Les micropuces Silicon pour la manipulation d'interaction cellule-cellule

Bonjour, je m’appelle Elliot Hu.Je suis boursier postdoctoral dans le laboratoire de Tia ici au Massachusetts Institute of Technology. Aujourd’hui, nous allons préparer des cultures cellulaires sur des puces micromécaniques en silicium. Les appareils ressemblent à de petits peignes qui se verrouillent et ils nous permettent de manipuler avec précision les interactions entre deux populations différentes de cellules.

Aujourd’hui, nous allons étudier l’interaction entre les hépatocytes hépatiques et les cellules stromales de soutien. Plus précisément, trois cellules de fibroblastes T trois sont cultivées sur la surface supérieure des peignes, de sorte qu’en déplaçant les doigts du peigne, vous pouvez déplacer les cellules et modifier leur disposition spatiale. Chaque appareil est divisé en deux parties qui s’emboîtent dans deux configurations possibles.

La première met en contact les deux populations cellulaires l’une avec l’autre. Le second sépare légèrement les deux populations afin que les cellules ne puissent pas se toucher. Ici, les interactions de contact sont évitées, mais les interactions par le biais de facteurs sécrétés sont préservées.

Commençons par parler de la façon de manipuler les pièces avec une pince à épiler. J’aime utiliser à la fois des pinces à épiler en téflon plus grandes et des pinces métalliques à bout rond plus petites. Avec les plus grandes pinces à épiler, vous pouvez ramasser les pièces sur les bords comme ça avec les plus grandes pièces avec les bras, il faut faire attention à ne pas casser les bras car ils sont très fragiles.

Vous voulez donc les ramasser à l’arrière de la pièce comme ceci. Avec la pince à épiler en métal, vous pouvez mettre la main dans le trou et ramasser les copeaux directement. Les plus grandes pièces s’insèrent dans une paroi d’une plaque de 12 puits, tandis que les plus petites pièces s’insèrent dans une plaque de 24 puits ou peuvent être associées à la plus grande partie.

Dans une plaque à 12 puits, j’utilise généralement la pince à épiler en métal. Lorsque je manipule les pièces dans les plaques pour en emboîter deux ensemble, je mets généralement la plus grande partie dans le puits en premier et je la pousse complètement d’un côté. Ensuite, j’ai pris la réparation gratuite et je l’ai mise de l’autre côté du puits, et je les ai poussées ensemble en prenant deux pinces à épiler, une dans chaque trou.

Alors maintenant, je peux simplement verrouiller les pièces ensemble, soit dans la configuration de l’écart, soit dans la configuration du contact. Si je veux démonter les pièces, j’aime tirer les pièces jusqu’à la configuration de l’espace, puis tirer verticalement vers le haut pour retirer la pièce. Maintenant, les appareils sont fabriqués en silicium, ils doivent donc être enduits pour permettre une bonne adhérence des cellules.

Vous allez probablement recevoir les appareils déjà recouverts de polystyrène et traités au plasma, nous supposerons donc que c’est notre point de départ. Tout d’abord, nous allons utiliser du collagène pour recouvrir la surface à laquelle les hépatocytes vont se fixer. Nous allons mettre les rayons d’hépatocytes dans une solution de collagène de 50 microgrammes par moulin, une solution, et incuber à 37 °C pendant 45 minutes.

Les peignes fibroblastes en revanche, nous n’avons pas besoin de les enrober. Après l’incubation, nous aspirons la solution de collagène et lavons et lavons. Maintenant, nous allons verrouiller l’ES ensemble en contact avec des pièces complémentaires afin de former une surface plane pour l’ensemencement cellulaire.

Tout d’abord, nous remplirons certains puits avec de l’éthanol à 70 %. Je vais mettre une paire dans chaque puits, puis les verrouiller ensemble. Après avoir verrouillé ensemble, nous voulons examiner les pièces au microscope pour nous assurer qu’elles sont coplanaires.

De temps en temps, les pièces peuvent se verrouiller ensemble de manière désalignée. Et sur le microscope, vous verrez qu’ils sont sur deux plans focaux différents. Dans ce cas, il suffit de séparer les pièces et de les repousser ensemble Après avoir vérifié que l’alignement est correct, nous laissons les pièces reposer dans de l’éthanol pendant un certain temps pour les stériliser.

Souvent, je suis pressé, alors je me trempe pendant 10 minutes. Après la stérilisation, nous devons rincer. L’éthanol aspire soigneusement et se lave dans l’eau, puis aspire et lave à nouveau dans l’eau, et enfin aspire l’eau et remplace-la avec votre milieu de culture.

