Name: Lutilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Découvrez l'utilisation de micropoutres en silicium pour mesurer la contractilité musculaire in vitro. Cette méthode non invasive permet une analyse en temps réel de la fonction cellulaire et des applications en pharmacologie.

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Cette recherche a été financée par l&#39;Institut national de numéros de subventions santé R01NS050452 et R01EB009429. La fabrication des puces en porte à faux a été réalisée à l&#39;extérieur par des collaborateurs à l&#39;installation de NanoFabrication situé à l&#39;Université Cornell. Tout l&#39;équipement utilisé dans le procédé de fabrication en porte à faux a été localisé dans cette installation. Un merci spécial à Mandy Esch et Jean-Matthieu Prot pour leur aide avec cantilever micro-fabrication. animation de la vidéo de la fonctionnalité de console a été généré par Charles Hughes, Alex Zelenin et Eric Imperiale du Laboratoire de réalité synthétique à l&#39;ICU.

1.-faux fabrication de puces Détails illustrés des étapes de fabrication décrites sont fournies sur la figure 1. <ol><li> Placez plaques de silicium sur isolant (SOI) dans un four et cuire au four à 125 ° C pendant 20 min pour les déshydrater. </li><li> Déposer une couche épaisse d'oxyde de silicium de 1,5 pm sur la couche de poignée de la plaquette SOI déshydraté au moyen d'un Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) outil. </li><li> Placer la plaque sur le mandrin de spin d'enduction de la couche de dispositif vers le haut. Assurez-plaquette est centrée, de distribuer 2 ml de P20 amorce sur le centre de la plaque, et tournent à 3000 tours par minute pendant 60 secondes à une accélération de 1000 rpm / sec. P20 amorce favorise l'adhérence du vernis photosensible à la couche de dispositif. </li><li> Bien que la tranche est encore sur le mandrin tournette, distribuer 2 ml de S1818 résine photosensible sur le centre de la plaquette, et centrifuger à 3000 tours par minute pendant 60 secondes à une accélération de 1000 tours par minute / seconde à obtain une épaisse couche de résine photosensible de 1,5 um. </li><li> Placer la plaque sur une plaque chauffante et effectuer une cuisson douce à 115 ° C pendant 1 min. </li><li> Effectuer une exposition Contact avec les UV dur à l'aide d'un masque d'alignement de contact de photolithographie afin de transférer le motif du masque en porte à faux de la résine photosensible sur la couche de l'appareil. Calculer le temps d'exposition en fonction de l'exposition valeur énergétique de 125 mJ / cm 2 pour S1818 résine photosensible. </li><li> Développer la résine photosensible par immersion de la plaquette dans un MIF développeur 726 de résine photosensible pour 1 min en agitant doucement la tranche d'avant en arrière. </li><li> Rincer la plaquette avec (DI) de de-ionisée et sécher, de préférence en utilisant un outil essoreuse de rinçage (SRD). </li><li> Retirer la résine photosensible à partir du bord de la plaquette (jusqu'à 5 mm du bord) en utilisant un tampon de coton trempé dans de l'acétone. </li><li> Chargez la plaquette dans un outil Deep Reactive Ion Etch (DRIE), avec le côté de résine photosensible vers le haut, et exécuter une recette pour graver la couche de silicium motifs par la devicouche CE. Les fonctions de la couche d'oxyde enterrée comme un arrêt de gravure, de manière à effectuer une attaque chimique de 50% à 100% de cycles que l'on attend d'être nécessaire pour assurer une gravure complète. </li><li> Placer la plaque dans une solution de bain de résine photosensible à chaud pendant 20 minutes pour enlever la résine photosensible. Transférer la tranche à une rapide décharge-Rince (QDR) pour rincer la tranche avec de l'eau DI. Après la bande de résine photosensible, charger la plaquette dans un outil de SRD à rincer et sécher la plaquette. Vérifier la plaquette sous un microscope à assurer la configuration en porte à faux apparaît comme prévu. </li><li> Déposer une couche de 1 um d'épaisseur d'oxyde de silicium non dopé sur la couche de dispositif de la plaquette à l'aide d'un outil de PECVD. Cette fonction de couche d'oxyde en tant que couche de protection pour les leviers au cours des étapes de traitement. </li><li> Placer la plaque sur le mandrin de spin d'enduction de la couche de poignée orientée vers le haut pour commencer le traitement de la face arrière de la plaquette. Assurer plaquette est centrée, de distribuer 2 ml de P20 amorce sur le centre de la plaque, et tournent à 3000 tours par minutependant 60 secondes à une accélération de 1000 rpm / sec. </li><li> Bien que la tranche est encore sur le mandrin tournette, 2 ml de distribuer SPR220-4.5 résine photosensible sur le centre de la plaquette, et centrifuger à 2000 tours par minute pendant 45 secondes à une accélération de 1000 tours par minute / seconde pour obtenir une épaisseur de couche de 6,5 pm résine photosensible. </li><li> Placer la plaque sur une plaque chaude de proximité pour effectuer une cuisson douce à 115 ° C pendant 2 min. </li><li> Utilisation d'une photolithographie de contact d'alignement capable de recto / verso alignement, aligner le masque de la fenêtre du côté arrière de la configuration en porte à faux du côté avant et effectuer une exposition aux UV de contact dure, afin de transférer le motif sur le masque de la fenêtre du côté arrière de la résine photosensible sur la couche de poignée. Utilisez un temps d'exposition calculée sur la base de l'exposition valeur énergétique de 480 mJ / cm 2 pour SPR220-4.5 résine photosensible. </li><li> Après l'exposition aux UV, que les plaquettes restent dans une zone sombre pendant 30 min avant l'étape de traitement suivante. </li><li> Développer la résine photosensible par trempage de la plaque enun développeur 726 MIF de résine photosensible pendant 2 min en agitant doucement la tranche d'avant en arrière. </li><li> Rincer la plaquette avec (DI) de de-ionisée et sécher, de préférence en utilisant un outil essoreuse de rinçage (SRD). </li><li> Placer les tranches dans un four à 90 ° C pendant 12 heures. </li><li> Graver la couche d'oxyde