L'analyse du transcriptome des cellules isolées

L'objectif général de cette procédure est de préparer des échantillons à partir de cellules uniques en vue d'une analyse du transcriptome. Cela est réalisé en premier lieu en identifiant une cellule appropriée pour l'isolement. La micropipette est ensuite positionnée à côté de la cellule à isoler.

Ensuite, une aspiration est appliquée à la seringue jusqu'à ce que la cellule soit tirée à l'intérieur de l'embout de la micropipette. La dernière étape du protocole consiste à casser l'embout de la micropipette dans le tube de collecte et à expulser le contenu restant de la micropipette dans ce tube. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant des différences entre les populations d'ARNm de cellules grâce à une analyse par puces à ADN du matériel amplifié par la méthode d'amplification d'arn, également décrite dans le protocole, ou pour d'autres applications telles que la PCR ou le séquençage de nouvelle génération.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations et révéler les différences entre cellules uniques, elle peut également être appliquée à des compartiments subcellulaires tels que les dendrites ou des classes de dendrites, et fournir des renseignements importants sur la fonction dendritique. La procédure sera démontrée par Jennifer Singh, postdoctorante dans mon laboratoire. Avant le début de ce protocole, des neurones primaires provenant du jour embryonnaire 18 de l’hippocampe de rat ont été ensemencés sur des lamelles de 12 millimètres dans une boîte de 35 millimètres et maintenus comme décrit dans le protocole écrit. Pour préparer les pipettes destinées au prélèvement, utilisez un tireur de micropipettes afin d’étirer des pipettes en verre stérilisées jusqu’à un diamètre approprié pour l’électrophysiologie.

À l'aide du programme prédéfini du fabricant, la taille du diamètre n'est pas critique, car la pointe sera rompue avant la collecte des cellules. Conserver soigneusement les pipettes dans un environnement exempt de poussière, par exemple dans un récipient de stockage pour micro-pipettes, afin que les pointes restent intactes jusqu'au moment de la récolte des cellules. Préparer le nombre souhaité de tubes Eppendorf de 1,7 millilitre en ajoutant deux microlitres de PBS pour le stockage du matériel récolté.

Retirer une boîte de 35 millimètres contenant des lamelles de l’incubateur dans une hotte de culture tissulaire. Transférer rapidement une lamelle de cette boîte vers le couvercle d’une nouvelle boîte de 35 millimètres contenant du HBSS. Il est essentiel de replacer au plus vite les lamelles non manipulées dans l’incubateur, car les cellules deviennent alors non viables.

Si elles sont laissées à l’air pendant de longues périodes. Un microscope inversé équipé d’un objectif 40 x et d’un micromanipulateur est nécessaire pour la récolte des cellules. Utilisez un support pour pipette muni d’un tube souple qui s’éloigne du support, et fixez le tube à une surface stable afin d’éviter tout déplacement involontaire de la pipette pendant la collecte.

À l'extrémité du tube, insérez une aiguille afin qu'une seringue d'un millilitre avec une connexion à verrouillage puisse être fixée et changée entre chaque utilisateur. Préparez la micropipette en cassant délicatement la pointe de manière contrôlée : tendez un essuie-tout entre les doigts d'une main et effleurez très doucement la pointe de la pipette sur le papier une à deux fois. L'ouverture doit représenter environ 75 à 100 % de la taille de la cellule cible.

Fixez la micropipette dans le support de micropipette et attachez le support de micropipette à l'insert des micromanipulateurs. Enfin, mettez en place l'objectif 40 x. Placez la boîte sur la platine du microscope et repérez une région de cellules appropriée pour la récolte.

Dans le cas de cultures neuronales primaires, la cellule doit être relativement isolée de ses voisines. Pour éviter la récolte de cellules ou de prolongements environnants, placer la cellule à récolter au centre du champ de vision. Utiliser le micromanipulateur pour avancer la micropipette vers la solution dans la boîte, en la positionnant dans le trajet de la lumière.

Abaissez la pointe de la pipette dans la solution. En regardant à travers l'oculaire, la pipette doit apparaître comme une ombre dans le champ de vision. Appliquez une pression positive à partir de ce moment en soufflant légèrement à travers la seringue bien au-dessus du plan des cellules.

Ajustez la position de la pointe de pipette jusqu'à ce qu'elle se trouve dans le champ de vision, puis mettez-la au point à l'aide des boutons de réglage grossier. À ce stade, évaluez si le diamètre de la pointe est trop grand ou trop petit. Si le diamètre est incorrect, remplacez la micropipette par une autre jusqu'à ce que le diamètre approprié soit trouvé afin d'éviter la rupture de la pipette dans la zone de prélèvement.

Utilisez le réglage grossier pour faire avancer le plan focal avant de rapprocher la pointe de la pipette des cellules à l’aide des micromanipulateurs. Au fur et à mesure que les cellules deviennent plus proches, utilisez le réglage fin jusqu’à ce que les cellules et la pointe de la pipette soient toutes deux au point. Cessez d’appliquer une pression positive avant d’atteindre les cellules cibles afin d’éviter de les détacher du coverslip.

Positionnez la pointe de pipette à l’aide des micromanipulateurs de manière à ce qu’elle touche le soma de la cellule à prélever. À l’aide de la seringue, appliquez une aspiration douce par la bouche jusqu’à ce que la cellule pénètre dans la pointe de pipette. Si la cellule n’entre pas dans la pipette, rapprochez délicatement la pointe de la cellule et abaissez-la légèrement jusqu’à ce que la cellule se détache du coverslip.

Utilisez le micromanipulateur pour déplacer immédiatement la pipette vers le haut et hors de la solution. Retirez la pipette du support. Tenez le tube Eppendorf de 1,7 millilitre préparé dans une main et cassez doucement l'extrémité de la pipette contre la paroi du tube, près du fond.

En visant la marque de 0,1 millilitre et en centrant l'extrémité cassée à l'intérieur du tube, insérez une aiguille fixée à une seringue d'un millilitre dans l'ouverture supérieure de la pipette. Appuyez rapidement sur le piston, forçant la solution contenue dans la pipette à être projetée dans le tube. Veillez à ne pas toucher l'extrémité au liquide présent sur les parois du tube.

Étant donné que l'action capillaire ramènera le liquide dans la pipette, la cellule doit rester située à l'extrémité même de la pipette, ce qui devrait suffire pour expulser correctement la cellule. Faire centrifuger rapidement le contenu du tube à l'aide d'une microcentrifugeuse de table, puis congeler sur de la glace sèche ou placer sur de la glace pour un traitement ultérieur ou d'autres applications telles que la PCR ou le séquençage de nouvelle génération. On voit ici un exemple de récolte réussie d'un neurone isolé.

Pour commencer, une région de cellules présentant une densité relativement faible a été sélectionnée. La pointe de pipette a ensuite été avancée vers la cellule souhaitée. Ici, le champ de vision est montré après que la cellule ait été récoltée.

Remarquez que les processus environnants restent sur la lame. Inversement, cette figure montre deux images d'embouts de pipette, dont la taille est inappropriée pour une récolte efficace. Cet embout entraînera une récolte incomplète, tandis que l'embout illustré ici conduira à la récolte du milieu environnant.

Après la récolte et une analyse d'amplification ARN, l'utilisation d'un bioanalyseur est recommandée afin d'examiner la distribution et la quantité d'ARN amplifié. Une amplification réussie à partir de matériel unicellulaire produira des quantités totales de l'ordre du faible microgramme et présentera une distribution lisse et large. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes si elle est effectuée correctement ; toutefois, il est essentiel d'employer des techniques sans ARN pendant cette procédure.