Allons maintenant implanter des cellules sur les appareils. En règle générale, nous suspendons les cellules à une concentration de 500 000 cellules par millilitre, et nous pipetons une suspension d’un millilitre sur chaque paire de rayons à l’aide d’une plaque à 12 puits. Nous avons donc ensemencé les fibroblastes à 500 000 cellules par millilitre dans deux des puits.

De même, nous avons pris une suspension de 500 000 hépatocytes par puits et les avons ensemencés dans les deux autres puits. Maintenant, avant d’incuber, nous allons bien secouer les cellules pour nous assurer qu’elles sont uniformément réparties. Et j’aime secouer trois fois verticalement, trois fois horizontalement, puis répéter cela trois fois.

Après l’avoir secoué, nous allons le placer dans l’incubateur et nous allons laisser les cellules reposer pendant 15 minutes, après quoi nous allons les secouer à nouveau. Après avoir secoué toutes les 15 minutes pendant une heure, nous allons ensuite aspirer la suspension cellulaire et jouer sur une nouvelle suspension de cellules. Et nous allons répéter cela jusqu’à ce que nous ayons une couche confluente de cellules.

Généralement, avec les fibroblastes, il faut une ou deux places. Et avec les hépatocytes, cela peut prendre deux à quatre places. Pour obtenir une monocouche confluente, les cellules sont assises à une densité assez élevée, l’agitation garantit que les cellules sont réparties uniformément.

Après la première place, une couche clairsemée de cellules se forme. Notez que les cellules ne se fixent qu’aux doigts qui ont été recouverts de polystyrène et de collagène. Après avoir ensemencé des cellules fraîches et incubé pendant une heure supplémentaire, à nouveau en secouant toutes les 15 minutes, la couche cellulaire devient plus dense.

Après le troisième ensemencement, nous avons une bonne densité cellulaire, et maintenant nous pouvons nous arrêter après que les cellules ont été ensemencées sur les rayons. Nous voulons manipuler les cellules dans la configuration expérimentale souhaitée. Les dispositifs sont maintenant séparés de leurs parties complémentaires et incubés pendant 24 heures.

Après 24 heures, les cellules se sont étalées pour former une monocouche confluente à la surface des rayons. Maintenant, nous voulons former une co-culture. Le peigne hépatocytaire et le peigne de fibroblastes sont maintenant transférés dans le même puits et verrouillés ensemble dans la configuration initiale souhaitée.

Si vous le souhaitez. Après un certain temps, vous pouvez modifier la configuration. Par exemple, nous pouvons passer à la configuration de l’espace après 18 heures, les pièces sont placées dans la même, bien poussées ensemble jusqu’à ce que la configuration de l’espace soit atteinte, puis poussées en contact dans la configuration de l’espace.

Et maintenant, nous allons retirer un peigne. Ce que nous allons faire maintenant, c’est passer par le processus d’enlèvement de l’ancien revêtement de polystyrène, de nettoyage des copeaux, puis de mise en place d’un nouveau revêtement de polystyrène et de préparation pour la culture cellulaire. Encore une fois, en enlevant l’ancien revêtement de polystyrène et en mettant une nouvelle couche, nous nous assurons qu’aucune partie de l’histoire de l’expérience précédente n’interférera avec une nouvelle expérience.

Donc, une fois que vous avez terminé votre expérience, la première chose à faire est de blanchir vos cellules, puis de rincer vos rayons et votre eau. Donc, avant de mettre les copeaux dans l’orteil, vous voulez vous assurer qu’ils sont complètement secs. Nous avons donc ici quelques peignes que je viens de laisser sécher à l’air libre pendant un moment et de vérifier qu’ils sont complètement secs.

Et maintenant, nous allons prendre un peu d’orteil et le mettre dans ce haut-parleur en verre. Je vais utiliser une pipette en verre ici pour ne pas la dissoudre. Halloween dissout le plastique, nous ne pouvons donc pas utiliser une pipette en polystyrène typique.

D’accord, c’est à peu près assez. Et maintenant, nous allons simplement prendre quelques-unes de ces pièces, les placer dans l’orteil, et je vais allumer le shaker pour agiter et nous le couvrirons d’une feuille d’aluminium pour empêcher le toluène de s’évaporer. Ainsi, après deux heures, le toluène devrait avoir dissous la majeure partie du polystyrène sur les peignes, et nous pouvons simplement les retirer et sécher les peignes à l’air.