de silicium sur la face arrière de la tranche en utilisant un système de RIE avec des gaz fluorés et une recette pour la gravure de l'oxyde. L'oxyde à motifs sur la face arrière de la plaquette joue le rôle d'un masque de gravure pour la suite du traitement. Inspecter les plaquettes au microscope pour s'assurer que l'oxyde de silicium exposé dans la fenêtre est complètement décapée. </li><li> Retirer la résine photosensible sur le bord de la plaquette (jusqu'à 5 mm du bord) en utilisant un tampon de salle blanche trempée dans de l'acétone. </li><li> Charger la plaquette dans un outil de DRIE et de fonctionner avec une recette pour graver la couche de poignée motif jusqu'à une profondeur de 500 um avec le fonctionnement de la couche d'oxyde enterrée dans un arrêt de gravure. Diviser cette gravure en plusieurs pistes pour éviter un échauffement excessif de lagaufrette, ce qui provoque la gravure du silicium incompatible. Cette étape de gravure élimine complètement le silicium sous les encorbellements. </li><li> Réaliser une étape de gravure humide en utilisant 25% de HF dilué agent de gravure, à enlever la couche d'oxyde enterrée en dessous des consoles et la couche protectrice d'oxyde au-dessus des consoles. REMARQUE: Cette étape libère la surface inférieure des consoles de silicium et ouvre une nouvelle fenêtre pour fournir un accès à la sonde en porte à faux avec le laser aussi. </li><li> Rincer la plaque à l'aide d'une série de DI bains d'eau et sécher soigneusement avec de l'azote. Depuis les consoles sont pris en charge uniquement par leurs bases, ne pas utiliser de sprays d'eau puissant DI ou un gaz inerte directement sur les consoles. </li><li> Cliver les puces individuelles à partir de la tranche le long des lignes de clivent les produits au cours de l'étape de gravure de la couche poignée. </li></ol> 2. culture cellulaire <ol><li> Préparer 13F lamelles selon des méthodes 17 précédemment publiés. REMARQUE: Si 13F anserslips ne sont pas disponibles, toute surface hydrophobe avec un angle de contact au-dessus de 95 ° peut être utilisé. </li><li> Stériliser puces en porte-lamelles et 13F dans une solution d'éthanol à 70% et laisser sécher à l'air dans une hotte à flux. </li><li> Placez puces individuelles en porte à faux au-dessus de 13F lamelles dans une plaque 12 puits standard. </li><li> Enduire les cantilevers avec la modification d'un biopolymère ou d'une surface optimisé pour le type de cellules utilisées selon les protocoles de culture cellulaire standard. </li><li> Re-suspendre les cellules dans leur milieu de croissance spécifique à la concentration désirée. NOTE: Ce protocole se traduira par un nombre important de cellules tombant à travers la fenêtre en porte à faux et qui n'adhère pas à la surface du cantilever souhaitée. préparations de cellules doivent donc être faits 3-4x plus concentré que pour les préparations de lamelle standard. Par exemple, l'ensemencement de cellules satellites de muscle squelettique de rat est généralement réalisée en utilisant une densité d'ensemencement de 500 à 700 cellules / mm carré 15,16, Et sont utilisés avec des substrats en porte à faux à 2000 cellules / mm carré. des expériences d'optimisation doivent être effectuées avec de nouvelles sources de cellules pour déterminer une densité d'ensemencement appropriée. </li><li> Pipeter 200 ul de la suspension cellulaire sur la surface de la puce en porte à faux assurant la bulle de support recouvre les fenêtres entièrement en porte à faux. Si le milieu évacue à travers la fenêtre et ne forme pas de bulles statique au-dessus des consoles remplacer la lamelle couvre-13F et retenter le placage. </li><li> Transférer la plaque contenant les jetons à un incubateur et permettent aux cellules d'adhérer pendant au moins 1 heure (de préférence 2-3 h). </li><li> Après cette période de placage, utiliser des pinces stériles pour transférer la puce à un bien propre, sans une lamelle 13F, et haut la culture avec 1 ml de milieu de croissance. </li><li> Retour de la plaque dans l'incubateur. </li><li> Maintenir les cellules en fonction de leur protocole standard pour l'entretien in vitro sur des lamelles. Pour les cellules des muscles squelettiques,un commutateur de composition de milieu pour induire la formation de myotubes une fois que les cellules deviennent confluentes sera nécessaire. </li></ol> 3 Configuration du matériel et des logiciels d'analyse Cantilever Déviation <ol><li> Placez une boîte de culture chauffée dans le stade d'un microscope droit électrophysiologie. </li><li> Ajouter 3 ml du milieu d'alimentation, les cellules sont mises en suspension dans le moment (+ 10 mM de HEPES) de la platine du microscope chauffée. </li><li> Montage d'électrodes en acier inoxydable à l'intérieur de la boîte de culture chauffé à une distance de séparation de 15 mm et de les relier à un générateur d'impulsions, capable de produire des impulsions de stimulation du champ de variation de l'intensité, la fréquence et la forme d'onde, pour permettre au système de produire une stimulation de champ de cellules, le cas échéant. </li><li> Visser un laser Hélium-Néon, monté sur des étages de translation XY, à la face inférieure de la table de microscope et de l'ajuster de telle sorte que le faisceau laser est dirigé à travers le fond de la boîte de culture chauffé à une relativ 30 ° d'anglee par rapport au plan de la console. </li><li> Visser un module photo-détecteur à quadrants, monté sur les scènes de translation XY, à la face inférieure de la platine du microscope et régler la position de sorte que les terres de faisceau laser réfléchi dans le centre des 4 quadrants. Figure 2 donne un aperçu du matériel mis en place nécessaire pour mettre en œuvre le protocole décrit. </li><li> Écrire un programme de logiciel pour contrôler les actionneurs linéaires qui scannent à travers les consoles. Écrire le programme de logiciel, en référence à l'organigramme présenté à la figure 3. L'interface graphique programmé pour être utilisé avec ce système est présenté à la figure 4. </li></ol> 4. enregistrement Cantilever Déviation données <ol><li> Allumer le matériel d'analyse en porte