L'analyse du transcriptome des cellules isolées

L’objectif général de cette procédure est de préparer des échantillons de cellules uniques pour l’analyse du transcriptome. Pour ce faire, il faut d’abord trouver une cellule adaptée à l’isolement. La micro pipette est ensuite positionnée à côté de la cellule à isoler.

Ensuite, l’aspiration est appliquée à la seringue jusqu’à ce que la cellule soit tirée dans l’extrémité de la micro-pipette. La dernière étape de la procédure consiste à casser la pointe de la micropipette dans le tube de collecte et à déjecter le contenu restant de la micropipette dans le tube. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des différences dans les populations d’ARNm entre les cellules grâce à l’analyse sur microréseau de matériel amplifié à l’aide de la méthode d’amplification de l’arna, également décrite dans le protocole ou pour d’autres applications telles que la PCR ou le séquençage de nouvelle génération.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations et les différences entre les cellules individuelles, elle peut également être appliquée aux compartiments subcellulaires tels que les dendrites ou les classes de dendrites, et fournir des informations importantes sur la fonction des dendrites. Avant le début de ce protocole, les neurones primaires du 18e jour embryonnaire, le rat Hippo Campi ont été plaqués sur des lamelles de 12 millimètres dans une parabole de 35 millimètres et maintenus comme décrit dans le protocole écrit. Pour préparer les pipettes pour la récolte, utilisez un extracteur de micro-pipettes pour tirer les pipettes en verre de l’autoclave à un diamètre approprié pour l’électrophysiologie.

En utilisant le programme prédéfini du fabricant, la taille de l’alésage n’est pas critique car la pointe sera cassée avant la collecte des cellules. Rangez soigneusement les pipettes dans un environnement à l’abri de la poussière, tel qu’un bocal de stockage de micro-pipettes, où les pointes resteront intactes au moment de prélever les cellules. Préparez le nombre souhaité de tubes d’acier de 1,7 millilitre en ajoutant deux microlitres de PBS pour le stockage du matériel récolté.

Retirez 1 boîte de 35 millimètres de lamelles de l’incubateur dans une hotte de culture tissulaire. Transférez rapidement un couvercle de ce plat sur le couvercle d’un nouveau plat de 35 millimètres contenant du HBSS. Il est essentiel de retourner les lamelles qui ne sont pas manipulées dans l’incubateur lorsque les cellules deviennent malsaines.

S’il est laissé à l’écart pendant de longues périodes. Un microscope à lumière inversée avec un objectif 40 x équipé d’un micromanipulateur est nécessaire pour la récolte de cellules. Utilisez un porte-pipette avec un tube flexible s’éloignant du support, fixez le tube sur une surface stable pour éviter tout mouvement indésirable de la pipette pendant le prélèvement.

À l’extrémité du tube, insérez une aiguille de manière à ce qu’une seringue d’un millilitre avec un raccord de verrouillage de leurre puisse être fixée et changée entre les utilisateurs. Préparez la micropipette en cassant la pointe de manière contrôlée en tenant une lingette Kim tendue entre les doigts d’une main et en brossant très doucement la pointe de la pipette sur le papier une à deux fois. L’ouverture doit être d’environ 75 à 100 % de la taille de la cellule cible.

Fixez la micropipette dans le support de micro-pipette et fixez le support de micro-pipette à l’insert des micromanipulateurs. Enfin, fixez l’objectif 40x. Placez la boîte sur la platine du microscope et trouvez une région de cellules adaptée à la récolte.

Dans le cas des cultures neuronales primaires, la cellule doit être relativement isolée de ses voisines. Pour éviter la récolte des cellules environnantes et/ou des processus, placez la cellule à récolter au centre du champ de vision. Utilisez le micromanipulateur pour faire avancer la micropipette vers la solution dans le plat dans le trajet de la lumière.

Abaissez la pointe de la pipette dans la solution. En regardant à travers l’oculaire, la pipette doit apparaître comme une ombre dans le champ de vision. Appliquez une pression positive à partir de ce point en soufflant légèrement à travers la seringue bien au-dessus du plan des cellules.

Ajustez la position de la pointe de la pipette jusqu’à ce qu’elle soit dans le champ de vision et faites la mise au point sur la pointe de la pipette à l’aide des boutons de mise au point. À ce stade, évaluez si la taille de l’alésage de la pipette est trop grande ou trop petite. Si la taille de l’alésage est incorrecte, remplacez-la par une autre micro-pipette jusqu’à ce que la taille d’alésage correcte soit trouvée pour éviter la casse de la pipette dans la zone de collecte.

Utilisez le foyer de parcours pour faire avancer le plan focal avant d’avancer la pointe de la pipette vers les cellules à l’aide des manipulateurs microm. Au fur et à mesure que les cellules se rapprochent, utilisez la mise au point fine jusqu’à ce que les cellules et la pointe de la pipette soient nettes. Arrêtez d’appliquer une pression positive avant d’atteindre les cellules du demandeur pour éviter de les faire sauter de la lamelle.

Positionnez la pointe de la pipette à l’aide des micromanipulateurs de manière à ce qu’elle touche le soma cellulaire à récolter. À l’aide de la seringue, appliquez une légère aspiration par la bouche jusqu’à ce que la cellule pénètre dans la pointe de la pipette. Si la cellule n’entre pas dans la pipette, rapprochez doucement l’embout de la cellule et descendez-le jusqu’à ce qu’il se soulève de la lamelle.

À l’aide du micromanipulateur, vous pouvez immédiatement déplacer la pipette vers le haut et hors de la solution. Retirez la pipette du support. Tenez le tube einor de 1,7 millilitre préparé dans une main et cassez doucement la pointe de la pipette sur le côté du tube vers le bas.

En visant la marque de 0,1 millilitre avec l’embout cassé centré à l’intérieur du tube, insérez une aiguille attachée à une seringue d’un millilitre dans l’ouverture supérieure de la pipette. Appuyez rapidement sur le piston, forçant la solution dans la pipette à se projeter dans le tube. Veillez à ne pas toucher l’embout à un liquide sur les côtés du tube.

Comme l’action capillaire ramènera le liquide dans la pipette, la cellule doit rester à l’extrémité de la pipette, ce qui doit être suffisant pour expulser correctement la cellule. Faites rapidement tourner le contenu du tube à l’aide d’une micro-fuge de bureau et congelez-le sur de la glace carbonique ou placez-le sur de la glace pour un traitement ultérieur ou pour d’autres applications telles que la PCR ou le séquençage de nouvelle génération. Voici un exemple de récolte réussie d’un neurone isolé.

Pour commencer, une région de cellules de densité relativement faible a été sélectionnée. La pointe de la pipette a ensuite été avancée vers la cellule souhaitée. Ici, le champ de vision est montré après que la cellule a été récoltée.

Notez que les processus environnants restent sur le bordereau de couverture. À l’inverse, cette figure montre deux images de pointes de pipette, dont la taille est inappropriée pour une récolte efficace. Cette astuce conduira à une récolte incomplète tandis que la pointe montrée ici entraînera une récolte du milieu environnant.

Après la récolte et une analyse d’amplification de l’ARN, il est recommandé d’utiliser un bioanalyseur pour examiner la distribution et la quantité d’ARN amplifié. Une amplification réussie à partir d’un matériau unicellulaire donnera des quantités totales de l’ordre de quelques microgrammes et aura une distribution lisse et large Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes si elle est effectuée correctement lors de l’exécution de cette procédure, il est important d’utiliser la technique sans ARN.