Après le rinçage d’Halloween, les pièces doivent être relativement exemptes de polystyrène et doivent être relativement propres. Cependant, nous avons besoin que les pièces soient extrêmement propres afin que la nouvelle couche de polystyrène forme une bonne adhérence si elles ne sont pas extrêmement propres. La polyarthrite a tendance à se décoller au milieu de l’expérience lorsque les cellules commencent à tirer dessus.

Donc, ce que nous allons faire maintenant, c’est un nettoyage à l’acide piranha. J’ai mis les pièces dans un haut-parleur en verre et nous allons le chauffer. Nous allons donc mettre une plaque chauffante.

Et ici, nous avons l’acide sulfurique et le peroxyde d’hydrogène. Je vais d’abord verser l’acide sulfurique, et ici, assurez-vous que toutes les puces sont immergées sous le fluide. Parfois, ils ont tendance à flotter.

Et aussi maintenant que nous travaillons avec des produits chimiques assez corrosifs, assurez-vous de porter le bon équipement de protection. Ici. Je porte des gants en nitrile. Maintenant, nous allons verser le peroxyde d’hydrogène dans l’acide et faire attention ici car il s’agit d’une réaction exothermique.

Vous pouvez donc voir qu’il fume un peu lorsqu’il réagit, mais nous voulons ajouter de l’énergie dans le système pour le rendre encore plus réactif. Alors maintenant, nous allons le chauffer jusqu’à 120 degrés Celsius environ à un 20 maintenant, vous pouvez donc être assuré que tous les restes de votre culture cellulaire seront complètement nettoyés de vos puces. Donc, à ce stade, vous voulez simplement laisser la réaction suivre son cours jusqu’à ce que tout le peroxyde d’hydrogène soit consommé.

Et à ce moment-là, le mélange va cesser de bouillonner. La réaction met donc environ une demi-heure à suivre son cours. Et une fois que vous n’avez plus vu les bulles, vous pouvez simplement éteindre la plaque chauffante et la laisser refroidir.

Et nous allons les transférer dans une eau courbe BAK. Et encore une fois, assurez-vous d’utiliser des pinces à épiler en téflon ici, pas en métal, et vous pouvez simplement les ramasser, les transférer. Alors maintenant, nous allons juste le rincer sous un flux régulier de DDH deux O.Je le prends généralement directement de la Meine et nous le laisserons fonctionner pendant au moins 10 minutes ici.

Et ce faisant, nous allons, nous allons laver toutes les traces d’acide après avoir haché sous un jet d’eau pendant 10 minutes. L’acide doit être retiré des copeaux, et nous allons simplement les stocker sous l’eau jusqu’au moment où nous sommes prêts à enduire le polystyrène 45 000 polystyrène de poids moléculaire que nous avons obtenu de Sigma. Et nous allons en peser une petite quantité ici.

Nous avons 400 milligrammes et nous allons le dissoudre dans du toluène à 100 milligrammes par millilitre. Le toluène doit donc être manipulé dans la capuche. Et l’autre chose, c’est que, puisque nous allons utiliser un toluène pour dissoudre le polystyrène, nous voulons nous assurer que nous n’utilisons pas de vêtements de laboratoire en polystyrène.

Nous utilisons donc ici du polypropylène, une pipette conique et une pipette en verre. Donc, puisque j’ai 400 milligrammes de polystyrène, je vais mettre quatre millilitres de toing, et maintenant nous allons le vortex pendant une demi-heure jusqu’à ce que la polystyrine se dissolve. Alors maintenant, nous allons simplement vortex le tube à la vitesse la plus basse pendant environ 20 minutes à une demi-heure.

Je vais donc attacher le tube aux vortex. Je n’ai pas besoin de le tenir là tout le temps. Après 20 à 30 minutes, le polystyrène doit être dissous et nous sommes prêts à l’enrober.

Maintenant, nous allons filer l’enrobage de polystyrène dans notre installation. Notre codeur de spin se trouve dans une salle blanche. Et donc ici, nous devons porter une casquette, des lunettes, une blouse, des bottillons et des gants, mais ce n’est peut-être pas la même chose dans votre établissement.

Avant d’utiliser ce mandrin, je veux le protéger du polystyrène. Nous allons donc le recouvrir d’une feuille d’aluminium, et nous voulons qu’il soit aussi plat que possible sur la surface afin que la puce puisse affleurer la surface. Nous allons percer un petit trou en plein centre afin de pouvoir garder un vide sur la puce.

Le codeur de spin est réglé sur 2, 400 tr/min et 30 secondes. Maintenant, nous pouvons prendre l’un de nos copeaux, le placer de manière à ce que le centre du copeau recouvre le trou, et je vais d’abord retirer l’aspirateur lorsque je mets le polystyrène, allume l’aspirateur, puis commence l’essorage. Donc, pour les plus petites pièces, nous pouvons déposer un peu moins de 10 gouttes.

