de PVDF dans chaque puits. Un système de lecteur ELISpot automatisé ou un stéréomicroscope pour le comptage manuel est nécessaire. Le principal avantage d&#39;un test ELISPOT pour la détection d&#39;une réponse immunitaire est sa sensibilité exceptionnelle à la quantification des ASC et des cellules sécrétant des cytokines. Il rend compte de leurs activités fonctionnelles dans l&#39;immunité humorale et cellulaire, respectivement. Dans la mesure de la fonction immunitaire humorale, les taux sériques Ab déterminés par ELISA et le nombre de ASCs énumérés par ELISpot sont souvent corrélées, mais les lectures de données de ces deux essais ont des différences dans les implications fonctionnelles 19-20. Le principal avantage de ELISpot est sa sensibilité de la méthode. Le niveau de titres Ab sériques tel que rapporté par ELISA est présenté comme semi-quantitative des lectures de DO, indiquant le niveau Ab relative, ou plus quantitative, comme les lectures de concentration lorsqu&#39;une quantité connue des isotypes appropriés de Abs est inclus pour référence. En revanche, les résultats d&#39;un test ELISPOT sont presented comme le nombre absolu de ASCs dans un pool de cellules d&#39;intérêt (par exemple, des cellules non fractionnées périphériques mononucléaires du sang (PBMC) et des cellules B purifiées à partir de PBMC). ELISpot peut détecter une seule ASC, mais nécessite des quantités ELISA Ab à partir ASCs pour atteindre des concentrations d&#39;essai dépendant optimisées avant la mesure. Par conséquent, ELISpot est évidemment supérieure à ELISA de la sensibilité de la quantification. En outre, ELISpot est également adapté pour quantifier les ASCs différenciées in vitro à partir de cellules B à mémoire activés. les cellules mémoire B ne sécrètent pas Abs, mais peuvent se différencier en ASCs lors de l&#39;activation; ils ont donc aucune contribution à Abs sériques détectés par ELISA. Ainsi, ELISpot est la méthode de choix pour la mesure de la réponse immunitaire des cellules circulantes B mémoires après son activation en culture. Elle permet la surveillance de l&#39;entretien d&#39;une immunité humorale à long terme.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>tube de 10 mL</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>sans endotoxines</td></tr><tr><td>Trypan blue 0,5 % solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>IMag Kit d’enrichissement des lymphocytes B humains</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>CD27 biotinylé</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Microbilles magnétiques de streptavidine</td><td>BD Biosciences</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Crépine à mailles de nylon bleu, 40 &mu ; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Clone 302212 CD19-APC anti-humain</td><td></td><td></td><td>HIB19</td></tr><tr><td>CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>Clone O323</td></tr><tr><td>CD38-PE-Cy7 Biolegend</td><td></td><td>303516</td><td>clone HIT2&nbsp ;</td></tr><tr><td>Clone 560677 anti-humain CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>HIT2&nbsp ;</td></tr><tr><td>Clone 304006 CD45-FITC Biolegend</td><td></td><td></td><td>HI30</td></tr><tr><td>Clone 555482 CD45-FITC anti-humain</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>HI30</td></tr><tr><td>CD27-PerCP Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>124213</td> clone <td>LG.3A10</td></tr><tr><td>CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td> clone <td>L128</td></tr><tr><td>CD19-FITC Miltenyi</td><td>Biotec</td><td>130-098-064</td><td>Clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-humain CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>GTX75599</td><td>clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-humain CD20-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555622</td><td>clone 2H7</td></tr><tr><td>biotinylé anti-humain CD27</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>biotinylé anti-humain CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>7-aminoactinomycine D (7-AAD)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)&nbsp ;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>type B CpG</td></tr><tr><td>Humain recombinant IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A du S. aureus Cowan (SAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed mitogen (PWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>Plaques filtrantes MultiScreen, 0.45 &micro ; </td><td>Plaque filtrante stérile et transparente à 96 puits Merck Millipore MSIPS4510 avec membrane PVDF hydrophobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution BCIP/NBT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>Réactif unique BCIP/NBT, substrat de phosphatase alcaline</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>IgG humaines</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>IgG humaines, fragment Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 fragment d’Ig anti-humaine de chèvre (IgG + IgM + IgA)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline IgG de chèvre anti-humaine, spécifique du fragment Fc&gamma</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline IgM de chèvre, spécifique du fragment Fc et micro Jackson</td><td> ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>IgG-peroxydase humaine anti-humaine de chèvre, Fc&gamma ; spécifique du fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>IgM-peroxydase humaine de chèvre, Fc&micro ; spécifique du fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>BD ELISPOT AEC kit de substrat</td><td>BD Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur C.T.L. ImmunoSpot</td><td>C.T.L.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules b du sang: elispot comme indicateur fonctionnel de humorale immunité

