L'utilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction In Vitro

Ce protocole décrit l'utilisation de leviers de silicium micro-échelle que les surfaces souples de culture pour mesurer la contractilité des cellules musculaires in vitro. Contraction cellulaire provoque une flexion en porte à faux, qui peut être mesuré, enregistré et converti en lectures de force, en fournissant un système non invasif pour la mesure et s'adaptent fonction contractile in vitro.

L’objectif de l’expérience suivante est de mesurer l’activité contractile des fibres musculaires cultivées en réponse à une stimulation dans un environnement in vitro contrôlé. Ceci est réalisé en plaquant des cellules musculaires dissociées sur des cantilevers en silicium à l’échelle microscopique, et en induisant la fusion de ces cellules mononucléées pour former des fibres appelées myotubes. Ces puces en porte-à-faux soutenant des cellules musculaires différenciées sont ensuite transférées à un microscope électrophysiologique modifié pour soutenir un laser et un photodétecteur utilisés pour mesurer la déviation en porte-à-faux en réponse à la contraction musculaire après la mise en place de la puce dans la plate-forme.

Le laser est positionné de manière à se concentrer sur l’extrémité du cantilever et le photodétecteur est également aligné de manière à capter le faisceau dévié. On obtient des résultats qui montrent le degré de déviation du cantilever, qui est causée par la contraction musculaire en réponse à un traitement électrique ou chimique, fournissant une mesure directe du profil de contraction des cellules ensemencées en temps réel. En fin de compte, le déplacement en porte-à-faux peut être traité pour fournir une lecture de la force. Ce système est multiplexé pour fournir un banc d’essai potentiel à haut débit pour l’évaluation des changements de la fonction contractile en réponse à un traitement médicamenteux, à une maladie, à un état ou à des protocoles d’exercice.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’électrophysiologie par patch clamp, est que cette méthode d’analyse fonctionnelle est non invasive et facilement adaptable pour des études à haut débit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement de médicaments, telles que l’identification des concentrations dose-réponse appropriées avant l’évaluation clinique. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de plusieurs maladies musculaires car elle fournit des moyens d’étudier les performances fonctionnelles des cellules de différents phénotypes pathologiques.

Il peut également être utilisé pour d’autres systèmes tissulaires tels que les muscles cardiaques et lisses Stérilisé, des puces en porte-à-faux préalablement préparées et des lamelles de recouvrement 13 F dans une solution d’éthanol à 70 % et laisser sécher à l’air libre dans une hotte à flux. Placez ensuite des pastilles individuelles en porte-à-faux sur des lamelles de recouvrement 13 F. À l’intérieur d’une plaque standard à 12 puits, recouvrir les porte-à-faux avec le biopolymère ou la modification de surface optimisée pour le type de cellule utilisé Selon les protocoles de culture cellulaire standard, le revêtement de surface prend 30 minutes en utilisant notre méthode de préparation, mais peut être modifié en fonction du protocole de culture spécifique de l’investigateur.

Reese a été les cellules dans leur milieu de croissance spécifique à la concentration souhaitée, puis cent microlitres de suspension cellulaire sur la surface de la puce en porte-à-faux, garantissant que la bulle de milieu couvre entièrement les fenêtres en porte-à-faux. Transférez la plaque contenant les copeaux dans un incubateur et laissez les cellules adhérer pendant au moins une heure après cette période de placage. Utilisez une pince stérile pour transférer la puce dans un puits propre sans lamelle de 13 F et ajoutez un millilitre de milieu de croissance à chacun.

Bien remettre la plaque dans l’incubateur, entretenir les cellules selon leur protocole standard de maintenance in vitro. Sur les lamelles, placez une boîte de culture chauffée sur la platine d’un microscope d’électrophysiologie vertical. Ajoutez trois millilitres du milieu d’alimentation cellulaire actuel dans le microscope chauffé.

Montez des électrodes en acier inoxydable à l’intérieur de la boîte de culture chauffée à une distance de séparation de 15 millimètres. Connectez-les à un générateur d’impulsions capable de produire une stimulation de champ, des impulsions d’intensité, de fréquence et de forme d’onde variables pour permettre au système de produire une stimulation de champ des cellules le cas échéant. Fixez un laser à hélium au néon monté sur des platines de translation XY sous la table du microscope.

Ajustez ensuite le laser de manière à ce que le faisceau laser soit dirigé à travers la base de la boîte de culture chauffée à un angle de 30 degrés par rapport au plan du porte-à-faux. Boulon suivant, un module de photodétection à quadrant monté sur des platines de translation XY sur la face inférieure de la platine du microscope. Ajustez sa position de sorte que le faisceau laser réfléchi atterrisse au centre des quatre quadrants.

Écrivez un logiciel pour contrôler les actionneurs linéaires qui balaient les porte-à-faux en se référant à l’organigramme fourni dans le protocole texte. Allumez le matériel d’analyse en porte-à-faux et les logiciels associés. Insérez l’étage chauffé ther mrta dans le milieu et attendez qu’il indique 37 degrés Celsius.