Et pour les plus grandes pièces, il faut un peu plus de 10 gouttes de polystyrène. Et nous allons le faire tourner pendant 30 secondes à 2 400 tr/min. Maintenant, nous allons prendre les copeaux revêtus de polystyrène et les mettre dans le four à 120 degrés C.C.C’est au-dessus du point de transition vitreuse du polystyrène.

Il va donc refondre la surface pour la lisser un peu, et il va également densifier et durcir le plastique. Donc, généralement, je le laisse au four toute la nuit. Il faut probablement au moins quelques heures pour que le processus se termine.

Ainsi, après une cuisson pendant la nuit, les copeaux sont prêts pour le traitement au plasma. Maintenant, nous allons exposer le polystyrène à un plasma d’oxygène, ce qui va modifier l’énergie de surface afin que les protéines et les cellules y adhèrent mieux. Nous allons donc simplement charger les puces dans la chambre à plasma et les pomper dans le vide.

Un bon réglage à utiliser est de 200 mil, tour de vide et 200 watts de puissance pendant une minute sous un flux d’oxygène gazeux. Maintenant que le système est pompé, nous allons introduire l’oxygène. D’accord, maintenant nous pouvons allumer l’alimentation RF, frapper le plasma pendant une minute.

Ainsi, lorsque le plasma fonctionne, il brille réellement. C’est comme une ampoule fluorescente. Après une minute d’exposition au plasma, nous allons ramener la pression dans l’atmosphère et nous pouvons retirer les pièces.

Les pièces sont maintenant prêtes pour l’enrobage des protéines et l’alimentation cellulaire. L’objectif de la conception de ce dispositif était de pouvoir manipuler la micro-architecture des tissus de manière dynamique. Ainsi, la micro-organisation des tissus dans le corps, en particulier l’endroit où les cellules sont placées les unes par rapport aux autres, est très importante pour déterminer la fonction de chaque cellule particulière en culture de laboratoire.

Jusqu’à récemment, nous n’avons pas été en mesure de reproduire cela, mais au cours des cinq ou dix dernières années, les gens ont commencé à être capables de micro-motifs de cellules sur un substrat de culture tissulaire, plaçant ainsi les cellules exactement là où nous voulons les avoir dans une plaque de culture tissulaire. Et ce faisant, ils ont pu découvrir certains aspects importants de la biologie de base des interactions cellulaires à l’échelle microscopique. Maintenant, ce que nous n’avons pas été en mesure de faire jusqu’à présent, c’est de le faire de manière dynamique.

C’est-à-dire changer l’organisation d’une culture cellulaire en plein milieu de votre, de l’expérience. Et c’est important parce que dans le corps, le tissu n’est pas vraiment un environnement statique. Nous avons des cellules qui se déplacent et se réorganisent, en particulier dans la cicatrisation ou le développement des plaies.

Mais même dans un, un organe normal en homéostasie, il y a beaucoup de choses qui bougent. L’aspect technique le plus difficile à apprendre est de savoir comment manger physiquement les pièces. Et au début, lorsque vous commencez à travailler avec le système, vous pouvez être intimidé par la fragilité des pièces ou la petitesse des émotions que vous devez ressentir.

Mais je pense que si vous vous entraînez avec pendant un petit moment, vous ne devriez pas avoir trop de problèmes. Dans certains des endroits où nous voyons ce dispositif jouer un rôle, par exemple, dans le développement embryonnaire, les cellules entreront en contact avec une série d’environnements cellulaires différents au fur et à mesure que les cellules bourgeonnent à travers diverses couches embryonnaires. Et on sait que les interactions avec chacune des couches, lorsqu’elles entrent en contact séquentiellement, nous poussent tous plus loin le long d’un chemin de différenciation spécifique.

Et donc nous pensons que ce type d’appareil pourrait être bon pour essayer de reproduire ce type d’événement en laboratoire. L’un des aspects de la micro-organisation que nous voulions particulièrement examiner était une différence entre les cellules communiquant par des interactions de contact où les membranes cellulaires peuvent se toucher les unes contre les autres, et les facteurs solubles qui sont sécrétés dans les milieux environnants et qui diffusent vers une cellule un peu plus éloignée. Et souvent, lorsque les cellules sont en co-culture et qu’elles ont un effet les unes sur les autres, il n’est pas clair s’il s’agit ou non d’interactions de contact ou de facteurs sécrétés qui jouent le rôle.