à faux et le logiciel associé. </li><li> Insérez la thermistance de la scène chauffée dans le milieu et attendre pour lire 37 ° C. </li><li> Insérez la puce en porte à faux dans la scène avec le cantilevers orientés vers le côté droit de la scène. </li><li> Allumer la source de lumière du microscope. </li><li> La mise au microscope pour amener les bords des consoles en vue et utiliser le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur pour positionner le faisceau laser sur la pointe du cantilever 1 REMARQUE: En supposant que les consoles sont orientés vers la droite de la scène, cantilever 1 est l'un positionné dans le coin supérieur gauche de la matrice et le nombre descendent jusqu'à 16 en bas à gauche. Cantilever 17 est dans la position en haut à droite et tourne à 32 en bas à droite (figure 5A). </li><li> Appuyez sur "play" sur le logiciel d'enregistrement. </li><li> Positionner le photo-détecteur de sorte que le signal indique "0" dans les deux x et y trames en ajustant les moteurs pas à pas commandant le photo-détecteur. </li><li> Réglez cantilever 1 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur (Figure 4). </li><li> Déplacez le laser à la pointe du cantilever 16, répéter l'étape 4.7., Et mettre cantilever 16 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur. </li><li> Déplacez le laser à la pointe du cantilever 32, répéter l'étape 4.7., Et mettre en porte à faux 32 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur. </li><li> Déplacez le laser à la pointe du cantilever 17, répéter l'étape 4.7., Et mettre en porte à faux 17 position dans le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur. </li><li> Coupez la source de lumière du microscope et le plafonnier dans le laboratoire. </li><li> Appuyez sur "enregistrer" sur le logiciel d'enregistrement. </li><li> Réglez le matériel générateur d'impulsions à 40 ms, 5 V impulsions à une fréquence de 1 Hz, et allumer la machine. NOTE: En option, emploient des protocoles de stimulation optimisés pour les sources de cellules spécifiques à ce stade, les paramètres indiqués sont des lignes directrices fondées sur des données recueillies à l'aide de sources 12,13,15,16 cellulaires humaines et de rongeurs. </li><li> En utilisant le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur, régler le matériel pour numériser à travers le réseau 32 en porte à faux, l'arrêt pendant 5 secondes à chaque sure. </li><li> Lorsque l'analyse des 32 consoles est terminée, éteignez le stimulateur, puis arrêtez le logiciel d'enregistrement et d'élever le fichier de données. </li><li> Examinez la trace enregistrée de chaque console de preuves de l'activité contractile. Prenez note de chaque porte à faux avec les réponses positives. Une contraction est définie comme étant un pic si la déviation est au moins de 0,1 V au-dessus de la ligne de base. </li><li> Retirez toutes les consoles non-sensibles du protocole de numérisation sur le logiciel de contrôle laser / photo-détecteur. </li><li> Les cantilevers actifs peuvent ensuite être réanalysés sans stimulation afin d'obtenir une lecture de l'activité contractile spontanée de la cellule. </li><li> Exécuter des analyses large avec ou sans stimulation électrique de champ, après l'addition d'un composé thérapeutique dans le milieu pour observer son effet sur la sortie fonctionnelle des cellules en culture. </li><li> Réaliser des évaluations de la fatigue en stimulant électriquement les cellules pendant de longues périodes et les niveaux de contr de numérisation Actility de mesurer combien de temps il faut pour force maximale de descendre en dessous d'un certain seuil. </li><li> Dans les expériences où les motoneurones sont maintenues en co-culture avec les muscles, mesurer la formation de la jonction neuromusculaire par le traitement des motoneurones-myotubes cantilever co-cultures avec un stimulant neuronal (tel que le glutamate) ou inhibiteur de la synaptique (par exemple, d-tubocurarine) et de balayage pour augmentations et les diminutions de l'activité spontanée respectivement 16. </li><li> Effectuer des analyses spécifiques comme dicté par les besoins des expériences prévues. </li></ol> 5 Analyse des données Cantilever Déviation <ol><li> Utilisez modifié les équations de Stoney 15 (détaillées ci-dessous) pour convertir les données en porte à faux brut de déviation (en Volts) en une lecture de stress dans la couche de cellules ou myotubes (en Pascals), et une mesure directe de la force contractile cellulaire (en nano-Newton): annonce / 51866 / 51866eq1.jpg "/&gt; l'équation 1 <img alt="Equation 2" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg"> Equation 2 </li><li> Où δ = cantilever béquillage et le stress produites par les myotubes, σ c = contrainte produite par les myotubes, en supposant un film d'épaisseur uniforme sur toute la largeur de la poutre, C détecteur = le coefficient spécifique au système concernant la tension de mesure à laser sur la photo -detector, θ = l'angle du laser et du détecteur par rapport au plan de la poutre, E Si = le module d'élasticité de silicium, t Si = l'épaisseur du cantilever, t f = épaisseur de myotubes, v Si = coefficient de poison de silicium, L = longueur en porte à faux, P = longueur du chemin laser à partir de la pointe de cantilever à détecteur, et w la figure 6. </li><li> En supposant que la myotubes est un film uniforme, la force dans la myotubes est égale à la force dans le film, ce qui conduit à l'équation 3, en assimilant le calcul de la force contre le stress et la zone de section transversale de la cellule présumée qui a été utilisé pour l'application de Stoney de équation. <img alt="Équation 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg"> Équation 3 </li><li> Après la collecte de données fonctionnelles, fixer des puces en porte à faux pour l'analyse immunocytochimique ou utiliser des cellules pour l'analyse des protéines ou de l'ADN en utilisant des techniques standard. </li><li> En option, retourner les cellules à l'incubateur au lieu de préparer pour l'analyse moléculaire afin de réévaluer la performance fonctionnelle à un point de temps plus tard. </li></ol>