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

La caractéristique de l&#39;immunité humorale est de générer ASCs fonctionnels qui synthétisent et sécrètent Ab spécifique à un antigène (Ag), par exemple un agent pathogène, et sont utilisés pour la défense de l&#39;hôte. Pour la détermination quantitative de l&#39;état fonctionnel de la réponse immunitaire humorale d&#39;un individu, à la fois sérique et d&#39;ABS ASCs de circulation sont généralement mesurés comme des lectures fonctionnelles. Chez l&#39;être humain, le sang périphérique est l&#39;échantillon le plus commode et facilement accessible, qui peut être utilisé pour la détermination de la réponse immunitaire humorale induite par les cellules hôtes B. sous-ensembles distincts de lymphocytes B, y compris les ASC, peuvent être isolés directement à partir du sang périphérique par sélection avec des microbilles conjuguées à Ab spécifique à la lignée ou par tri cellulaire par cytométrie de flux. De plus, les cellules B naïves et mémoire purifiés peuvent être activées et différenciées en ASCs en culture. Les activités fonctionnelles des ASC pour contribuer à la sécrétion Ab peuvent être quantifiés par ELISpot, qui est un essai enzyme qui convergetest de immunoabsorbance lié en (ELISA) et les technologies de transfert de Western pour permettre l&#39;énumération des ASCs individuelles au niveau d&#39;une seule cellule. En pratique, le test ELISpot a été de plus en plus utilisé pour évaluer l&#39;efficacité du vaccin à cause de la facilité de manipulation d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons de sang. Les procédés d&#39;isolement des cellules B humaines à partir de sang périphérique, de la différenciation des cellules B en ASCs in vitro, ainsi que l&#39;emploi d&#39; un test ELISPOT pour la quantification du nombre total IgM et IgG ASCs seront décrites ici.

PBMC ont été appauvries en globules rouges et des cellules adhérentes (étapes 01.02 à 01.07). Une aliquote (2 x 10 6) des cellules ont été soumises à une analyse par cytométrie de flux pour illustrer les populations de cellules B naïves, les cellules B à mémoire, et le PBS / PC dans le sang périphérique (figure 1). Dans les CMSP de ce donneur, environ 10% des lymphocytes sont des cellules B CD19 +. Dans le compartiment des cellules B, le pourcentage...

Le sang périphérique humain est couramment utilisé pour l’évaluation de la réponse immunitaire humorale. Ici, les méthodes permettant d’isoler les lymphocytes B humains du sang périphérique, de différencier les lymphocytes B humains en cellules B sécrétant des anticorps (AB) en culture et d’énumérer les ASC IgM et IgG totales via un test ELISpot sont décrites.

L&#39;isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

L'objectif général de cette méthodologie ELISpot est de permettre la quantification de cellules B sécrétant des anticorps humains à partir du sang. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biomédical concernant l'immunologie des cellules B et la recherche vaccinale. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à détecter et à mesurer les cellules B sécrétant des anticorps au niveau individuel de la cellule.La procédure sera démontrée par Tsung-Chih Tseng, étudiant diplômé de mon laboratoire. Immédiatement après avoir prélevé un échantillon de sang de 10 ml à partir de la veine cubitale médiane dans un tube de 15 ml contenant de l'EDTA supplémenté en potassium, retourner le tube plusieurs fois pour empêcher la formation de caillots. Ensuite, ajouter 35 ml de tampon de lyse des globules rouges stérilisé à la vapeur d'eau aux cellules, puis incuber pendant cinq minutes à température ambiante.Lorsque la lumière est visible à travers le tube, centrifuger le sang et confirmer la présence d'un culot blanc. Éliminer le tampon de lyse résiduel avec 10 ml de PBS stérilisé et remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieu RPMI 1640. En

the-isolation-differentiation-quantification-human-antibody-secreting

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Identification de cibles microbiennes de l'immunité adaptative dans les maladies idiopathiques qui peut être accompli par l'utilisation du dosage immuno-enzymatique.

