Formation des granules de stress lors de l’infection à Shigella des cellules épithéliales cancéreuses

Commencez par une plaque multi-puits contenant des cellules épithéliales cancéreuses adhérentes sur une bâche de revêtement.

Ajoutez Shigella flexneri, une bactérie pathogène.

Centrifugez la plaque pour favoriser le contact bactérien avec les cellules, puis incubez.

Grâce à un système de sécrétion spécialisé, Shigella injecte des protéines de virulence dans les cellules épithéliales.

Ces protéines de virulence modulent le système de signalisation épithéliale, facilitant l’absorption bactérienne.

À l’intérieur des cellules, les bactéries continuent de sécréter des protéines de virulence, qui perturbent la traduction cellulaire et accumulent des ARNm non traduits.

Les protéines de liaison et de signalisation à l’ARN s’agrégent avec les ARNm non traduits, formant des granules cytoplasmiques sans membrane appelées granules de stress.

Jetez le média et lavez pour éliminer les bactéries détachées.

Ensuite, ajoutez un substrat de culture préchauffé complété par de la gentamicine pour éliminer les bactéries fixées à la surface.

Ajoutez un fixateur pour préserver les structures cellulaires et les granules de stress.

Jetez le fixateur et lavez avec un léger secouement pour éliminer les résidus du fixateur.

Les cellules sont prêtes pour une coloration par immunofluorescence afin de visualiser les granules de stress induits par Shigella.

Remplacer le lavage par 500 microlitres de milieu d’infection par puits, puis centrifuger la plaque à 24 puits pour faire tourner les bactéries vers les cellules.

Transférez les cocultures bactériennes déposées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour faciliter l’infection des cellules hôtes.

À la fin de l’incubation, retirez les bactéries exogènes des cellules avec trois rinçages dans 1 millilitre de milieu de culture HeLa frais à 37 degrés Celsius par lavage.

Ensuite, couvrir les cellules infectées d’un millilitre de milieu de culture frais contenant de la gentamicine et renvoyer la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.

Après une heure, aspirez complètement le surnageant et fixez les échantillons dans 0,5 millilitre de paraformel à 4 % à température ambiante dans PBS pendant 30 minutes.

Ensuite, jetez le fixateur dans le contenant approprié pour déchets, puis lavez les couvertures avec 1 millilitre de solution physiologique tri-tamponnée pendant deux minutes en secouant doucement.