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<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+novel+serum-free+cell+culture+model+of+skeletal+muscle+differentiation+by+systematically+studying+the+role+of+different+growth+factors+in+myotube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).</li>
<li>Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+determinants+of+neuronal+survival+and+growth+on+self-assembled+monolayers+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture.</a> Brain research. 630, 136-147 (1993).</li>
<li>Hickman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+pattern+design+for+in+vitro+cellular+networks+using+surface+photochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Scienc.%2C+%26+Technology+A%3A+Vacuum%2C+Surfaces%2C+and+Films%22%5BJournal%5D)">Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry.</a> Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).</li>
<li>Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+rat+embryonic+motor+neurons+in+a+defined+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system.</a> Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).</li>
<li>Rumsey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Node+of+Ranvier+formation+on+motor+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro.</a> Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).</li>
<li>Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial+Surface+patterning+of+self+assembled+monolayers+for+controlling+neuronal+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biomedical+engineering+and+technology%22%5BJournal%5D)">Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior.</a> International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).</li>
<li>Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+fetal+spinal+cord+stem+cell+line%2C+NSI-566RSC%2C+and+its+induction+to+functional+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).</li>
<li>Varghese, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+target+for+amyloid+beta+toxicity+validated+by+standard+and+high-throughput+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology.</a> PLoS ONE. 5, e8643(2010).</li>
<li>Natarajan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cardiomyocytes+on+microelectrode+arrays+as+a+functional%2C+high+information+content+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform.</a> Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).</li>
<li>Davis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+Cortical+Oligodendrocyte-Embryonic+Motoneuron+Co-Culture%3A+An+Axon-Oligodendrocyte+Interaction+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomaterials+and+tissue%22%5BJournal%5D)">Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model.</a> Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).</li>
<li>Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+In+Vitro+Feed-Forward+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol+Biomater%22%5BJournal%5D)">Engineered In Vitro Feed-Forward Networks.</a> J Biotechnol Biomater. 3, 2(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes essentielles de l&#39;analyse microscopique des consoles de preuve de contraction cellulaire sont le placement de la puce de porte à faux à l&#39;intérieur de la platine du microscope, et l&#39;alignement ultérieur du laser et photo-détecteur à l&#39;extrémité des leviers de coin dans la matrice. Si ce n&#39;est pas fait correctement, le logiciel ne pourra pas extrapoler les positions des consoles restantes dans le tableau, qui pourrait conduire à l&#39;accumulation de faux négatifs lors de la collecte de don...

