Name: Lanalyse du transcriptome des cellules isolées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Apprenez l'analyse du transcriptome de cellules isolées chez le rat à l'aide de l'amplification aRNA. Cette méthode permet d'étudier l'hétérogénéité de l'expression génique au niveau cellulaire unique.

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Merci à Kevin Miyashiro pour le placage et le maintien des cultures de cellules, le Dr Terri Schochet pour fournir des cultures de cellules pour les photos incluses dans ce document. En outre, merci à Kevin Miyashiro, le Dr Peter Buckley, et Tiina Pertiz pour l&#39;entrée sur la procédure ARNa. Le financement de ce travail a été de l&#39;Institut national sur le vieillissement, l&#39;Institut national sur la santé mentale et les fonds des ressources humaines enquêteur du Commonwealth de Pennsylvanie.

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
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<li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis%3A+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neeurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li>
<li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+synthesis+in+situ%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enxymol%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li>
<li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li>
<li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Eviron%22%5BJournal%5D)">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Megascript+kit%22">Megascript kit</a>. , Ambion. 7-8 Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MEGAclear+kit%22">MEGAclear kit</a>. , Applied Biosystems. 4-5 Forthcoming.</li>
<li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
<li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li>
<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

Dr Eberwine est un inventeur sur le brevet ARNa qui a été autorisée aux technologies de LBS dans lequel le Dr Eberwine est un actionnaire.

Notes et Dépannage <ul><li> Vous voudrez peut-être à prendre avant et après des images montrant que la cellule cible a été isolé et que la pénombre reste a été laissé intact. </li><li> Si trop de solution est d&#39;entrer la pipette que vous récoltez, vous pouvez utiliser 3 voies Luer-Lock et le piston de la seringue pour tenir la pression positive dans le tube. Le volume désiré varie avec le type de traitement, mais jusqu&#39;à 5 ul devrait être bon pour la plupart des applications. </li></ul> Conseils généraux sur les techniques de biologie moléculaire <ul><li> Vortex tous les tubes des stocks et les spin-down avant d&#39;ajouter à une réaction. JAMAIS enzymes vortex. </li><li> Bien mélanger avant d&#39;ajouter les réactions de l&#39;enzyme de s&#39;assurer que le tampon est à la concentration appropriée. </li><li> Maintenir les stocks d&#39;enzymes à -20 ° C, si possible en utilisant un stratacooler. Sinon, retirez juste avant utilisation, garder sur la glace, et revenir immédiatement à -20 ° C. </li><li> Toujours faire master mix lors de la préparation plus d&#39;une réaction de réduire les erreurs de pipetage. Calculer le volume nécessaire en fonction du nombre d&#39;échantillons et d&#39;ajouter 10-20%. </li><li> Magasin de l&#39;ARN à -80 ° C à retarder la dégradation. L&#39;ARN est plus stable stocké dans le tampon d&#39;apurination retardent d&#39;ARN qui se produit dans des conditions acides. </li></ul> Aperçu général de la procédure ARNa Figure 4A illustre le premier tour de la procédure ARNa. Dans la réaction du premier brin, la portion de poly-T de la T7-oligo (dT) primer sélectionne des espèces d&#39;ARNm (long rectangle blanc) en se liant à la queue polyA. Certains microARN sont également polyadénylé et sera capturé par cette procédure. Plus important, cependant, les ARN les plus abondants dans la cellule, les ARN ribosomal, ne sera pas. Cet oligo agit comme une amorce pour la transcriptase inverse pour synthétiser un brin complémentaire de l&#39;ADNc (rectangle gris de long) en utilisant l&#39;ARNm comme un modèle. La portion de la T7 T7-oligo (dT) primer intègre le promoteur T7 RNA polymérase en phase avec la séquence antisens de l&#39;ARNm de départ. Ceci est utilisé plus tard dans la réaction de transcription in vitro. Ensuite, l&#39;ARNm dans les hybrides ARNm / ADN créée à l&#39;étape précédente est partiellement hydrolysé par la RNAse H créant ARN &quot;amorces&quot; (petits rectangles blancs) semblables à des fragments d&#39;Okazaki créé dans la synthèse des brins d&#39;ADN