Ensuite, insérez la puce en porte-à-faux dans la platine avec les cantilevers orientés vers le côté droit de la platine. Allumez la source lumineuse du microscope. Focalisez le microscope pour faire apparaître les bords des porte-à-faux et utilisez le logiciel de contrôle du photodétecteur laser pour positionner le faisceau laser sur la pointe du cantilever un, en supposant que les porte-à-faux sont orientés à droite du porte-à-faux de la platine.

L’un est celui qui se trouve en haut à gauche du tableau et les chiffres descendent jusqu’à 16. En bas à gauche. Le porte-à-faux 17 est en position supérieure droite et va jusqu’à 32.

En bas à droite, appuyez sur play sur le logiciel d’enregistrement. Positionnez le photodétecteur de manière à ce que le signal indique zéro dans les cadres x et y en ajustant les moteurs pas à pas contrôlant le photodétecteur. Réglez ensuite le porte-à-faux sur une position dans le logiciel de commande du photodétecteur laser.

Ensuite, déplacez le laser vers la pointe du porte-à-faux 16. Répétez le positionnement du photodétecteur et réglez la position cantilever 16 dans le logiciel de commande du photodétecteur laser. Déplacez maintenant le laser vers la pointe du porte-à-faux 32.

Répétez le positionnement du photodétecteur et réglez la position cantilever 32 dans le logiciel de commande du photodétecteur laser. Enfin, déplacez le laser vers la pointe du porte-à-faux 17. Répétez le positionnement du photodétecteur et réglez la position cantilever 17 dans le logiciel de commande du photodétecteur laser.

Éteignez la source lumineuse du microscope, puis la lumière zénithale dans le laboratoire. Appuyez sur enregistrer sur le logiciel d’enregistrement. Réglez le matériel du générateur d’impulsions sur des impulsions de 40 millisecondes et cinq volts, une fréquence d’un hertz.

Ensuite, allumez la machine À l’aide du logiciel de contrôle du photodétecteur laser, réglez le matériel pour qu’il scanne le réseau de 32 porte-à-faux. S’arrêtant cinq secondes à chacun d’eux. Lorsque le balayage des 32 porte-à-faux est terminé, éteignez le stimulateur.

Arrêtez ensuite le logiciel d’enregistrement et ouvrez le fichier de données. Examinez la trace enregistrée de chaque porte-à-faux. Pour des preuves d’activité contractile.

Une contraction est définie comme un pic. Si la déviation est d’au moins 0,1 volt au-dessus de la ligne de base, notez chaque porte-à-faux avec des réponses positives. Retirez tous les porte-à-faux non réactifs du protocole de balayage sur le logiciel de contrôle du photodétecteur laser.

Les cantilevers actifs peuvent ensuite être re-scannés sans stimulation afin d’obtenir une lecture de l’activité contractile spontanée de la cellule. Ensuite, ajoutez un composé thérapeutique au milieu pour observer son effet sur la production fonctionnelle des cellules cultivées. Après l’ajout de balayages composés avec ou sans stimulation électrique à large champ, effectuez des évaluations de fatigue en stimulant électriquement les cellules pendant de longues périodes, puis des niveaux de contractilité pour mesurer le temps nécessaire pour que la force maximale tombe en dessous d’un seuil spécifique.

Dans les expériences où les motoneurones sont maintenus en co-culture avec le muscle, mesurez la formation de jonctions neuromusculaires par le traitement de la motoneuroneurocyste myo tube co-cultures en porte-à-faux avec un stimulant neuronal ou un inhibiteur synaptique et recherchez des augmentations et des diminutions de l’activité spontanée, procédez à l’analyse des données de déviation en porte-à-faux comme détaillé dans le protocole de texte. La culture réussie de cellules contractiles sur des porte-à-faux est une procédure relativement simple utilisant des techniques de culture cellulaire standard. Un logiciel électrophysiologique standard peut être utilisé pour analyser les données brutes, ce qui facilite le calcul des propriétés fonctionnelles pertinentes, telles que la force maximale, le temps jusqu’à la force maximale et le temps jusqu’à la demi-relaxation.

Des protocoles de stimulation étendus permettent d’évaluer les taux de fatigue dans les cellules cultivées, élargissant ainsi le niveau de données physiologiques pouvant être obtenu à partir de ce système. Le système de culture en porte-à-faux peut être modifié pour inclure les motoneurones dans le système de culture avec des myotubes de muscle squelettique, afin de permettre l’évaluation de la formation des synapses neuromusculaires in vitro. Dans de telles cultures, les taux d’activité contractile spontanée sont comparés aux taux de contraction en réponse au traitement avec un stimulant spécifique des neurones tel que le glutamate.

Toute augmentation observée des taux de contraction induite par le glutamate suggère l’activation des neurones en culture conduisant à la libération d’acétylcholine et à l’activation ultérieure du tube myo. Le traitement avec des inhibiteurs synaptiques tels que l’antagoniste des récepteurs de l’acétylcholine, la dtu rine qui conduisent à l’arrêt de l’activité induite par le glutamate fournit des preuves supplémentaires de la présence de synapses neuromusculaires fonctionnelles dans ces cultures. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les cantilevers en silicium à l’échelle microscopique pour évaluer les propriétés fonctionnelles des muscles squelettiques cultivés.