La culture in vitro de cellules musculaires provenant de sources humaines et de rongeurs est possible depuis des décennies1,2. Cependant, bien que les préparations standard de lamelles soient utiles pour l’évaluation biochimique, elles ne facilitent pas l’analyse de la production fonctionnelle primaire de la cellule (contractilité) et ont donc une valeur quelque peu limitée en tant que moyen d’évaluer la maturation et les performances cellulaires. Afin de maximiser la quantité de données pouvant être obtenues à partir de ces cultures in vitro, il est nécessaire de faire progresser le développement de systèmes capables d’héberger de telles cellules dans des configurations permettant l’évaluation en temps réel de leur performance fonctionnelle. L’établissement d’une multitude de modèles musculaires tridimensionnels a permis de réaliser certains progrès vers la satisfaction de ce besoin, et de tels systèmes ont été utilisés dans un certain nombre de publications comme moyen d’évaluer la capacité contractile des cellules musculaires cultivées in vitro3-5. Bien que ces systèmes soient inestimables pour la modélisation tissulaire et les études de reconstruction, leur applicabilité limitée pour les études des réponses unicellulaires. Dans les cas où des études sur une seule fibre sont nécessaires, les méthodologies ex vivo complexes et laborieuses restent la seule option6-10. De plus, le mouvement actuel vers le développement de plates-formes complexes et multi-organes pour le développement de médicaments et les protocoles de criblage nécessite la mise en place de systèmes non invasifs, facilement évolutifs et qui s’intègrent facilement aux cellules de soutien et aux modèles tissulaires11. 
Les cantilevers à micro-échelle offrent une méthode simple pour évaluer la capacité contractile fonctionnelle de cellules uniques/petites populations de cellules12,13. La technique est basée sur la technologie modifiée de microscopie à force atomique (AFM)14 et utilise un système de laser et de photodétecteur pour mesurer la déviation en porte-à-faux à l’échelle microscopique en réponse à l’activité contractile des myotubes en culture. Les équations de Stoney modifiées sont ensuite utilisées pour calculer la contrainte dans le myotube et la force exercée par le myotube afin de générer la déviation du substrat observée15. Un programme de balayage a été conçu pour permettre l’évaluation simultanée de réseaux de porte-à-faux multiplexés, offrant des applications potentielles à débit modéré à élevé pour les études de toxicité et d’efficacité des médicaments15,16. Une telle technologie pourrait s’avérer inestimable dans le développement d’essais précliniques fonctionnels pour prédire l’efficacité des médicaments in vivo. De plus, la fabrication de puces en porte-à-faux dans le silicium n’entrave pas le traitement post-analyse des cellules pour les tests biomoléculaires standard tels que l’immunomarquage, le western blot et la PCR. 
Ce manuscrit fournit des instructions détaillées sur la fabrication et la préparation de cantilevers en silicium à l’échelle microscopique, la configuration matérielle et logicielle, ainsi que les directives de fonctionnement pour évaluer la fonctionnalité des cellules contractiles cultivées sur ces puces. Des techniques de culture cellulaire standard peuvent être mises en œuvre pour le placage et l’entretien des cellules sur ces surfaces, par conséquent, tout type de cellule contractile pour lequel des paramètres de culture fiables existent devrait pouvoir s’intégrer facilement à ce dispositif. Les paramètres de culture 2D relativement simples utilisés dans ce système facilitent l’intégration d’autres modèles cellulaires ou l’ajout de types de cellules capables d’interagir avec les muscles (tels que les neurones innervants), ce qui augmente considérablement l’applicabilité de ce modèle dans le développement d’essais fonctionnels in vitro plus complexes et de modèles multi-organes de systèmes mammifères.