à la traîne. ADN polymérase I utilise des fragments d&#39;ARN pour la synthèse d&#39;ADN premiers en utilisant l&#39;ADN complémentaire de l&#39;ARNm comme un modèle. Quand il atteint le fragment suivant l&#39;ARN, son extrémité 5 &#39;à 3&#39; activité nucléase supprime les ribonucléotides et les remplace par des désoxyribonucléotides. L&#39;ADN ligase est ajoutée à ligaturer les brins où le remplacement du brin leader n&#39;est pas complète. ADN polymérase T4 est ajouté pour combler dans les zones où des fragments d&#39;ARN servi comme amorces initiales pour l&#39;ADN polymérase I de créer une extrémité franche ADNc double brin qui est ensuite purifié avant d&#39;effectuer la réaction d&#39;IVT. Dans la réaction d&#39;IVT, T7 RNA polymérase se lie au promoteur T7 incorporée dans les molécules d&#39;ADNc double brin et synthétise l&#39;ARN antisens (longs rectangles noirs) en utilisant le brin sens comme un modèle. Cela sert l&#39;étape d&#39;amplification dans lequel des milliers de molécules d&#39;ARN antisens sont produites à partir de chaque molécule ADNc double brin (figure 4A). Le second tour, comme le montre la figure 4B, commence par une réaction de transcription inverse qui est légèrement différent de celui de la première ronde depuis les ARN antisens de départ est (solide rectangle noir) et n&#39;a pas la queue polyadénylée qui était ciblé par la T7-oligo (dT) amorce dans le premier tour. Par conséquent, cette réaction est amorcée avec des amorces aléatoires (petits rectangles gris) et la suite dénaturé ARN. La réaction du deuxième brin est alors amorcée par la T7-oligo (dT) primer, qui se lie à la séquence poly-A à l&#39;extrémité 3 &#39;de l&#39;ARN sens créé dans la réaction de transcription inverse précédent. Une autre réaction d&#39;IVT est effectuée de la même manière que dans le premier tour. Ce second tour est habituellement répétée au moins une fois à atteindre trois cycles d&#39;amplification d&#39;une seule cellule. Applications Les techniques que nous avons présenté dans cet article peuvent être traduits dans un grand nombre d&#39;applications. Le protocole seule cellule d&#39;isolement peut être modifié pour une utilisation dans des tranches aiguës. 14 Bien que techniquement plus difficile, les mêmes principes s&#39;appliquent dans cette préparation suppléant. De plus, si la taille de la pipette est légèrement ajustée, les enregistrements de la physiologie des cellules peut être faite avant la récolte permettant de mener une enquête bien contrôlée des mécanismes moléculaires à l&#39;origine des sorties physiologiques. Une autre légère modification est d&#39;isoler les processus du soma cellulaire. 15 Pour cette application, de recueillir les corps cellulaires avec une pipette et ensuite revenir avec une nouvelle pipette et recueillir 100-300 dendrit identifiées ou des axones par tube de collecte 16. Une fois que les cellules ont été récoltées, les comparaisons des abondances ARNm et compositions peuvent être faites entre différents et même au sein des populations même cellule. Incorporer biotinylé-UTP dans le ARNa troisième tour permet l&#39;analyse des microréseaux afin de déterminer ces abondances relatives d&#39;ARNm. La composition de la population d&#39;ARNm d&#39;origine peut aussi être déterminé après la procédure ARNa utilisant le séquençage de nouvelle génération. Le ARNa amplifié peut également être utilisée pour confirmer les études cellulaires phénotype de conversion dans laquelle un ensemble complet d&#39;ARNm d&#39;un type de cellules sont transfectées dans un type cellulaire différent afin d&#39;induire la transition du phénotype de type cellule dernier dans celui de l&#39;ancien, une procédure développée par le laboratoire et connu sous le nom TIPER. 17 Ces études sont particulièrement utiles pour étudier les états pathologiques et les phénotypes cellulaires et des études sont actuellement en cours dans le laboratoire. RT-PCR ou PCR quantitative peut être effectuée sur le matériel amplifié pour confirmer l&#39;expression de gènes spécifiques de la cellule. En outre, les évaluations de l&#39;efficacité de la transfection ou la transduction peut être faite au niveau de la cellule unique. Avantages et limites Comme indiqué dans l&#39;abstrait, l&#39;isolement de cellules uniques pour l&#39;analyse élimine les effets de la moyenne observée avec l&#39;analyse de populations cellulaires hétérogènes. Ces effets moyenne dénaturer l&#39;abondance d&#39;ARNm dans une cellule unique par une sur-représentation des transcriptions abondante et une moyenne de sortir et éviter la détection de nombreux pays à faible abondance de transcriptions. La cytométrie en flux peut être utilisé pour trier des cellules individuelles, mais cette méthode nécessite la connaissance de la cellule des marqueurs spécifiques et des équipements coûteux. 