ELISA immunospot (ELISPOT): Quantification des Th-1 réponses immunitaires cellulaires contre des antigènes microbiens

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement des lymphocytes B du sang périphérique humain à l’aide d’anticorps biotinylés spécifiques des lymphocytes non B et de microbilles magnétiques conjuguées à la streptavidine.

Isolement et purification des lymphocytes B du sang périphérique humain

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole pour le tri basé sur la cytométrie en flux des sous-populations de lymphocytes B naïfs, de lymphocytes B mémoires et de plasmocytes plasmablastiques à partir de lymphocytes B du sang périphérique humain. Les différentes sous-populations de lymphocytes B peuvent être distinguées en fonction de la liaison d’anticorps à base de fluorophores aux récepteurs CD19, CD27 et CD38 exprimés à la surface des lymphocytes B, suivie d’un tri cellulaire.

Tri cellulaire basé sur la cytométrie en flux pour différentes populations de lymphocytes B circulatoires

Cette vidéo montre l’utilisation du test ELISpot pour évaluer la fonction des lymphocytes B sécrétant des anticorps, les ASC. Les anticorps sécrétés par les ASC interagissent avec les fragments d’anticorps polyclonaux liés à la membrane, qui sont détectés par les anticorps IgG ou IgM conjugués aux enzymes. La tache colorée produite dans chaque puits indique la présence de l'isotype spécifique de l'anticorps, qui est en corrélation avec l'activité sécrétoire des lymphocytes B.

Évaluation fonctionnelle des lymphocytes B sécrétant des anticorps à l’aide du dosage ELISpot

Générations nouveaux de dosages fonctionnels, tels que l'interféron gamma (IFN-γ) ELISpot, qui détecte la production de cytokines au niveau de la cellule unique et fournissent à la fois la caractérisation quantitative et qualitative des réponses des cellules T peuvent être utilisés pour évaluer les réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre la varicelle zoster virus (VZV).

Développement d&#39;une varicelle-zona immunité à médiation cellulaire spécifique-Virus IFN-γ ELISPOT pour évaluer la suite de cordon ombilical transplantation de sang

Une méthode simple mais efficace qui utilise des nanoparticules magnétiques pour détecter et enrichir les cellules B antigène réactif pour l'analyse fonctionnelle et phénotypique est décrite.

Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l&#39;antigène pour l&#39;analyse des Phénotype et fonction

Nous décrivons une méthode pour la production d’anticorps humains spécifiques pour un antigène d’intérêt, à partir de rares cellules B circulant dans le sang humain. Génération de ces anticorps naturels est efficace et rapide, et les anticorps obtenus peuvent distinguer les antigènes fortement connexes.

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

Dans cet article, nous décrivons un protocole afin de caractériser les T-dépendants et indépendants de T les réponses isotype immunoglobuline (Ig) chez la souris à l’aide d’ELISA. Cette méthode utilisée seule ou en combinaison avec écoulement cytometry permettra aux chercheurs d’identifier les différences dans les réponses d’isotype Ig médiée par les lymphocytes B chez les souris après vaccination antigène T-dépendants et indépendants de T.

Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay

La méthode BSelex pour identifier et récupérer les anticorps individuels spécifiques à l'antigène des cellules mononucléaires périphériques humaines combine la cytométrie du flux avec pcR à cellule unique et le clonage.

Méthode de dépistage à cellule unique pour la sélection et la récupération d'anticorps ayant les spécificités souhaitées des populations enrichies de cellules de la mémoire humaine B

Les immunodosages à base de sang total constituent un outil facile et économe en ressources pour analyser l’immunité spécifique de l’antigène à des fins de diagnostic et de recherche. Cet article fournit un protocole optimisé à base de sang total avec double co-stimulation pour une analyse complète de l’immunité de l’hôte contre les agents pathogènes fongiques et viraux, y compris une version à faible volume pour les patients pédiatriques et les petits animaux.

Dosage du sang total avec double costimulation pour l’analyse spécifique de l’antigène de l’immunité de l’hôte contre les agents pathogènes fongiques et viraux

Découvrez l'isolement et la différenciation des cellules B sécrétant des anticorps humains du sang périphérique. Cette méthode ELISpot permet la quantification des cellules sécrétant des IgM et IgG au niveau cellulaire unique pour la recherche vaccinale.

Lisolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité (Vidéo) | JoVE Journal

L'isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

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