<table><tbody><tr>Milieu <td></td><td></td><td></td><td>de croissance musculaire primaire du rat</td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>G5 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17503-012</td><td>1x</td></tr><tr><td>dérivé de la glie Facteur neurotrophique</td><td>Sciences cellulaires</td><td>CRG400B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique dérivé du cerveau</td><td>Sciences cellulaires</td><td>CRB600B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique ciliaire</td><td>Sciences cellulaires</td><td>CRC400A</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Neurotrophine-3</td><td>Sciences cellulaires</td><td>CRN500B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Neurotrophine-4</td><td>Sciences cellulaires</td><td>CRN501B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes acides</td> Life <td>Technologies</td><td>13241-013&nbsp ;</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>Cardiotrophine-1</td><td>Sciences cellulaires</td><td>CRC700B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Sulfate d’héparine Sigma</td><td></td><td>D9809</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Facteur inhibiteur de la leucémie</td><td>Sigma</td><td>L5158&nbsp ;</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitronectine</td><td>Sigma</td><td>V0132</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr>Milieu <td></td><td></td><td></td><td>de différenciation musculaire primaire du rat</td></tr><tr><td>NB Activ 4</td><td>Brain Bits LLC</td><td>NB4-500</td><td></td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Classe 2 laser à diode rouge</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photodétecteur</td><td>Noah Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modèle 2100 Pulse stimulateur</td> Systèmes <td></td><td></td><td>A-M</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Numériseur</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp microscope et platine</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delta T4 Contrôleur de boîte de culture</td><td>Bioptechs Logiciel d’axoscope</td> Dispositifs moléculaires <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Logiciel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur 37 oC, 5 % CO2</td><td>NAPCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux microbiologique classe 2</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes et pointes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l'utilisation de microscale silicon cantilevers pour évaluer cellulaire contractile fonction in vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Le développement de tests in vitro prédictifs et biologiquement pertinents repose sur la promotion des systèmes de culture cellulaire polyvalents qui facilitent l&#39;évaluation fonctionnelle des cellules ensemencées. A cet effet, la technologie de micro-cantilever offre une plate-forme permettant de mesurer les fonctions de contraction d&#39;une gamme de types de cellules, y compris squelettique, cardiaque, et les cellules musculaires lisses, grâce à l&#39;évaluation de la contraction induite par le substrat de pliage. Application des réseaux multiplexés en porte à faux fournit les moyens pour développer des protocoles modérée à forte capacité d&#39;évaluation de l&#39;efficacité des médicaments et de la toxicité, le phénotype de la maladie et de progression, ainsi que les interactions neuromusculaires et autre cellule-cellule. Ce manuscrit fournit les détails de fabrication de tableaux en porte à faux fiables à cet effet, et les méthodes requises pour mener des cellules de culture sur ces surfaces. Une description plus détaillée est fournie sur les mesures nécessaires pour effectuer anal fonctionnelleyse de types de cellules contractiles maintenu sur de tels réseaux à l&#39;aide d&#39;un laser selon l&#39;invention et d&#39;un système photo-détecteur. Les données représentatives présente les points saillants de la précision et de la nature reproductible de l&#39;analyse de la fonction contractile possible d&#39;utiliser ce système, ainsi que le large éventail d&#39;études à laquelle cette technologie peut être appliquée. L&#39;adoption généralisée de succès de ce système pourrait fournir aux enquêteurs les moyens d&#39;effectuer des études fonctionnelles, à faible coût rapides in vitro, conduisant à des prévisions plus précises de la performance des tissus, le développement de la maladie et la réponse au traitement thérapeutique.