18 microdissection laser, soit avec des systèmes laser UV ou IR microdissection permettent de cellule unique et même capturer subcellulaire, mais nécessite des cellules d&#39;intérêt pour être situés à la surface des sections très minces. 19 Similaire à la cytométrie en flux, microdissection laser nécessite également un équipement coûteux. Un des principaux avantages de la technique de collecte électrode à base décrit ci-dessus est que de précieuses données électrophysiologiques peuvent être obtenus auprès de la cellule d&#39;intérêt avant la récolte, permettant une analyse fonctionnelle et du transcriptome à effectuer sur la même cellule. 20 Un inconvénient de notre technique est qu&#39;elle exige une expérience en utilisant micromanipulateurs. Les enquêteurs familiers avec micromanipulateurs trouverez cette technique très intuitive, cependant, les individus qui n&#39;ont aucune expérience de ce type devra se familiariser avec les mouvements fins requises. Inhérentes à toute technique d&#39;amplification est l&#39;amplification préférentielle de certaines transcriptions basée sur la taille et la composition des nucléotides. 4,6,7 réaction en chaîne par polymérase (PCR) des techniques basées telles que transcription inverse réaction en chaîne de la polymérase (RT-PCR) et amplification rapide de l&#39;ADNc extrémités (RACE) résulte de l&#39;amplification exponentielle de transcriptions, tandis que les résultats ARNa procédure d&#39;amplification de l&#39;amplification linéaire. Ainsi, l&#39;un des principaux avantages de la procédure ARNa réside dans sa capacité à mieux préserver l&#39;abondance relative des transcrits d&#39;ARNm par seulement linéairement amplifiant les erreurs ou les préjugés qui se produisent dans le processus d&#39;amplification exponentielle par rapport à l&#39;amplification dudit erreurs et de préjugés. La procédure ARNa couplée à l&#39;analyse des microréseaux permet la comparaison des abondances d&#39;ARNm entre les cellules simples de morphologie similaire ou différente, traitée ou non traitée. En outre, les produits d&#39;amplification peuvent être soumises pour le séquençage de nouvelle génération. 5,8 Cependant, des précautions doivent être prises dans de telles analyses, car, contrairement à l&#39;utilisation d&#39;amorces aléatoires pour la procédure, la procédure d&#39;oligo-dT amorcée décrit ci-dessus l&#39;amplification des préjugés de l&#39; extrémités 3 &#39;des ARNm et aboutit généralement à léger raccourcissement du matériel amplifié suite à chaque tour. Des précautions doivent être prises dans l&#39;analyse des résultats puce à ADN avec des méthodes standard comme certains faux appels absents peuvent découler de matériel amplifié légèrement raccourcie. En outre, les résultats tout en séquençage sera en effet fournir la pleine 5 &#39;la séquence de la plupart des ARNm d&#39;origine, les séquences 5&#39; de certains ARNm pourrait être manquée. Pour ces raisons, le nombre de tours d&#39;amplifications devrait être limité.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>Coverslips Spiegelgas</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture Nunc 35x10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Eau pour la culture cellulaire</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>Pour la préparation des solutions utilisées pour la culture cellulaire et le rinçage des lamelles</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine PM70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>Laminine, ultrapure</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>MEM avec Earle&amp;rsquo;s sels et GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>Pour la mise en culture des cellules</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine bêta-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>MEM avec Earle&amp;rsquo;s sels et L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>Pour la culture de cellules</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Supplément sans sérum B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Tubes capillaires en verre borosilicaté (diamètre extérieur de 1,5 mm, longueur de 100 mm)</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>Toute pipette en verre borosilicaté conviendra, pourvu que la taille appropriée du diamètre interne soit obtenue. </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>Toute solution conviendra pourvu que les composants ne soient pas volatils&amp;rsquo;ne pas interférer avec tout traitement ultérieur (c'est-à-dire sans Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; ou Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>seringue de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Le calibre dépend du diamètre des pipettes</td></tr><tr><td>mélange de dNTP</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7 oligo</td><td>Personnalisé</td><td>Midland Certified</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de deuxième brin (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>Fourni avec un tampon pour le deuxième brin</td></tr><tr><td>Ligase d'ADN d'E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Kit Megascript T7</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Amorces aléatoires</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>dans le kit (18080-044) est fourni avec le tampon de première chaîne (Y02321) et le DTT</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polymérase</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'amplification ARN Illumina TotalPrep</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetteuse chauffante/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter possède de nombreux autres modèles, dont beaucoup sont abordés dans le manuel pratique</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>De nombreux autres micromanipulateurs peuvent être utilisés, comme les modèles plus récents d'Eppendorf</td></tr><tr><td>Support pour pipette</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>Variera selon le micromanipulateur et le diamètre extérieur de la pipette.</td></tr><tr><td>Kit Bioanalyzer RNA 6000 Nano</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analyse du transcriptome des cellules isolées

Transcriptome Analysis of Single Cells

Beaucoup de techniques d&#39;analyse d&#39;expression génique fonder sur des documents isolés de populations hétérogènes de cellules à partir d&#39;homogénats de tissus ou cellules en culture. 1,2,3 Dans le cas du cerveau, des régions telles que l&#39;hippocampe contient un agencement complexe de différents types de cellules, chacune avec profils ARNm distincts. La capacité à récolter des cellules individuelles permet une enquête plus approfondie sur les différences moléculaires entre et au sein des populations de cellules. Nous décrivons une méthode simple et rapide pour la récolte de cellules pour un traitement ultérieur. Pipettes souvent utilisé en électrophysiologie sont utilisées pour isoler (par aspiration) une cellule d&#39;intérêt et idéalement de le déposer dans un tube Eppendorf pour un traitement ultérieur avec un certain nombre de techniques de biologie moléculaire. Notre protocole peut être modifié pour la récolte des dendrites partir de culture cellulaire ou même des cellules individuelles à partir de tranches aiguës. Nous décrivons également la méthode d&#39;amplification ARNa comme une application majeure aval des isolements seule cellule. Cette méthode a été développée précédemment par notre laboratoire comme une alternative aux autres techniques d&#39;analyse d&#39;expression génique tels que transcription inverse ou en temps réel la réaction en chaîne polymérase (PCR). 4,5,6,7,8 Cette technique permet l&#39;amplification linéaire de la ARN polyadénylé en commençant par femtogrammes seulement du matériel et résultant en des quantités microgramme d&#39;ARN antisens. Le matériel amplifié linéairement fournit une estimation plus précise que la PCR d&#39;amplification exponentielle de l&#39;abondance relative des composantes du transcriptome de la cellule isolée. La procédure de base se compose de deux cycles d&#39;amplification. En bref, un site T7 RNA polymérase promoteur est incorporé dans ADNc double brin créé à partir des transcrits d&#39;ARNm. Une nuit dans la transcription in vitro (IVT) de réaction est ensuite effectué dans laquelle T7 RNA polymérase produit de nombreux transcrits antisens de l&#39;ADNc double brin. Le second tour répète ce processus, mais avec quelques différences techniques puisque le matériau de départ est un ARN antisens. Il est standard de répéter le second tour, résultant en trois cycles d&#39;amplification. Souvent, la troisième ronde, en réaction de transcription in vitro est réalisée en utilisant nucléosidetriphosphates biotinylé de telle sorte que l&#39;ARN antisens produit peut être hybridée et détectée sur une puce à 7,8.