Culture réussie des cellules contractiles sur des consoles est une procédure relativement simple, en utilisant des techniques classiques de culture cellulaire (figure 5). Le pourcentage de consoles supportant les cellules contractants varie en fonction du type de cellule en cours d'examen et la technique de culture spécifique utilisé. En utilisant des cellules embryonnaires primaires dérivées de membres postérieurs chez le rat, l'activité contractile a été détecté sur 12% des cantilevers étudiés (n = 4)...

Ce protocole décrit l&#39;utilisation de leviers de silicium micro-échelle que les surfaces souples de culture pour mesurer la contractilité des cellules musculaires in vitro. Contraction cellulaire provoque une flexion en porte à faux, qui peut être mesuré, enregistré et converti en lectures de force, en fournissant un système non invasif pour la mesure et s&#39;adaptent fonction contractile in vitro.

L'utilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

L’objectif de l’expérience suivante est de mesurer l’activité contractile des fibres musculaires cultivées en réponse à une stimulation dans un environnement in vitro contrôlé. Ceci est réalisé en plaquant des cellules musculaires dissociées sur des cantilevers en silicium à l’échelle microscopique, et en induisant la fusion de ces cellules mononucléées pour former des fibres appelées myotubes. Ces puces en porte-à-faux soutenant des cellules musculaires différenciées sont ensuite transférées à un microscope électrophysiologique modifié pour soutenir un laser et un photodétecteur utilisés pour mesurer la déviation en porte-à-faux en réponse à la contraction musculaire après la mise en place de la puce dans la plate-forme.Le laser est positionné de manière à se concentrer sur l’extrémité du cantilever et le photodétecteur est également aligné de manière à capter le faisceau dévié. On obtient des résultats qui montrent le degré de déviation du cantilever, qui est causée par la contraction musculaire en réponse à un traitement électrique ou chimique, fournissant une mesure directe du profil de contraction des cellules ensemencées en temps réel. En fin de compte, le déplacement en port

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Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour mesurer la rigidité cellulaire. Le principe général de cette approche consiste à mesurer déformation de la membrane en réponse à bien défini pression négative appliquée par le biais d'une micropipette à la surface cellulaire. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier les propriétés biomécaniques du substrat-jointes cellules.

Aspiration par micropipette des cellules au substrat joints pour estimer la rigidité cellulaire

Cette vidéo décrit la mesure de la contraction des cellules musculaires lisses aortiques (SMC) à l’aide de la détection d’impédance électrocellulaire-substrat, ou ECIS. ECIS mesure la locomotion des cellules et constitue une méthode fiable pour mesurer les contractions.

Mesure de la contraction de la SMC in vitro : une méthode non invasive pour évaluer la contraction des cellules musculaires lisses à l’aide de la détection d’impédance cellule-substrat électrique

Un nouveau protocole d’imagerie a été développé à l’aide d’un actionneur mécanique motorisé personnalisé pour permettre la mesure des réponses en temps réel à la déformation mécanique dans les cellules vivantes. Pertinent pour la mécanobiologie, le système peut appliquer des contraintes allant jusqu’à 20 % tout en permettant une imagerie en temps quasi réel avec la microscopie confocale ou à force atomique.

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Ici, nous décrivons le développement et l’application d’un test de contraction de gel pour évaluer la fonction contractile dans les cellules mésenchymateuses qui ont subi une transition épithéliale-mésenchymateuse.

Développement d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer contractile Fonction mésenchymateuses Les cellules de transition épithéliale-mésenchymateuse A subi

Les forces mécaniques sont importantes pour contrôler la migration cellulaire. Ce protocole démontre l'utilisation d'hydrogels élastiques qui peuvent être déformés à l'aide d'une micropipette en verre et d'un micromanipulateur pour stimuler les cellules avec un gradient de rigidité local pour provoquer des changements dans la structure cellulaire et la migration.

Exemple de Durotaxis à cellule unique pour évaluer le contrôle mécanique du mouvement cellulaire et les événements de signalisation connexes

Ce protocole vise à décrire étape par étape la technique d’extraction et d’évaluation de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés. Cette méthodologie permet la mesure et la modulation aiguë de la fonction myofilament à l’aide de petites biopsies congelées qui peuvent être recueillies à différents endroits cardiaques, des souris aux hommes.

Évaluation in vitro de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés

Présenté ici est un protocole pour évaluer les propriétés contractiles des myofibrils musculaires striés avec la résolution nano-Newton. Le protocole utilise une configuration avec une sonde de force optique basée sur l’interférométrie. Cette configuration génère des données avec un rapport signal/bruit élevé et permet d’évaluer la cinétique contractile des myofibrils.

Isoler les myofibrils des biopsies des muscles squelettiques et déterminer la fonction contractile avec un transducteur de force de résolution nano-newton

Cet article décrit une méthode basée sur la culture d’explants pour l’isolement et la culture de cellules musculaires lisses aortiques humaines primaires spécifiques au patient et de fibroblastes dermiques. En outre, une nouvelle méthode est présentée pour mesurer la contraction cellulaire et l’analyse ultérieure, qui peut être utilisée pour étudier les différences spécifiques au patient dans ces cellules.

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Ce travail présente un protocole flexible pour l’utilisation de la technologie FLECS (élastomère contractable surfaces élastomères marquées par fluorescence) au format micropuit pour une quantification simplifiée et sans intervention des forces contractiles unicellulaires basées sur des déplacements visualisés de micromotifs de protéines fluorescentes.

Analyse simplifiée et à haut débit de la contractilité unicellulaire à l’aide d’élastomères à micromotifs

La fonction musculaire squelettique peut être évaluée en quantifiant la contractilité de fibres musculaires isolées, traditionnellement en utilisant des approches laborieuses à faible débit. Ici, nous décrivons une méthode optique à haut débit pour quantifier la contractilité des fibres musculaires incorporées dans l’hydrogel. Cette approche a des applications pour le dépistage de médicaments et le développement thérapeutique.

Mesures contractiles à haut débit de fibres musculaires de souris intactes incorporées dans un hydrogel à l’aide d’un système optique

Ici, nous présentons un dispositif novateur qui applique des formes d’onde de déformation isotropes et uniaxiales aux cellules tout en soutenant la culture sur des substrats à rigidité accordable et matrices protéiques personnalisables. Cette plateforme simple et économique permet aux chercheurs d’étudier comment les indices mécaniques régulent la fonction cellulaire, tant dans les études fondamentales que dans des contextes liés aux maladies.

Une plateforme novatrice pour l’étirement et l’imagerie cellulaire in vitro

Découvrez l'utilisation de micropoutres en silicium pour mesurer la contractilité musculaire in vitro. Cette méthode non invasive permet une analyse en temps réel de la fonction cellulaire et des applications en pharmacologie.

L'utilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction In Vitro

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