Dans cet article, nous décrivons une méthode simple pour la récolte des cellules isolées de rat cultures primaires de neurones et l&#39;analyse du transcriptome en utilisant une amplification ultérieure ARNa. Cette approche est généralisable à tout type de cellule.

L&#39;analyse du transcriptome des cellules isolées

De nombreuses techniques d'analyse de l'expression génique reposent sur du matériel isolé à partir de populations hétérogènes de cellules issues d'homogénats tissulaires ou de cellules en...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des échantillons à partir de cellules uniques en vue d'une analyse du transcriptome. Cela est réalisé en premier lieu en identifiant une cellule appropriée pour l'isolement. La micropipette est ensuite positionnée à côté de la cellule à isoler.Ensuite, une aspiration est appliquée à la seringue jusqu'à ce que la cellule soit tirée à l'intérieur de l'embout de la micropipette. La dernière étape du protocole consiste à casser l'embout de la micropipette dans le tube de collecte et à expulser le contenu restant de la micropipette dans ce tube. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant des différences entre les populations d'ARNm de cellules grâce à une analyse par puces à ADN du matériel amplifié par la méthode d'amplification d'arn, également décrite dans le protocole, ou pour d'autres applications telles que la PCR ou le séquençage de nouvelle génération.Bien que cette méthode puisse fournir des informations et révéler les différences entre cellules uniques, elle peut également être appliquée à des compartiments subcellulaires tels que les dendrites ou des classes de dendrites, et fournir des renseignements importants sur la fonction dendritique. La procédure sera démontrée par Jennifer Singh, postdoctorante dans mon laboratoire. Avant le début de ce protocole, des neurones primaires provenant du jour embryonnaire 18 de l’hippocampe de rat ont été ensemencés sur des lamelles de 12 millimètres dans une boîte de 35 millimètres et maintenus comme décrit dans le protocole écrit. Pour préparer les pipettes destinées au prélèvement, utilisez un tireur de micropipettes afin d’étirer des pipettes en verre stérilisées jusqu’à un diamètre approprié pour l’électrophysiologie.À l'aide du programme prédéfini du fabricant, la taille du diamètre n'est pas critique, car la pointe sera rompue avant la collecte des cellules. Conserver soigneusement les pipettes dans un environnement exempt de poussière, par exemple dans un récipient de stockage pour micro-pipettes, afin que les pointes restent intactes jusqu'au moment de la récolte des cellules. Préparer le nombre souhaité de tubes Eppendorf de 1,7 millilitre en ajoutant deux microlitres de PBS pour le stockage du matériel récolté.Retirer une boîte de 35 millimètres contenant des lamelles de l’incubateur dans une hotte de culture tissulaire. Transférer rapidement une lamelle de cette boîte vers le couvercle d’une nouvelle boîte de 35 millimètres contenant du HBSS. Il est essentiel de replacer au plus vite les lamelles non manipulées dans l’incubateur, car les cellules deviennent alors non viables.Si elles sont laissées à l’air pendant de longues périodes. Un microscope inversé équipé d’un objectif 40 x et d’un micromanipulateur est nécessaire pour la récolte des cellules. Utilisez un support pour pipette muni d’un tube souple qui s’éloigne du support, et fixez le tube à une surface stable afin d’éviter tout déplacement involontaire de la pipette pendant la collecte.À l'extrémité du tube, insérez une aiguille afin qu'une seringue d'un millilitre avec une connexion à verrouillage puisse être fixée et changée entre chaque utilisateur. Préparez la micropipette en cassant délicatement la pointe de manière contrôlée : tendez un essuie-tout entre les doigts d'une main et effleurez très doucement la pointe de la pipette sur le papier une à deux fois. L'ouverture doit représenter environ 75 à 100 % de la taille de la cellule cible.Fixez la micropipette dans le support de micropipette et attachez le support de micropipette à l'insert des micromanipulateurs. Enfin, mettez en place l'objectif 40 x. Placez la boîte sur la platine du microscope et repérez une région de cellules appropriée pour la récolte.Dans le cas de cultures neuronales primaires, la cellule doit être relativement isolée de ses voisines. Pour éviter la récolte de cellules ou de prolongements environnants, placer la cellule à récolter au centre du champ de vision. Utiliser le micromanipulateur pour avancer la micropipette vers la solution dans la boîte, en la positionnant dans le trajet de la lumière.Abaissez la pointe de la pipette dans la solution. En regardant à travers l'oculaire, la pipette doit apparaître comme une ombre dans le champ de vision. Appliquez une pression positive à partir de ce moment en soufflant légèrement à travers la seringue bien au-dessus du plan des cellules.Ajustez la position de la pointe de pipette jusqu'à ce qu'elle se trouve dans le champ de vision, puis mettez-la au point à l'aide des boutons de réglage grossier. À ce stade, évaluez si le diamètre de la pointe est trop grand ou trop petit. Si le diamètre est incorrect, remplacez la micropipette par une autre jusqu'à ce que le diamètre approprié soit trouvé afin d'éviter la rupture de la pipette dans la zone de prélèvement.Utilisez le réglage grossier pour faire avancer le plan focal avant de rapprocher la pointe de la pipette des cellules à l’aide des micromanipulateurs. Au fur et à mesure que les cellules deviennent plus proches, utilisez le réglage fin jusqu’à ce que les cellules et la pointe de la pipette soient toutes deux au point. Cessez d’appliquer une pression positive avant d’atteindre les cellules cibles afin d’éviter de les détacher du coverslip.Positionnez la pointe de pipette à l’aide des micromanipulateurs de manière à ce qu’elle touche le soma de la cellule à prélever. À l’aide de la seringue, appliquez une aspiration douce par la bouche jusqu’à ce que la cellule pénètre dans la pointe de pipette. Si la cellule n’entre pas dans la pipette, rapprochez délicatement la pointe de la cellule et abaissez-la légèrement jusqu’à ce que la cellule se détache du coverslip.Utilisez le micromanipulateur pour déplacer immédiatement la pipette vers le haut et hors de la solution. Retirez la pipette du support. Tenez le tube Eppendorf de 1,7 millilitre préparé dans une main et cassez doucement l'extrémité de la pipette contre la paroi du tube, près du fond.En visant la marque de 0,1 millilitre et en centrant l'extrémité cassée à l'intérieur du tube, insérez une aiguille fixée à une seringue d'un millilitre dans l'ouverture supérieure de la pipette. Appuyez rapidement sur le piston, forçant la solution contenue dans la pipette à être projetée dans le tube. Veillez à ne pas toucher l'extrémité au liquide présent sur les parois du tube.Étant donné que l'action capillaire ramènera le liquide dans la pipette, la cellule doit rester située à l'extrémité même de la pipette, ce qui devrait suffire pour expulser correctement la cellule. Faire centrifuger rapidement le contenu du tube à l'aide d'une microcentrifugeuse de table, puis congeler sur de la glace sèche ou placer sur de la glace pour un traitement ultérieur ou d'autres applications telles que la PCR ou le séquençage de nouvelle génération. On voit ici un exemple de récolte réussie d'un neurone isolé.Pour commencer, une région de cellules présentant une densité relativement faible a été sélectionnée. La pointe de pipette a ensuite été avancée vers la cellule souhaitée. Ici, le champ de vision est montré après que la cellule ait été récoltée.Remarquez que les processus environnants restent sur la lame. Inversement, cette figure montre deux images d'embouts de pipette, dont la taille est inappropriée pour une récolte efficace. Cet embout entraînera une récolte incomplète, tandis que l'embout illustré ici conduira à la récolte du milieu environnant.Après la récolte et une analyse d'amplification ARN, l'utilisation d'un bioanalyseur est recommandée afin d'examiner la distribution et la quantité d'ARN amplifié. Une amplification réussie à partir de matériel unicellulaire produira des quantités totales de l'ordre du faible microgramme et présentera une distribution lisse et large. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes si elle est effectuée correctement ; toutefois, il est essentiel d'employer des techniques sans ARN pendant cette procédure.

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